林慧，葛茂旭

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對(duì)各類(lèi)損傷因素(如酗酒、自身免疫反應(yīng)、病毒感染和膽汁淤積性等)的病理性修復(fù)反應(yīng)，持續(xù)的肝損傷使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝臟中彌漫性過(guò)度沉積與異常分布，進(jìn)而導(dǎo)致纖維性瘢痕形成[1-3]。若不積極干預(yù)治療，肝臟結(jié)構(gòu)被纖維瘢痕持續(xù)破壞，導(dǎo)致肝臟正常功能失調(diào)，將進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至是肝衰竭或者原發(fā)性肝癌[4-5]。肝纖維化的過(guò)程是可逆的，即使在肝硬化晚期進(jìn)行干預(yù)也可以改善患者預(yù)后[6]；但目前該病尚缺乏有效的治療手段[7]。而中醫(yī)藥因其辨證論治和整體觀念的特點(diǎn)，在抗肝纖維化方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)方劑的探索可能為肝纖維化治療提供新的思路[8]。

幾千年來(lái)，許多中醫(yī)方劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療肝纖維化[9-10]。調(diào)神攻堅(jiān)湯方出自《千家妙方》，方以柴胡為主藥，疏肝理氣，條達(dá)郁滯；配以黃芩泄肝火，抑少陽(yáng)；蘇子、陳皮、全瓜蔞行氣化痰，開(kāi)結(jié)消痞；石膏、夏枯草清熱瀉火；川椒止痛散結(jié)；白芍、甘草柔肝斂陰，緩急和絡(luò)；王不留行破血逐瘀、削堅(jiān)消積；牡蠣成以軟化堅(jiān)結(jié)；黨參、大棗益氣扶正，健脾助運(yùn)。全方共奏疏肝、泄肝、柔肝、養(yǎng)肝、調(diào)肝、扶正抑木之效，最終達(dá)到疏肝理氣，攻堅(jiān)破瘀的功效。此方劑傳統(tǒng)用來(lái)治療乳腺癌，考慮到乳腺癌與肝纖維化等病均有淤節(jié)等癥候，我們猜測(cè)調(diào)神攻堅(jiān)湯有治療肝纖維化的作用。

由于中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜性，單純依靠傳統(tǒng)的藥理學(xué)評(píng)價(jià)，難以確定中藥復(fù)方的作用機(jī)制[11]。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析為揭示中藥方劑的復(fù)雜作用機(jī)制提供了新的方法[12-13]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗(yàn)證了調(diào)神攻堅(jiān)湯有治療肝纖維化的作用，篩選調(diào)神攻堅(jiān)湯對(duì)抗肝纖維化作用的有效成分、作用靶點(diǎn)、通路，對(duì)其抗肝纖維化的可能作用機(jī)制進(jìn)行探索和闡釋?zhuān)瑸楹罄m(xù)進(jìn)一步開(kāi)展調(diào)神攻堅(jiān)湯治療肝纖維化的相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(https://www.tcmsp-e.com)；BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)；Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)； Cytoscape 3.7.2軟件;STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)；Metascape網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)(metascape.org/gp/index)；KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/)。

1.2 方法

1.2.1 篩選調(diào)神攻堅(jiān)湯有效成分和作用靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-likeness，DL)≥0.18和細(xì)胞滲透性(Caco-2)≥0.4作為檢索條件進(jìn)行篩選，對(duì)于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)靶點(diǎn)的活性成分使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，最終獲得調(diào)神攻堅(jiān)湯(柴胡、黃芩、蘇子、陳皮、全瓜蔞、石膏、夏枯草、川椒、白芍、甘草、王不留行、牡蠣、黨參、大棗)所有符合條件的有效活性成分和可能作用靶點(diǎn)[14-16]。

1.2.2 獲取肝纖維化的靶點(diǎn)及調(diào)神攻堅(jiān)湯抗纖維化的作用靶點(diǎn) 以“l(fā)iver fibrosis”“hepatic fibrosis”作為關(guān)鍵詞，通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果合并、刪除重復(fù)項(xiàng)后得到肝纖維化治療靶點(diǎn)[17]。

1.2.3 構(gòu)建調(diào)神攻堅(jiān)湯可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖 使用R語(yǔ)言篩選調(diào)神攻堅(jiān)湯與肝纖維化的共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖；利用 Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物-有效活性成分-疾病靶點(diǎn)”可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖[18]。

1.2.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)及篩選核心蛋白 將上述共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI；利用 Cytoscape 軟件中的Cytohubba插件通過(guò)MCC算法篩選核心蛋白，并提取相關(guān)網(wǎng)絡(luò)[19]。

1.2.5 GO生物過(guò)程富集分析、KEGG代謝通路富集分析 利用Metascape分析平臺(tái)對(duì)上述共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene Ontology)以及 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。將分析結(jié)果導(dǎo)入 R 語(yǔ)言，繪制GO富集分析二級(jí)分類(lèi)柱狀圖，KEGG富集分析氣泡圖。

1.2.6 亞細(xì)胞分布 將“1.2.4” 項(xiàng)下篩選得到的核心蛋白，利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得亞細(xì)胞分布情況，選取 confidence=5 的分布位置并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)神攻堅(jiān)湯有效成分及作用靶點(diǎn) 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18和Caco-2≥0.4作為檢索條件，篩選出調(diào)神攻堅(jiān)湯每味中草藥的有效活性成分和可能作用靶點(diǎn)；對(duì)于方劑中石膏、牡蠣兩味藥材利用 BATMAN-TCMS 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行活性成分分析以及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)(見(jiàn)表1)。上述數(shù)據(jù)刪除重復(fù)項(xiàng)后，獲得調(diào)神攻堅(jiān)湯有效活性成分166個(gè)，涉及相關(guān)作用靶點(diǎn)596個(gè)。

表1 調(diào)神攻堅(jiān)湯化合物成分和靶點(diǎn)情況

2.2 肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn) 將OMIM和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的肝纖維化治療靶點(diǎn)合并后刪除重復(fù)項(xiàng)，最終得到1 571個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.3 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)和構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將調(diào)神攻堅(jiān)湯可能作用靶點(diǎn)以及肝纖維化治療靶點(diǎn)，利用 R 語(yǔ)言取交集后，得到方劑-疾病共同靶點(diǎn)(即調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化作用靶點(diǎn))193個(gè)(見(jiàn)圖1)。將上述共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI(見(jiàn)圖2)。隨后，通過(guò)Cytoscape軟件中的Cytohubba插件通過(guò)MCC算法篩選出得分前20 的核心蛋白(包括ALB、INS、AKT1、TNF、IL-6等)并提取網(wǎng)絡(luò)，并以度(degree)值大小反映節(jié)點(diǎn)大小與顏色深淺，以Combined score 反映連線(xiàn)的粗細(xì)(見(jiàn)圖3)。

圖1 Venn網(wǎng)絡(luò)

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建調(diào)神攻堅(jiān)湯中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將調(diào)神攻堅(jiān)湯所含14味中藥、166個(gè)有效活性成分及596個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-有效活性成分-疾病靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖4)。其中，紫色節(jié)點(diǎn)代表每味中藥，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表有效活性成分，橙色節(jié)點(diǎn)代表可能作用靶點(diǎn)，連線(xiàn)代表彼此間的作用關(guān)系。

圖4 調(diào)神攻堅(jiān)湯中藥-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能、KEGG通路富集分析 使用Metascape網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)對(duì)之前獲得的193 個(gè)調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。首先，篩選P值降序排列前20個(gè)的各類(lèi)GO分析條目(包括細(xì)胞組分、生物過(guò)程、分子功能)并繪制二級(jí)分類(lèi)柱狀圖(見(jiàn)圖5)；圖中縱坐標(biāo)表示富集的數(shù)目，橫坐標(biāo)表示P值(見(jiàn)圖5)。隨后，篩選出 KEGG分析中P值最小的前20條通路繪制氣泡圖(見(jiàn)圖6)；圖中縱坐標(biāo)表示KEGG通路的名稱(chēng)，橫坐標(biāo)表示富集基因所占的比例，氣泡的大小表示富集的數(shù)目， 氣泡的顏色表示富集的P值。以上結(jié)果表明，調(diào)神攻堅(jiān)湯可能涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程，并且覆蓋HIF-1、Foxo、PPAR等多條肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路(見(jiàn)圖7)。

圖5 GO生物過(guò)程富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 信號(hào)通路圖

2.6 亞細(xì)胞分布情況 將193個(gè)調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化作用靶點(diǎn)通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索并獲取亞細(xì)胞分布情況，匯總后使用Cytoscape軟件構(gòu)建“亞細(xì)胞分布-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖8)。圖中藍(lán)色矩形節(jié)點(diǎn)亞細(xì)胞分布位置，黃色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，上述作用靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular,度值=11)、細(xì)胞核(nucleus，度值=11)、細(xì)胞膜(plasma membrane，度值=8)、細(xì)胞基質(zhì)(cytosol，度值=7)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，度值=5)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)。

圖8 亞細(xì)胞分布

3 討論

調(diào)神攻堅(jiān)湯以柴胡為主藥，配以黃芩、蘇子、黨參、夏枯草、王不留行、牡蠣、瓜蔞、石膏、陳皮、白芍、川椒、甘草、大棗共計(jì)14味中藥。全方共奏疏肝、泄肝、柔肝、養(yǎng)肝、調(diào)肝、扶正抑木之效，最終達(dá)到疏肝理氣，攻堅(jiān)破瘀的功效。分析其配方組成及功效，我們初步猜測(cè)調(diào)神攻堅(jiān)湯有抗肝纖維化的作用，因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索此方劑治療肝纖維化的潛在作用機(jī)制。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出調(diào)神攻堅(jiān)湯166個(gè)有效活性成分和596個(gè)可能作用靶點(diǎn)；與1 571個(gè)肝纖維化治療靶點(diǎn)整合后，獲得193個(gè)調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化作用靶點(diǎn)?；谝陨蠑?shù)據(jù)構(gòu)建“中藥-有效活性成分-疾病靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，單靶點(diǎn)可被多種組分調(diào)控，單組分亦可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了中藥方劑的復(fù)雜性和整體性。

隨后，通過(guò) STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 PPI 后，篩選得到CTNNB1、 田TLR4、TNF、IL-6、STAT3等20個(gè)核心蛋白，即為調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。CTNNB1基因編碼的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是黏附連接(adherens junctions,AJs)復(fù)合物的主要成分，并參與Wnt介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)以及黏附過(guò)程。β-catenin信號(hào)的異常改變可激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)，而HSCs 則是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)；因此，β-catenin 是抗肝纖維化治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TLR4、TNF、STAT3、IL-6、CXCL8 是炎癥相關(guān)的重要基因，而在肝纖維化進(jìn)程中伴隨著大量炎癥介質(zhì)的分泌以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。經(jīng)典的 TNF 和IL-6-STAT3可以調(diào)控活化HSCs 的增殖、MMP2/9 的分泌以及ECM(如 I 型膠原、纖連蛋白)的生成。此外，TNF還可以抑制caspase-3活性,減少 HSCs 的凋亡，從而影響肝纖維化的轉(zhuǎn)歸。另有研究表明，與野生型小鼠相比，TLR4突變小鼠不易出現(xiàn)肝纖維化，但上述兩組小鼠血清LPS(TLR4 的配體)水平卻并無(wú)差異[20]。在酒精以及NASH誘導(dǎo)的肝纖維化中，TLR4主要通過(guò)Kupffer細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子(如TNF、CCL2和CXCL8等)發(fā)揮作用[21-22]。

GO功能分析表明，調(diào)神攻堅(jiān)湯可能通過(guò)影響細(xì)胞壞死和凋亡、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等方面，抑制HSC的活化和增殖,進(jìn)而達(dá)到干預(yù)肝纖維化的作用。KEGG通路分析表明，主要涉及HIF-1 signaling pathway、Foxo signaling pathway、Focal adhesion、PPAR signaling pathway等信號(hào)通路產(chǎn)生抗肝纖維化的作用。缺氧是肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的常見(jiàn)特征，HIF-1是介導(dǎo)細(xì)胞參與缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過(guò)介導(dǎo)慢性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，上調(diào)一系列與肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)并激活HSC，加速肝纖維化發(fā)展。Foxo作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與Wnt/β-catenin、EZH2、PI3K/Akt等信號(hào)通路相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡、物質(zhì)代謝，還可促進(jìn)心肌組織產(chǎn)生ROS，減少細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激的損傷[23-25]。Focal adhesion可將細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行連接，引起細(xì)胞分化，遷移、擴(kuò)散和凋亡，進(jìn)而造成肝纖維化。PPAR可保持HSC靜止，防止其活化或者增殖，是治療纖維化的重要信號(hào)通路。此外，調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究為調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化的藥理學(xué)分子研究提供了有用指導(dǎo)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)調(diào)神攻堅(jiān)湯治療肝纖維化的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了探析，并初步揭示了其抗肝纖維化的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜藥理作用機(jī)制。結(jié)果顯示此方劑可能通過(guò)HIF-1 signaling pathway、Foxo signaling pathway、Focal adhesion、PPAR signaling pathway等信號(hào)通路影響細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等方面，從而發(fā)揮治療肝纖維化的作用，拓寬了調(diào)神攻堅(jiān)湯在治療肝纖維化方面的視角，為進(jìn)一步開(kāi)展調(diào)神攻堅(jiān)湯抗肝纖維化相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。