徐 俊，戚 璐，許 杰，李 碩，程良斌

湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061

肝纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生壞死或炎癥刺激時肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程。慢性肝病大部分伴有肝纖維化，其中25%～40%最終發(fā)展為肝硬化乃至肝癌［1］，導(dǎo)致肝功能衰竭，嚴(yán)重危害患者生命健康?？估w軟肝顆粒為湖北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，是我院張赤志教授在已故名老中醫(yī)呂繼端教授臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)上創(chuàng)立，由丹參、鱉甲、莪術(shù)、牡蠣、山楂、海藻、地骷髏組成，自20世紀(jì)80年代開始用于臨床，至今30余年。前期研究表明［2-7］，抗纖軟肝顆粒具有抗炎保肝、抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）增殖與活化、拮抗細(xì)胞因子、抗氧化應(yīng)激、降低細(xì)胞外基質(zhì)的累積和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，立足腸道微環(huán)境，觀察抗纖軟肝顆粒對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠腸道黏膜通透性及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠35只，購自湖北省動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。

1.2 藥物抗纖軟肝顆粒由湖北省中醫(yī)院藥劑科提供（批準(zhǔn)文號：Z20113145）。

1.3 試劑抗Claudin-1兔多克隆抗體（Ab15098，Abcam公司）；抗ZO-1兔多克隆抗體（21773-1-AP）、抗Occludin兔多克隆抗體（13409-1-AP）均由武漢三鷹生物技術(shù)公司提供；蘇木素（AS1041）、伊紅染液（AS1094）、鐵蘇木素液（AS1042）、麗春紅染液（AS1022）均購自美國ASPEN公司；Trizol（15596-026）購自Ambion公司；引物合成由擎科生物公司完成，引物序列Occludin（83bp）Forward：5'-ATAGCCATTGTCCTGGGGTTCAT-3'，Reverse：5'-TCCATCTTTCTTCGGGTTTTCAC-3'；Claudin-1（109bp）Forward：5'-GAGACTACCACTGTCCCC-3'，Reverse：5'-AAAGAATCCTCAAAACCA-3'；ZO-1（101bp）Forward：5'-TGATCGTCTGTCCTACCTGTC-3'，Reverse：5'-CGCCTTCTGTATCTGTGTCTT-3'；GAPDH（253bp）Forward：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，Reverse：5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.4 儀器Milli-Q Advantage A10型純水超純水制備系統(tǒng)（Millipore公司）；CKX53型倒置生物顯微鏡（Olympus公司）；5418/5418R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）；MuLtiskan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（上海博訊公司）；Quant Studio 6型PCR儀（Applied Biosystems公司）。

1.5 實驗動物造模與分組35只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)選取10只作為正常組，余下25只小鼠依照參考文獻(xiàn)［8］方法，每日按2 mL/kg（體質(zhì)量）皮下注射40%CCl4橄欖油溶液，每2天1次，持續(xù)8周，從25只模型組小鼠中篩選出20只成功模型，隨機(jī)分為模型組與治療組各10只。

1.6 動物干預(yù)方式與取材根據(jù)人與小鼠體表面積換算比進(jìn)行計算［9］，治療組抗纖軟肝顆粒給藥濃度為3.9 g/kg（體質(zhì)量）；模型組灌胃等量生理鹽水，每日1次，治療時間為8周。用頸椎脫臼法處死全部小鼠，打開腹腔，采集肝左葉同一區(qū)域的肝組織樣本，用4%多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)檢測。同時采集小鼠升結(jié)腸部分結(jié)腸組織，生理鹽水洗凈后放入無菌EP管，用于RT-qPCR檢測。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 肝組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法 將肝組織脫水，石蠟包埋，切片，切片脫蠟，用蘇木精與伊紅試劑染色，風(fēng)干，封片，鏡下觀察。

1.7.2 肝組織Masson氏三色染色法 將肝組織切片脫蠟，蘇木素試劑染核，流水沖洗，Masson麗春紅染色，冰醋酸分化，1%磷鉬酸水溶液分化，冰醋酸分化稍許，苯胺藍(lán)染色，常規(guī)脫水，再封片，鏡下觀察。

1.7.3 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）取結(jié)腸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟，行免疫組化染色：一抗40℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，隨后蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水后封片拍照，陽性反應(yīng)為細(xì)胞胞漿中黃褐色沉淀。每張切片隨機(jī)選取4個高倍視野應(yīng)用Image J軟件和GraphPad軟件對陽性區(qū)域進(jìn)行定量分析。

1.7.4 實時定量PCR法 100 mg組織樣品用液氮充分研磨，加入1 mL Trizol，混勻，室溫放置5 min充分裂解，加200μL氯仿，混勻使水相和有機(jī)相充分接觸，4℃下離心半徑13.5 cm，14 000 r/min離心15 min，吸取上清，加等體積異丙醇，混勻室溫靜置10 min，放-20℃冰箱過夜，次日4℃離心半徑13.5 cm，14 000 r/min離心10 min，去上清，收集RNA沉淀，75°乙醇溶液洗滌2次，超凈工作臺風(fēng)干沉淀，根據(jù)沉淀量加入DEPC水，溶解RNA。然后進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，鋪96孔板，定量PCR，用相對定量2-△△t法分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色正常組肝細(xì)胞形態(tài)完整，為規(guī)則圓形、橢圓形；模型組肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，肝細(xì)胞呈不規(guī)則形狀、點狀壞死，炎性浸潤嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)不全，匯管區(qū)、肝小葉周邊見藍(lán)色纖維索狀物；治療組脂肪變性較模型組明顯減輕，炎癥反應(yīng)減弱，肝損傷輕，肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理圖（HE×100）

2.2 Masson染色正常組肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉完整；模型組肝組織破壞，細(xì)胞脂肪變性，有點、灶狀局部壞死和膠原沉積，肝索排列不均，假小葉形成；治療組與模型組比較，肝組織損傷程度有所改善，脂肪空泡明顯減少，纖維沉積程度減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織病理圖（Masson×100）

2.3 Occludin、Claudin-1及ZO-1表達(dá)與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)降低（P＜0.05），治療組結(jié)腸Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)相較模型組上調(diào)（P＜0.05）。見圖3—4。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)（×400）

圖4 各小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin-1與ZO-1平均光密度

2.4 Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA表達(dá)模型組小鼠結(jié)腸Occludin、Claudin-1及ZO-1 mRNA表達(dá) 低 于 正 常 組（P＜0.05），治 療 組Occludin、Claudin-1、ZO-1 mRNA表達(dá)較模型組上調(diào)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin-1與ZO-1的mRNA表達(dá)

3 討論

研究表明［10-11］，腸道微環(huán)境是肝纖維化發(fā)病的機(jī)制之一，腸道菌群失調(diào)可引起腸道黏膜通透性增高，腸道細(xì)菌移位和腸源性內(nèi)毒素血癥，脂多糖及細(xì)菌相關(guān)代謝產(chǎn)物通過門靜脈進(jìn)入肝臟，引起肝細(xì)胞損傷、炎癥因子釋放、免疫功能紊亂和微循環(huán)障礙加重，從而加重肝纖維化。正常情況下，腸道具備完整的腸黏膜屏障系統(tǒng)，包括機(jī)械屏障、微生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障，能有效阻擋腸道內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)物向腸外組織移位［12］。腸上皮細(xì)胞及其緊密聯(lián)接是腸黏膜機(jī)械屏障的最重要的組成部分，其中緊密連接是極性上皮細(xì)胞頂端區(qū)的特異性膜區(qū)域，由多種跨膜蛋白和膜相關(guān)蛋白共同組成，主要包括Occludin、Claudin-1和ZO-1［13］。本研究中，經(jīng)CCl4誘導(dǎo)后的肝纖維化小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin-1和ZO-1表達(dá)低于正常組，經(jīng)抗纖軟肝顆粒治療8周后，相應(yīng)蛋白表達(dá)量增高，同時肝臟組織HE染色和Masson染色顯示小鼠肝纖維化程度較模型組減輕，表明小鼠結(jié)腸組織中Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的下調(diào)可能與肝纖維化病理學(xué)的改善具有相關(guān)性，抗纖軟肝顆粒對小鼠肝纖維化的防治作用可能與調(diào)控腸道Occludin、Claudin-1和ZO-1表達(dá)有關(guān)。