彭 鵬，解翠薇，王 軍，肖 杭

1南京衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校臨床一教研室，江蘇 南京 210038；2南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，江蘇 南京211166

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）的濫用已成為包括我國(guó)在內(nèi)的全球公共衛(wèi)生問題。METH濫用不僅造成機(jī)體多系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)亦對(duì)家庭及社會(huì)穩(wěn)定造成極大危害。腦損傷一直是METH濫用引起神經(jīng)損傷及精神障礙的不良后果。研究顯示，METH可作用于多巴胺單胺能神經(jīng)元，引起多巴胺大量釋放，產(chǎn)生興奮性毒性，導(dǎo)致該區(qū)域神經(jīng)元死亡，引發(fā)帕金森樣改變［1］；我們前期研究顯示，METH 暴露亦可引發(fā)阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）樣病理性蛋白β?amyloid（Aβ）、p?tau 的顯著上調(diào)［2］；此外，METH 暴露引發(fā)精神性疾病，如抑郁、焦慮等［3］。然而，在目前的多數(shù)報(bào)道中，METH的神經(jīng)毒性及其機(jī)制的研究往往集中于某種病理性改變或某種機(jī)制的探討，對(duì)METH 暴露引發(fā)的病理性改變?nèi)匀狈ο到y(tǒng)而全面的認(rèn)識(shí)?；诖?，借助于高通量的蛋白組學(xué)，本研究探討了原代神經(jīng)元METH 暴露后蛋白組及其相關(guān)功能信號(hào)的改變，旨在從整體方面闡述METH 暴露引起的神經(jīng)損傷，增強(qiáng)對(duì)METH 神經(jīng)毒性的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)。此外，在系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，對(duì)神經(jīng)突觸的表達(dá)、數(shù)量、聯(lián)系的研究，一方面闡述了METH 引起神經(jīng)元損傷的部分機(jī)制，另一方面也是對(duì)組學(xué)中神經(jīng)損傷結(jié)果的進(jìn)一步驗(yàn)證，從而為METH 濫用引起的神經(jīng)毒性提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

18 d SD 清潔級(jí)孕大鼠均購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021?0001。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，每12 h 晝夜明暗交替實(shí)驗(yàn)中原代細(xì)胞培養(yǎng)獲南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理號(hào)：IACUC?1902013）。

Easy nLC 色譜系統(tǒng)、Agilent 1260 infinity ⅡHPLC 系統(tǒng)、Q Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scien?tific 公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國(guó)），低溫高速離心機(jī)（5430R，Eppendorf 公司，德國(guó)），電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（BIO?RAD公司，美國(guó)），Multiskcan FC 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)），真空離心濃縮儀（LNG?T98，蘇州太倉(cāng)華美），超聲破碎儀（JY96?IIN，寧波新芝公司），MP Fastprep?24 勻漿儀（Fastprep?24 5G，MP 公司，美國(guó)），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)）；Pro?teome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific 公 司，美國(guó)），MASCOT 2.6（Matrix Science公司，美國(guó)），Per?seus 1.3（Max Planck Institute of Biochemistry in Mar?tinsried，德國(guó)），R version 3.0.3。

Neurobasal medium、B27、L?谷氨酰胺、甲酸（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)），DMEM/F12、胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)），Alexa Fluor?568（Life公司，美國(guó)），BSA、Tris（北京生工公司），木瓜蛋白酶、碘乙酰胺、NH3·H2O、NH4HCO3（Sigma Aldich 公司，美國(guó)），乙腈（Merck 公司，美國(guó)），BCA 定量試劑盒、SDS?PAGE 蛋白上樣緩沖液（杭州碧云天），甲基苯丙胺（北京中國(guó)食品藥品檢定研究院），Multiple Affinity Removal LC Column Human 14/Mouse 3（Ag?ilent公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng)

取孕18 d SD 大鼠的胎鼠腦皮質(zhì)，經(jīng)2.0%的木瓜酶消化，經(jīng)100 μm及40 μm的濾網(wǎng)過濾，離心后，加入5 mL 神經(jīng)元培養(yǎng)液，以5×105個(gè)/mL 的密度接種，每隔3 d進(jìn)行半量換液，待神經(jīng)元長(zhǎng)至8～10 d成熟后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 神經(jīng)元蛋白組學(xué)的測(cè)定

FASP 酶解：原代培養(yǎng)的神經(jīng)元與METH（900 μmol/L）處理24 h 后，提取蛋白并測(cè)濃度。各組樣品取150 μg 蛋白質(zhì)溶液，分別加入DTT 至終濃度為100 mmol/L，與樣本孵育后，加入200 μL UA buffer，混合離心，后加入IAA buffer，經(jīng)Trypsin 處理后，用C18 Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，280 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行肽段定量。

Easy nLC 色譜分離：每份樣品采用納升流速Easy nLC 系統(tǒng)進(jìn)行分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為80%）。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到分析柱分離，流速為300 nL/min。1.5 h 梯度：0～5 min，B 液6%；5～75 min，B 液線性梯度6%～38%；75～85 min，B 液線性梯度38%～100%；85～90 min，B液維持在100%。

質(zhì)譜鑒定：樣品經(jīng)色譜分離后用Q Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采集，每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），儀器條件設(shè)置如下：MS2 Activation Type 為HCD，Isolation window 為2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率35 000，Microscans 為1，二級(jí)Maximum IT 為45 ms，Normalized Collision Energy 為30 eV。

蛋白質(zhì)定性和定量分析：通過Proteome Discov?erer 2.1軟件內(nèi)置工具提交到MASCOT2.6 服務(wù)器進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索；通過Proteome Discoverer 2.1 將MAS?COT 服務(wù)器上形成的查庫(kù)文件（.dat 文件）傳回軟件，根據(jù)FDR<0.01 的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，獲得高度可信的定性結(jié)果；使用數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot_RattusNor?vegicus_36080_20180123，針對(duì)質(zhì)譜分析原始文件用軟件Mascot2.6和Proteome Discoverer2.1進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。根據(jù)上述定量定性分析結(jié)果，進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的分析。

1.2.3 蛋白免疫印跡分析

神經(jīng)元裂解提取蛋白后，通過BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，每個(gè)泳道加入蛋白40 μg后電泳及轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉，后與一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，通過ECL發(fā)光檢測(cè)成像。

1.2.4 免疫熒光分析

神經(jīng)元固定（4%的多聚甲醛），清洗，透化后加入10%山羊血清，37 ℃封閉60 min后，加入一抗，避光4 ℃過夜，后加入熒光標(biāo)記二抗及防熒光猝滅DAPI 復(fù)合染料，激光共聚焦顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)。每皿細(xì)胞隨機(jī)拍攝9個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理，使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組定量資料比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA）檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間兩兩比較選用Dunnett?t檢驗(yàn)，兩組定量數(shù)據(jù)比較用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖使用GraphPad Prism 7.0。

2 結(jié)果

2.1 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）分析

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一種體外同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)定性定量技術(shù)。為觀察METH 對(duì)原代神經(jīng)元蛋白質(zhì)的表達(dá)改變，通過METH（900 μmol/L）處理原代神經(jīng)元24 h，然后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行iTRAQ 分析。所鑒定蛋白按差異倍數(shù)和P值分布如圖1 所示，差異倍數(shù)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)量呈正態(tài)分布（圖1A），其中，METH 組與對(duì)照組比差異蛋白共51個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有40個(gè)，下調(diào)的有11個(gè)，METH作用表達(dá)上調(diào)的蛋白較下調(diào)蛋白多（圖1B）。

圖1 對(duì)照組與METH比較后，兩組樣本蛋白質(zhì)表達(dá)差異分布和火山圖Figure 1 Analysis of the protein expression distribution and volcanic map of the control and METH groups

2.2 GO功能注釋

用序列比對(duì)工具NCBI BLAST+（ncbi?blast?2.3.0+）將iTRAQ 分析得到的51 種差異蛋白與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，批量提取GO 注釋。通過In?terProScan 搜索EBI 數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)的功能信息注釋給目標(biāo)蛋白質(zhì)序列，運(yùn)行ANNEX以提高GO注釋準(zhǔn)確性。提取差異蛋白的GO Level2注釋并進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果顯示，METH 引起與細(xì)胞生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組分相關(guān)蛋白的改變。在細(xì)胞生物學(xué)過程方面，細(xì)胞組分和生物合成、生物調(diào)節(jié)、免疫功能、神經(jīng)代謝與發(fā)育、對(duì)外界作用的應(yīng)答等過程尤為明顯；在分子功能方面，主要涉及轉(zhuǎn)運(yùn)、催化、分子傳遞等活性及蛋白結(jié)合過程的改變；在細(xì)胞組分的改變中，涉及大分子蛋白、細(xì)胞膜、細(xì)胞器及突觸等相關(guān)蛋白的改變。

圖2 GO注釋結(jié)果的Level 2統(tǒng)計(jì)Figure 2 Level 2 Statistics of GO annotation results

2.3 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析是蛋白質(zhì)組學(xué)分析細(xì)胞功能改變的重要方法。該研究中，基于實(shí)驗(yàn)中51個(gè)差異蛋白，分析出19個(gè)蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的多個(gè)信號(hào)通路。在差異蛋白通路富集結(jié)果中，依據(jù)顯著性水平選取了10 個(gè)產(chǎn)生明顯改變的信號(hào)通路（圖3），其中與突觸相關(guān)的多個(gè)信號(hào)通路發(fā)生改變（紅框表示），提示METH 暴露對(duì)突觸的調(diào)節(jié)通路的改變。

圖3 KEGG通路富集Figure 3 KEGG pathway enrichment

2.4 METH暴露引起原代神經(jīng)元突觸表達(dá)的改變

突觸是評(píng)價(jià)神經(jīng)元生理功能的重要指標(biāo)，在腦學(xué)習(xí)記憶，情緒及精神作用方面極為重要?；谏鲜龅鞍捉M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，METH 暴露引起多種突觸功能的改變（GABA 能及谷氨酸能突觸，圖3紅框），以及細(xì)胞成分突觸及突觸部分的作用（圖2 紅框），我們驗(yàn)證了METH 作用后對(duì)突觸的影響，觀察了突觸前，突觸后及棘突標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。與蛋白組學(xué)中METH 影響突觸的結(jié)果一致，METH 作用于神經(jīng)元后引發(fā)棘突標(biāo)志性蛋白Drebrin 及突觸后標(biāo)志性蛋白PSD95表達(dá)的下調(diào)（圖4），與對(duì)照組比，具有顯著性差異（P<0.05）。此外，METH作用引起突觸前標(biāo)志物Synapsin 1 的上調(diào)，上述結(jié)果提示，METH 暴露引起突觸數(shù)量的改變，而對(duì)于突觸后存在明顯的損傷作用。

圖4 METH染毒對(duì)原代神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Synapse associated protein levels of METH treated primary neurons

2.5 METH對(duì)樹突、棘突表達(dá)及定位的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白組學(xué)中METH對(duì)突觸的作用及闡述METH 暴露引起的原代神經(jīng)元樹突、棘突的影響，我們借助免疫熒光法，利用抗F?actin 及Dre?brin抗體分別標(biāo)記神經(jīng)元的樹突及棘突。結(jié)果顯示（圖5），對(duì)照組中樹突與棘突存在大量的共定位，樹突上棘突數(shù)量豐富，而METH（900 μmol/L）作用神經(jīng)元24 h 后，棘突數(shù)量及熒光強(qiáng)度明顯下降，同時(shí)與樹突的共定位亦顯著降低，提示METH 暴露后可改變樹突、棘突結(jié)構(gòu)及數(shù)量的改變，證明METH對(duì)神經(jīng)元的毒性作用。

圖5 METH對(duì)原代神經(jīng)元F?actin表達(dá)水平變化及樹突脊數(shù)量的改變Figure 5 Effects of METH on the expression of F?actin and the number of dendritic spines in primary neurons

2.6 METH 對(duì)突觸前及突觸后標(biāo)志性蛋白表達(dá)及定位影響

在METH 引起棘突數(shù)量減少了基礎(chǔ)上，該研究進(jìn)一步觀察了突觸前神經(jīng)元與突觸后神經(jīng)元之間的作用。以突觸后密度蛋白（post synaptic density protein 95，PSD95）特異性標(biāo)記神經(jīng)元突觸后，同時(shí)以Synapsin 1 標(biāo)記突觸后，觀察METH 作用前后二者之間的相互作用。在METH 作用前，神經(jīng)元突觸前與突觸后相互作用良好，存在較多的共定位；但METH作用24 h后，PSD95與Synapsin 1的共定位明顯減少，且與Western blot 結(jié)果一致，METH 作用后PSD95 的數(shù)量減少，說明METH 作用后突觸后損傷嚴(yán)重（圖6）。

圖6 METH染毒原代神經(jīng)元24 h后突觸數(shù)量的改變Figure 6 Changes of synaptic number in primary neurons exposed to METH for 24 hours

3 討論

METH 作用的主要靶器官之一是腦，其濫用直接導(dǎo)致腦微環(huán)境的改變，引發(fā)腦功能異常，引起神經(jīng)退行性、抑郁焦慮行為學(xué)改變等多種神經(jīng)及精神性疾病的發(fā)生。因此，對(duì)METH 神經(jīng)毒性的深刻揭示可為METH 濫用的干預(yù)提供積極指導(dǎo)，并具有重要的理論意義。然而，目前對(duì)于METH 神經(jīng)毒性的研究多集中于對(duì)黑質(zhì)紋狀體區(qū)域單胺神經(jīng)元的毒性研究，此外，針對(duì)神經(jīng)炎性反應(yīng)如對(duì)小膠質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活等研究亦相對(duì)較多，如既往借助基因芯片，發(fā)現(xiàn)METH 作用后神經(jīng)元大量炎性因子釋放及通路激活，闡釋了炎性引起神經(jīng)元損傷中的作用［5］。盡管如此，對(duì)于METH 濫用導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用仍缺乏總體上的認(rèn)識(shí)。因此，本研究借助蛋白組學(xué)的方法，系統(tǒng)觀察了METH 作用神經(jīng)元后，總體蛋白的表達(dá)及多種關(guān)鍵信號(hào)途徑的改變，并基于神經(jīng)元蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)，從突觸損傷角度，剖析了METH 暴露引起神經(jīng)元突觸的損傷作用及部分機(jī)制，目前類似報(bào)道極少，具有較好的創(chuàng)新性及科學(xué)性。

本研究采用900 μmol/L METH 與神經(jīng)元作用，這一濃度的選擇與人體體液中檢測(cè)出的最大濃度接近（600 μmol/L）［6］，同時(shí)該濃度在既往研究METH毒性作用的多篇文章中應(yīng)用，具有穩(wěn)定的神經(jīng)毒性作用［5，7］，基于此，借助iTRAQ分析，鑒定出神經(jīng)元多種蛋白發(fā)生明顯改變，這些蛋白的改變涉及神經(jīng)元調(diào)節(jié)、代謝、免疫、增殖、發(fā)育等多種細(xì)胞生物功能的改變。這與Lee 等［4］報(bào)道的METH 引起T 細(xì)胞凋亡及鈍化，繼而影響免疫功能的報(bào)道一致。同時(shí)，在分子功能方面，本研究亦與METH 暴露影響細(xì)胞過程轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳遞、應(yīng)激應(yīng)答等活動(dòng)類似［8-9］。值得一提的是，METH暴露可能影響突觸的功能，尤其GABA能及谷氨酸能突觸通路受到METH暴露后的影響。研究顯示，谷氨酸能及GABA 能突觸在學(xué)習(xí)記憶的過程中發(fā)揮重要作用［10］，而谷氨酸能及GA?BA 能突觸功能異?；蚪Y(jié)構(gòu)改變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)及精神疾病的發(fā)生，如癲癇、焦慮、抑郁、阿爾茲海默癥［11-12］，對(duì)谷氨酸能突觸的靶向干預(yù)能明顯減輕學(xué)習(xí)記憶能力的下降［13］，而GABA能突觸在神經(jīng)發(fā)育障礙的病因中起著重要作用，包括GABA能神經(jīng)元的產(chǎn)生、遷移和存活［14］。作為一種突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合的關(guān)鍵蛋白，PSD95具有參與突觸連接的形成、維持突觸的可塑性、參與疼痛的調(diào)控等多種生物學(xué)功能。研究顯示，PSD95 的3′UTR 多態(tài)性與急性缺血性卒中相關(guān)［15］，而PSD95 的下調(diào)與缺失引發(fā)神經(jīng)元NMDA、AMPA 及GABAA受體表達(dá)，阻礙神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致多種神經(jīng)疾病，包括自閉和精神分裂［16］。而通過BDNF?TrkB?CREB上調(diào)PSD95后可明顯改善Aβ42引起的神經(jīng)元損傷［17］，PSD95 的上調(diào)亦可顯著改善慢性束縛應(yīng)激引發(fā)的小鼠抑郁樣改變，上述PSD95減少引起的病理性現(xiàn)象與本研究中METH暴露引起PSD95顯著下調(diào)的現(xiàn)象一致。METH暴露促進(jìn)突觸前大量囊泡及囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，近期有研究充分揭示了Synpasin 1與囊泡數(shù)量的關(guān)系，即Synpa?sin 1 的表達(dá)密切調(diào)控囊泡的數(shù)量［18］，提示METH 引起的Synpasin 1 高表達(dá)可能與METH 引起囊泡數(shù)量及調(diào)控改變相關(guān)。在棘突方面，METH 引起其表達(dá)與數(shù)量的明顯減少，同時(shí)引起突觸前與突觸后定位的顯著下降，提示突觸前與突觸后的聯(lián)系降低。

本研究從蛋白組角度系統(tǒng)闡述了METH暴露引起神經(jīng)元多種活動(dòng)及信號(hào)通路的改變，通過聚焦突觸改變，揭示突觸損傷、聯(lián)系減少是METH引起神經(jīng)元功能降低的重要原因，因此針對(duì)性保護(hù)突觸的損傷，上調(diào)PSD95 等關(guān)鍵突觸蛋白可能為METH 引起的神經(jīng)損傷及相關(guān)神經(jīng)性疾病提供治療策略，具有重要的干預(yù)意義。