馬廷政，曹平平，汪徐春，孫玉潔*

1南京醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學系，2江蘇省人類功能基因組學重點實驗室，江蘇 南京 211166

細胞表面膜受體與其配體相互作用參與調(diào)控細胞的增殖、生長、分化等多種生物學過程，并與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-4］。因此，研究膜受體與其胞外配體的相互作用及其動態(tài)變化有助于闡明細胞多種生理過程和病理過程的機制。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種經(jīng)典方法［5-6］，能夠精確檢測10 nm范圍內(nèi)蛋白間的直接相互作用［7-8］。FRET是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團轉(zhuǎn)移到另一種熒光基團的物理現(xiàn)象。前者稱為供體，后者稱為受體。利用熒光供體融合蛋白表達載體和熒光受體融合蛋白表達載體共轉(zhuǎn)染細胞，當目的蛋白間發(fā)生相互作用時，使熒光基團間的距離小于10 nm，熒光基團將通過偶極子耦合作用實現(xiàn)能量傳遞，供體熒光蛋白的能量可部分轉(zhuǎn)移到受體熒光蛋白，使受體被激發(fā)而發(fā)射熒光。在生物體內(nèi)，如兩個蛋白質(zhì)分子的距離在10 nm之內(nèi)，一般認為這兩個蛋白質(zhì)分子存在直接相互作用。因此，通過檢測供體和受體熒光強度的變化可觀察兩種目標蛋白在活細胞中的相互作用及變化。FRET 技術(shù)的標準實驗流程為，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析、FRET標記策略的選擇、熒光對的選擇、FRET 效率評估、儀器選擇，最后進行FRET 實驗的實施［9］。但是，應用FRET 技術(shù)研究膜受體與胞外配體的相互作用時存在較多限制因素，其中主要包括膜受體結(jié)構(gòu)對熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的影響、熒光標簽對膜受體的亞細胞定位及功能的影響、細胞切除成熟膜受體信號肽時標記在信號肽氨基端的熒光標簽會被一同切除等。LRP6 是WNT3A 的經(jīng)典共受體［10］，根據(jù)其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相互作用模型，WNT3A 蛋白與LRP6 的氨基端都是開放末端，能夠使用熒光蛋白進行標記，適用于FRET 技術(shù)檢測。本研究以LRP6 膜受體與WNT3A 相互作用為模型，針對上述限制因素，通過蛋白截短、調(diào)整熒光標簽和信號肽的相對位置及增添柔性鏈接肽等方法，有效提高了FRET 的檢測效率和準確性，為利用FRET技術(shù)研究膜受體與胞外配體相互作用提供了新的思路和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

FV1200 激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）；DMEM 細胞培養(yǎng)基（Invitrogen Life Tech?nologies 公司，美國）；Lipofectamine 3000 試劑盒（In?vitrogen Life Technologies 公司，美國）；胎牛血清（Gibco 公司，美國）；anti?GFP 抗體（Thermofisher 公司，美國）；3.5 cm 玻璃皿（上海WHB 生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（Sigma Chemical 公司，美國）；青霉素/鏈霉素（上海生工生物公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（AXYGEN 公司，美國）；PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人腎上皮細胞系293T 所用培養(yǎng)液為DMEM 培養(yǎng)基，并添加10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素。該細胞傳代比例為1∶4，在CO2濃度5%、溫度37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

將WNT3A 和LRP6 的蛋白編碼區(qū)（coding se?quence，CDS）序列分別克隆到pEYFP?C1 或pECFP?C1 載體中，構(gòu)建ECFP?LRP6 和EYFP?WNT3A 融合蛋白質(zhì)粒。SP?EYFP?WNT3A 質(zhì)粒是以pCDNA3.1為質(zhì)粒骨架，將EYFP熒光標簽插入WNT3A蛋白的信號肽和成熟蛋白之間。SP?ECFP?LRP6 質(zhì)粒是以pCDNA3.1 為質(zhì)粒骨架，將ECFP 熒光標簽插入LRP6蛋白的信號肽和成熟蛋白之間（由于FRET 檢測要求熒光標簽間距離在10 nm范圍內(nèi)。而LRP6成熟蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域為棍棒結(jié)構(gòu)，其長度＞20 nm，超出FRET實驗檢測范圍。因此，將LRP6成熟蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的P1P2 結(jié)構(gòu)域進行截短，保留LRP6 與WNT3A相互作用的P3P4結(jié)構(gòu)域。所有引物序列見表1。所有質(zhì)粒均經(jīng)測序確認（上海生工及安徽通用測序公司）。

表1 FRET實驗中使用的引物Table 1 Primers used in FRET assays

1.2.3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)對接與分析

在PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www1.rcsb.org/）中獲取LRP6（PDB ID：3S8Z）及WNT3A（PDB ID：7DRT）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件，下載pdb 格式的蛋白模型數(shù)據(jù)，用Pymol 軟件打開進行后續(xù)分析。將需要對接的兩個蛋白pdb 格式文件添加到Zdock 網(wǎng)站（https：//zdock.umassmed.edu/）中，經(jīng)對接后可下載蛋白復合物模型文件。在Pymol 軟件（https：//pymol.org/2/）中打開對接模型文件，分析觀察目的蛋白的氨基端與羧基端是否暴露，能否在不影響蛋白質(zhì)相互作用的前提下進行熒光標簽的標記。

1.2.4 FRET實驗

根據(jù)激光共聚焦顯微鏡（FV1200激光掃描共焦顯微鏡，奧林巴斯公司，日本）FRET 實驗手冊進行了FRET實驗的設(shè)計與實施。使用敏化熒光發(fā)射方法進行FRET 分析。FRET 實驗細胞接種在玻璃底培養(yǎng)皿（上海WHB 生物技術(shù)有限公司）。質(zhì)粒通過Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美國）以50%～70%細胞匯合率轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞24 h 后進行FRET 分析。根據(jù)實驗手冊調(diào)整相關(guān)的儀器配置，包括激光功率10%、HV 550 V、電壓放大倍數(shù)×1、背景補償0%、圖像采集速度2.0 μs/pixel，并使用1 024×1 024的圖像格式。ECFP 通道由440 nm 激光器激發(fā)，圖像采集使用濾波器（SMD510：480/20）。EYFP 通道由488 nm 激光器激發(fā)，圖像采集使用Mirror：565/50。獲取所有圖像后，使用FV10?ASW軟件（奧林巴斯公司，日本）中的敏化熒光發(fā)射窗口進行FRET效率及供受體距離的計算。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用FV10?ASW 4.0 軟件進行FRET 效率及供受體距離的統(tǒng)計學計算。采用Graphpad 8.0 軟件（https：//www.graphpad.com/）進行數(shù)據(jù)的處理和分析，定量結(jié)果表示為平均值±標準誤（）。

2 結(jié)果

2.1 LRP6與WNT3A蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

LRP6膜受體的胞外區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域組成，依次為P1P2 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：5GJE），可結(jié)合WNT1、WNT2、WNT6等配體；P3P4結(jié)構(gòu)域（PDB ID：3S8Z），可結(jié)合WNT3、WNT3A、DKK1 等配體；LA 結(jié)構(gòu)域（細胞膜錨定結(jié)構(gòu)域）。利用PDB 網(wǎng)站獲取蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并使用Zdock 數(shù)據(jù)庫進行蛋白對接模型預測顯示，LRP6 的P3P4 結(jié)構(gòu)域（PDB ID：3S8Z）與WNT3A（PDB ID：7DRT）的鉸鏈區(qū)結(jié)合（圖1A），并且LRP6 與WNT3A 的氨基端和羧基端都是處于蛋白質(zhì)外圍開放末端，能夠連接熒光標簽進行FRET實驗。LRP6胞外結(jié)構(gòu)域為棍棒狀結(jié)構(gòu)，全長＞20 nm，超出常規(guī)FRET技術(shù)10 nm檢測范圍。因此對LRP6胞外區(qū)進行了截短，將LRP6的P1P2結(jié)構(gòu)域截除，保留LRP6的P3P4結(jié)構(gòu)域（LRP6與WNT3A結(jié)合區(qū)域）與LA結(jié)構(gòu)域。

2.2 FRET熒光融合蛋白的構(gòu)建與優(yōu)化

使用經(jīng)典FRET熒光對ECFP與EYFP作為熒光供受體，分別融合在LRP6 或者WNT3A 蛋白的N 端（圖1B）。當兩個目的蛋白不存在直接相互作用時，使用440 nm 激發(fā)光激發(fā)ECFP 熒光標簽時不發(fā)生FRET，只能使ECFP發(fā)出自身476 nm熒光，EYFP不發(fā)光；而當2 個目的蛋白存在直接相互作用時，如LRP6 與WNT3A 相互作用，ECFP 與EYFP 之間的距離≤10 nm而發(fā)生FRET現(xiàn)象，即440 nm激發(fā)光激發(fā)ECFP 后，通過FRET 可檢測到EYFP 熒光標簽發(fā)出的527 nm峰熒光（圖1A）。

圖1 LRP6與WNT3A蛋白相互作用的FRET模式圖Figure 1 A diagram FRET pattern of LRP6 and WNT3A interaction

依據(jù)PDB與Zdock網(wǎng)站對WNT3A與LRP6的蛋白三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，將構(gòu)建FRET 熒光融合蛋白熒光標簽ECFP及EYFP熒光標簽分別融合在LRP6或者WNT3A的氨基端（圖2A，上圖），利用融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后進行激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)LRP6 細胞膜定位不清晰（圖2B，上圖）。但是，使用pCDNA3.1 作為載體，將ECFP 熒光標簽融合在LRP6 蛋白的信號肽與成熟蛋白之間，并使用柔性連接肽進行連接可減少對成熟蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響（圖2A，下圖）。轉(zhuǎn)染293T 細胞24 h 后進行激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，LRP6細胞膜定位較為明顯（圖2B，下圖白色箭頭指示膜定位）。

圖2 FRET熒光融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建Figure 2 Construction of FRET fluorescent fusion protein

2.3 FRET 技術(shù)檢測活細胞中LRP6 膜受體與WNT3A的相互作用

使用SP?ECFP?LRP6 及SP?EYFP?WNT3A 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，24 h 后進行FRET 實驗并計算FRET效率及FRET距離（圖3）。LRP6?ECFP通道顯示LRP6 膜定位較為明顯；WNT3A?EYFP 通道顯示W(wǎng)NT3A 與LRP6 相互作用后細胞膜定位也較為顯著；經(jīng)背景校正計算后的FRET（校正）通道顯示在細胞膜上LRP6 與WNT3A 有FRET 現(xiàn)象發(fā)生；敏化熒光發(fā)射FRET計算得到FRET效率圖像（FRET Ef?ficiency）及供受體距離圖像（D?A Distance）。紅色箭頭所指細胞膜區(qū)域LRP6 及WNT3A 細胞膜定位較為明顯。對細胞膜區(qū)域發(fā)生FRET 現(xiàn)象的細胞（n=25）進行FRET 效率及距離統(tǒng)計分析，LRP6 與WNT3A平均FRET效率為26.51%，平均供受體距離為7.17 nm，處于FRET 效率（8%～95%）及供受體距離（3～8 nm）的有效區(qū)域。該結(jié)果顯示，通過FRET優(yōu)化策略，在細胞膜上定量檢測到LRP6 膜受體與WNT3A的相互作用。

圖3 FRET技術(shù)檢測WNT3A與LRP6蛋白間的相互作用Figure 3 The interaction between WNT3A and LRP6 protein detected by FRET assays

3 討論

FRET 技術(shù)是研究活細胞中蛋白質(zhì)相互作用及動態(tài)變化的有效手段，為闡明細胞生理過程和病理過程的機制提供了重要幫助。然而，F(xiàn)RET 技術(shù)用于檢測膜受體與胞外配體相互作用及動態(tài)變化時，存在諸多限制因素。首先，經(jīng)典FRET 技術(shù)檢測距離要求FRET熒光對的距離在10 nm以內(nèi)。但是，部分膜受體家族成員的胞外段較長，當受體與其配體在三維結(jié)構(gòu)空間上發(fā)生相互作用時，胞外端和配體熒光對的距離大于10 nm（如LRP6 及其配體WNT3A［11］、TNFRSF6B 及其配體TNFSF14［12］等），超出FRET 檢測范圍，因而不能利用FRET 技術(shù)有效檢測這一類膜受體和配體間的相互作用。本文針對這一制約因素，以經(jīng)典的LRP6與其配體WNT3A相互作用模型為基礎(chǔ)，提供了一個可能的解決策略。LRP6胞外域全長約為25 nm，當LRP6與WNT3A相互作用時，LRP6 的氨基端與WNT3A 之間的距離約為15 nm。本研究依據(jù)LRP6 蛋白三級結(jié)構(gòu)特征，即其胞外域結(jié)構(gòu)為串珠狀具有柔性［13］這一特點，將LRP6 膜受體進行截短，截掉P1P2結(jié)構(gòu)域，保留其與WNT3A相互作用的P3P4 結(jié)構(gòu)域。由于結(jié)構(gòu)域之間為柔性連接，截短不影響膜受體與配體的相互作用，同時滿足了FRET 技術(shù)檢測要求。對膜蛋白進行截短時，首先要確定截短對膜蛋白的結(jié)構(gòu)與相互作用不會造成影響。該策略適合檢測細胞外有多個結(jié)構(gòu)域的膜受體（如：TNFRSF、LRP 等家族蛋白）與其配體的相互作用；且特別適用于檢測有明確相互作用但需要進一步在活細胞水平觀察其相互作用動態(tài)變化的配體和受體。

其次，膜受體與胞外配體的亞細胞定位由信號肽進行引導，且成熟蛋白的信號肽會被切除［14］，導致標記在信號肽氨基端的熒光標簽被一同切除。因此，信號肽位置的調(diào)整在膜受體與胞外配體相互作用的檢測中非常必要，不僅可避免熒光標簽被切割，也能夠顯著增強融合蛋白的膜定位信號。本文通過將信號肽重構(gòu)在熒光標簽的氨基末端，可避免熒光標簽的切除。該信號肽重構(gòu)策略普遍適用于FRET質(zhì)粒的構(gòu)建，可避免熒光標簽的丟失，增強信號肽的亞細胞定位功能。但是，不同膜受體的信號肽功能多樣［15］，信號肽重構(gòu)對于不同膜受體家族的亞細胞定位作用仍需進一步研究。

最后，熒光標簽對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能具有一定干擾效應，可影響膜受體與胞外配體的亞細胞定位以及蛋白間相互作用。柔性連接肽在抗體、標簽融合蛋白純化等領(lǐng)域已被廣泛應用［14］，用于減弱融合蛋白內(nèi)不同結(jié)構(gòu)域之間的相互影響。與柔性連接肽相比，剛性連接肽可顯著降低FRET效率，并且FRET 效率隨著剛性連接肽長度的增加而降低［16］。并且，柔性連接肽已應用于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）實驗，用來銜接熒光標簽與目的蛋白，可減弱熒光標簽對融合蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響［17-18］?；谝陨涎芯浚疚牟捎萌嵝赃B接肽來銜接信號肽、熒光標簽及成熟蛋白，以降低熒光標簽對FRET 體系的影響。柔性連接肽策略同樣適用于其他FRET熒光質(zhì)粒的構(gòu)建，但也有其局限性，與剛性連接肽相比，不能有效分隔融合蛋白的不同結(jié)構(gòu)域，因此不適用于胞外配體與多結(jié)構(gòu)域膜受體相互作用位點的分析。

綜上所述，本文以LRP6 膜蛋白與WNT3A 相互作用為模型，針對FRET 技術(shù)在研究膜受體與胞外配體相互作用中的限制因素，建立了有效的改進策略，包括膜受體截短、信號肽的改造及柔性連接肽的使用，為充分利用FRET 技術(shù)在活細胞水平研究膜受體與胞外配體相互作用的動態(tài)變化提供了新的思路和實驗方案。