李占鴻，肖 雷，李卓然，宋子昂，謝佳芮，楊振興，朱 沛，李華春，廖德芳，楊 恒, 3

哺乳動物正呼腸孤病毒(Mammalian orthoreovirus, MRV)隸屬呼腸病毒科(Reoviridae)棘突呼腸病毒亞科(Spinareovirinae)，可感染包括人、豬、牛、羊、貓、犬、猴、水貂、小鼠與蝙蝠在內(nèi)的多種哺乳動物[1-2]。過去認(rèn)為MRV僅對嚙齒類動物具有較強(qiáng)的致病性，近年大量的研究顯示MRV在人與其它哺乳動物上均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致病性，可引起腹瀉、腸炎、肺炎或腦炎等癥狀[3-7]。在蝙蝠上多次分離到基因重配MRV變異毒株，提示該病毒可通過蝙蝠在不同動物之間進(jìn)行傳播[8-10]，進(jìn)而對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，是一種值得重視的人獸共患病病原。

MRV病毒粒子直徑約85 nm，呈二十面體對稱，基因組大小約23 kb，包含10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(double strand RAN, dsRNA)，分別為L1至L3基因節(jié)段(3.8～3.9 kb)、M1至M3基因節(jié)段(2.2～2.3 kb)、S1至S4基因節(jié)段(1.1～1.4 kb)[1-2]。MRV病毒粒子具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)：外層衣殼由M2、S1與S4節(jié)段編碼的μ1、σ1與σ3蛋白構(gòu)成；內(nèi)層衣殼由L1至L3基因節(jié)段編碼的λ3至λ1蛋白，M1與S2基因節(jié)段編碼的μ2蛋白與σ2蛋白等5種蛋白組成。μN(yùn)S、σ1S與σNS等3種非結(jié)構(gòu)蛋白由M3、S1(重疊基因)與S3節(jié)段編碼[1-2]。MRV的S1基因節(jié)段高度變異，編碼的α1蛋白可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，具有凝集紅細(xì)胞的特性，決定病毒的血清型。通過血清中和實(shí)驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)可將MRV分為MRV-1、MRV-2、MRV-3、MRV-4 4種血清型，其代表毒株分別為Lang-T1L(MRV-1)、Jones-T2J(MRV-2)、Dearing-T3D(MRV-3)與Ndelle-T4N(MRV-4)[1,11]。

我國已發(fā)現(xiàn)3種血清型MRV(MRV-1、MRV-2、MRV-3)的流行[7,12-13]，其中MRV-1型在我國南方與北方均有流行，可引起感染動物出現(xiàn)腹瀉癥狀。2011年河北省饒陽縣的水貂(Mustlavison)中暴發(fā)MRV-1型感染導(dǎo)致的病毒性腹瀉，病死率高達(dá)100%[7]；隨后在黑龍江省出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬，云南省發(fā)生腹瀉死亡的野生樹鼩(Tupaiabelangeri)中均分離出MRV-1型毒株[14-15]，表明我國流行的MRV-1型毒株可感染家養(yǎng)與野生動物，具有較強(qiáng)的致病性。在我國南方地區(qū)的短鼻果蝠(Cynopterussphinx)、鼠耳蝠(Myotisricketti)與普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)中分離出基因重配MRV-1型毒株[16-17]，進(jìn)一步提示MRV-1可通過蝙蝠在野生動物和家畜之間進(jìn)行擴(kuò)散。因此，掌握我國MRV-1的遺傳背景、致病性與流行病學(xué)特征在動物疫病防控與保障公共衛(wèi)生安全上具有重要的意義。

2017年本實(shí)驗(yàn)室在云南省師宗縣設(shè)立哨兵牛(Sentinel cattle)，定期采血進(jìn)行動物病毒的監(jiān)測與分離，從采集的動物血液樣本中，相繼分離出藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)、帕利亞姆病毒(Palyam virus, PALV)、動物流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus, EHDV)和MRV-1型病毒。本文對MRV-1型分離株的全基因組測序與序列分析，對當(dāng)?shù)嘏?、羊與豬中的MRV-1的流行情況進(jìn)行了初步調(diào)查，為進(jìn)行我國MRV毒株的遺傳多樣性分析、相應(yīng)診斷方法的建立及其致病性研究等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 幼倉鼠腎細(xì)胞(Baby hamster syrian kidney, BHK-21)保存于本實(shí)驗(yàn)。胎牛血清與MEM培養(yǎng)基購自美國Gbico公司；核酸提取試劑、高純度瓊脂糖、反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶S1、高保真Taq DNA聚合酶、一步法PCR試劑盒和DNA純化試劑盒均購自大連寶生物公司；DNA文庫構(gòu)建試劑盒TruSeq DNA Sample Prep Kit V2.0購自美國Illumina公司。

1.2 哨兵動物與血液樣本的采集 2017年5月，在云南省師宗縣五龍鄉(xiāng)(經(jīng)緯度：E103°59′38″，N24°36′41″，海拔 1 000 m)設(shè)置10頭1周歲且BTV與EHDV抗體及核酸檢測均為陰性的云南黃牛(Bostaurusdomesticus)，作為病毒監(jiān)測的哨兵動物。哨兵動物不使用任何疫苗與驅(qū)蟲藥物，飼養(yǎng)方式為自由放牧。在監(jiān)控期的5月至10月，由當(dāng)?shù)芈殬I(yè)獸醫(yī)每周從哨兵牛上分別采集全血、肝素鈉抗凝血與EDTA抗凝血樣品，保存于4 ℃ 冰盒，送至病毒檢測及分離實(shí)驗(yàn)室：云南省熱帶亞熱帶動物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 血液樣本中病毒的分離 取500 μL采集至哨兵牛的肝素鈉抗凝血，離心收集紅細(xì)胞(Red blood cells, RBCs)，以磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline, PBS)洗滌RBCs 1次。加入滅菌水裂解RBCs，離心取上清接種生長為單層的BHK-21細(xì)胞，盲傳3～5代進(jìn)行病毒分離。當(dāng)感染細(xì)胞出現(xiàn)規(guī)律的細(xì)胞病變(Cytopathic effect, CPE)后，離心收集細(xì)胞上清-80 ℃凍存，留待進(jìn)一步的鑒定。

1.4 分離物的RT-PCR鑒定 使用病毒核酸提取試劑盒進(jìn)行待鑒定樣品的核酸提取，于95 ℃變性3 min，立即冰浴。取4 μL變性核酸為模板，以針對BTV、EHDV、PALV和阿卡斑病毒(Akabane virus, AKAV)的特異性引物[18-20]按一步法RT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)液，進(jìn)行RT-PCR鑒定，反應(yīng)條件如下：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳膠回收，并進(jìn)行測序與序列分析。

1.5 病毒基因組dsRNA的提取與電泳檢測 將待鑒定病毒接種75 cm2細(xì)胞瓶中生長為單層的BHK-21細(xì)胞，待感染細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE時(shí)收集病變細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑說明書提取細(xì)胞總RNA；使用S1核糖核酸酶按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[21]降解宿主細(xì)胞RNA。以2%的高純度瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，觀察病毒基因組的電泳帶型特征。

1.6 病毒的電鏡觀察 取培養(yǎng)的病毒液，8 000 r/min離心10 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)入超速離心管中，以SW40轉(zhuǎn)頭，以40 000 r/min的轉(zhuǎn)速在Beckman超速離心機(jī)上離心3 h。將離心后的沉淀以適量TNE Buffer重懸，置于4 ℃過夜。次日將病毒液12 000 r/min離心5 min，取上清滴于銅網(wǎng)上，以2%磷鎢酸溶液(pH6.8)進(jìn)行負(fù)染，在透射電鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)。

1.7 病毒基因組cDNA的合成與PCR擴(kuò)增 取純化后病毒基因組dsRNA為模板，采用全長cDNA擴(kuò)增(Full-length amplification of cDNAs, FLAC)技術(shù)[21]進(jìn)行病毒基因組cDNA的合成。以合成的cDNA為模板，使用高保真DNA Taq酶擴(kuò)增病毒基因組，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸4 min，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，分析病毒基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。

1.8 病毒基因組的高通量測序 使用DNA純化試劑盒純化病毒基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Illumina公司的TruSeq DNA Sample Prep Kit DNA文庫構(gòu)建試劑盒進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建，進(jìn)一步在Illumina Novaseq 6000測序平臺上進(jìn)行高通量測序(High-throughput sequencing, HTS)。使用Trimmomatic軟件對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制與濾過處理，使用Edena(v3.131028)[22]與SOAPdenovo(v2.04)軟件[23]對濾過后的reads進(jìn)行組裝以獲取病毒基因組序列。

1.9 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 使用NCBI的ORF分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析病毒各基因編碼的蛋白。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載MRV毒株的序列，通過Mafft-win序列[24]比對軟件與本研究中獲取的病毒序列進(jìn)行比對，使用BioEdit計(jì)算核酸與氨基序列相似度(nt/aa)，采用MEGA X軟件[25]以鄰近法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇的模型為遺傳距離法(P-distance)，自舉檢驗(yàn)值(Bootstrap)取1 000。

1.10 血清中和試驗(yàn) 取2016至2017年在云南省師宗縣牛、羊與豬等家畜上采集的血清各40份，56 ℃處理30 min，進(jìn)行血清中和試驗(yàn)(Serum neutralization test, SNT)檢測MRV-1抗體，方法簡述如下：在BHK-21細(xì)胞上以Karber法[26]測定YNSZ/V207/2017毒株的TCID50，稀釋至100 TCID50備用。將1∶16倍的待檢血清稀釋加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50 μL/孔)，加入100 TICD50的病毒懸液(50 μL/孔)，充分混勻后于37 ℃作用2 h。以100 μL/孔的量加入BHK-21細(xì)胞懸液，將細(xì)胞板置于37 ℃培養(yǎng)7 d，逐日觀察CPE，并計(jì)算抗體效價(jià)，以抗體效價(jià)<1∶16判定為MRV感染陰性，抗體效價(jià)≥1∶16判定為MRV感染陽性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離與鑒定 2017年5月至10月，師宗縣設(shè)立的哨兵牛上共采集200份肝素鈉抗凝血，分別接種BHK-21細(xì)胞，共獲得8份可在BHK-21細(xì)胞上導(dǎo)致CPE的病毒分離物；經(jīng)RT-PCR與測序鑒定，其中PALV 3株、BTV與EHDV各2株(表1)；其中4號哨兵牛8月21日采集的血液樣本接種BHK-21細(xì)胞盲傳4代后，可致細(xì)胞出現(xiàn)“皺縮、聚集與脫落”的細(xì)胞病變(圖1)。提取病變細(xì)胞總RNA，進(jìn)行BTV、EHDV、AKAV與PALV鑒定的結(jié)果均為陰性，將待鑒定的病毒命名為YNSZ/V207/2017。

表1 2017年師宗縣哨兵牛血液中分離的病毒

A為YNSZ/V207/2017在BHK-21細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；B為正常BHK-21對照細(xì)胞

2.2 YNSZ/V207/2017毒株的基因組電泳與電鏡觀察結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，YNSZ/V207/2017病毒基因組為dsRNA，但在瓊脂糖凝膠上的遷移特征與本研究中分離的BTV、PALV及EHDV等存在明顯差異(圖2A)。電鏡下觀察可見YNSZ/V207/2017的病毒粒子直徑約70～80 nm，呈二十面體對稱的球形結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道的呼腸孤病毒科病毒粒子的外形特征類似(圖3)。

A：泳道1-4分別為BTV、EHDV、PALV與YNSZ/V207/2017毒株基因組dsRNA；B：泳道1為YNSZ/V207/2017毒株全基因組RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為 DL 5 000 DNA Marker

圖3 YNSZ/V207/2017電鏡觀察結(jié)果

2.3 YNSZ/V207/2017毒株的基因組RT-PCR擴(kuò)增與測序 采用FLAC技術(shù)[21]進(jìn)行YNSZ/V207/2017毒株基因組的RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示該毒株的基因組DNA電泳帶型與基因組dsRNA一致(圖2B)，表明成功完成了病毒的全基因組擴(kuò)增。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序。結(jié)果顯示，測序共計(jì)產(chǎn)生571 343 600條reads。數(shù)據(jù)過濾處理后得到361 940 200條高質(zhì)量的reads(Q>30)，進(jìn)一步裝配出10個(gè)序列重疊群(contigs)，每個(gè)堿基位點(diǎn)的測序深度在8 000至20 000之間，表明對YNSZ/V207/2017毒株的基因組進(jìn)行了深度測序。

2.4 YNSZ/V207/2017毒株為MRV成員 YNSZ/V207/2017的基因組序列分析顯示，病毒基因組全長為23 605 bp，10個(gè)基因節(jié)段的長度在1 196 bp至3 915 bp之間，G+C含量(mol%)在44.12%至47.89%之間，病毒基因組可編碼11種不同的蛋白，其氨基酸殘基數(shù)在120 aa至1 290 aa之間；非編碼區(qū)(Non-Coding Regions, NCR)占基因組的3.09%，各基因節(jié)段5′ 端NCR的長度在12 bp至32 bp之間，3′端NCR的長度在32 bp至80 bp之間，5′與3′端具有CUA……UCAUC的保守序列(表2)。BLAST 分析顯示YNSZ/V207/2017各基因節(jié)段與不同血清型MRV對應(yīng)基因節(jié)段的序列相似度最高，核苷酸(nt)序列相似度在93.6%至98.9%之間，編碼蛋白氨基酸(aa)序列相似度在98.6%至99.4%之間，表明待鑒定病毒為MRV。

表2 YNSZ/V207/2017毒株基因組特征

2.5 YNSZ/V207/2017毒株為MRV-1型 S1基因節(jié)段編碼的α1蛋白決定著MRV的血清型[11]。序列比對顯示YNSZ/V207/2017毒株的S1基因節(jié)段與MRV-1型毒株的序列相似度最高，核苷酸序列相似度在73.9%至98.5%之間，編碼α1蛋白的氨基酸序列相似度在77.7%至98.9%之間。在MRV S1基因節(jié)段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹上，已知的4種血清型MRV毒株形成4個(gè)不同的進(jìn)化分支，YNSZ/V207/2017毒株與蝙蝠、樹鼩、牛、水貂和人上分離的MRV-1型毒株[7,16-17]處于同一進(jìn)化分支，在系統(tǒng)發(fā)育樹上歸集為一簇(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)YNSZ/V207/2017毒株為MRV-1型。

本研究分離的YNSZ/V207/2017毒株以“●”表示，其它MRV毒株以“GenBank號/血清型/分離國家/分離宿主”表示。

2.6 YNSZ/V207/2017毒株可能為基因重配毒株 序列分析顯示，YNSZ/V207/2017毒株的L1至L3、M2、M3與S3基因節(jié)段與人糞便樣品中分離的MRV-2型MRV2Tou0毒株序列相似度最高，核苷酸序列相似度在97.0%(L3)至98.9%(S3)之間，編碼蛋白氨基酸序列相似度在98.6%(μN(yùn)S)至99.4%(λ2)之間；而M1、S1、S2與S4基因節(jié)段分別與白尾鹿(Odocoileusvirginianus)、水貂(Mustlavison)、果子貍(Pagumalarvatataivana)和棕蝠(Eptesicusserotinus)上分離的不同血清型MRV毒株對應(yīng)基因節(jié)段序列相似度最高(表3)；在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹上，YNSZ/V207/2017毒株的L1、L3與M1形成相對獨(dú)立的進(jìn)化分支，而L2、M2、M3、M4、S3與S4等基因節(jié)段則與分離自人、蝙蝠、豬和果子貍等的不同血清型MRV毒株聚為一簇(圖5)，提示YNSZ/V207/2017可能為基因重配毒株。

本研究分離的YNSZ/V207/2017毒株以“●”表示，其它MRV毒株以“GenBank號/血清型/分離國家/分離宿主”表示。

表3 YNSZ/V207/2017毒株各基因片段與GenBank中其它MRV毒株序列的最高相似度

2.7 MRV-1型病毒在當(dāng)?shù)丶倚蟮牧餍胁W(xué)初步調(diào)查 為分析MRV-1型病毒在當(dāng)?shù)丶倚蟮母腥厩闆r，通過血清中和試驗(yàn)，對2016至2017年采集自師宗縣牛、山羊和豬的血清各40份進(jìn)行MRV-1中和抗體的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛血清中13份為陽性，陽性率32.5%；山羊血清中檢測出8份陽性樣本，陽性率為20.0%；而豬血清中檢測到17份陽性，陽性率為42.5%，表明師宗縣家畜中普遍存在MRV-1型的感染，豬的感染率高于牛和羊。

3 討 論

近年來，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)[27]、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[28]、埃博拉病毒(Ebola virus)[29]與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)[30]等來源于蝙蝠與其它野生動物的病毒頻繁出現(xiàn)跨物種傳播，對人類公共衛(wèi)生安全與社會發(fā)展造成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。MRV呈世界范圍流行，多種哺乳動物均為易感宿主，可導(dǎo)致病毒發(fā)生跨物種傳播；蝙蝠體內(nèi)基因重配變異MRV毒株的不斷發(fā)現(xiàn)[8-10]，病毒引起人、家畜和野生動物發(fā)病的報(bào)道不斷增多[3-7,14-15]，表明MRV的跨物種傳播頻率與致病性正在發(fā)生改變。

MRV-1型在我國南方與北方地區(qū)均有分布，目前國內(nèi)已有從水貂、豬、樹鼩、蝙蝠和果子貍中分離出該血清型病毒的報(bào)道[7,14-17]。本研究從設(shè)立于師宗縣的哨兵牛中陸續(xù)分離出BTV、EHDV和PALV等蟲媒病毒，表明多種動物蟲媒病毒流行于云南省。BTV可引起綿羊群中藍(lán)舌病的暴發(fā)，發(fā)病動物病死率高達(dá)30%，是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的法定報(bào)告疫病，病毒如果向我國北方綿羊養(yǎng)殖集中的地區(qū)擴(kuò)散，可能會給我國綿羊養(yǎng)殖業(yè)帶來較大危害。由于國內(nèi)未見從牛上分離MRV的報(bào)道，因此實(shí)驗(yàn)之初，通過蟲媒病毒特異性的RT-PCR方法對YNSZ/V207/2017毒株的鑒定并不成功。進(jìn)一步通過透射電鏡觀察病毒粒子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離株具有呼腸孤病毒科病毒粒子特征，同時(shí)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示該毒株基因組為雙鏈RNA，以上結(jié)果均提示分離毒株可能歸屬于呼腸孤病毒科，但準(zhǔn)確鑒定分離病毒的種屬關(guān)系并掌握其遺傳背景，仍需獲取病毒的全基因組序列。

通過高通量測序(HTS)獲取病毒基因組序列推動了病毒的鑒定、分類學(xué)、進(jìn)化與溯源、診斷試劑、變異與疫苗等領(lǐng)域的研究[31-33]。本實(shí)驗(yàn)室前期建立了通過全長cDNA擴(kuò)增與HTS獲取呼腸病毒科病毒全基因組序列的技術(shù)[21]，我們通過該技術(shù)獲取了YNSZ/V207/2017毒株的全基因組序列，進(jìn)而確認(rèn)了病毒的身份：該毒株與GenBank中收錄的MRV核酸序列相似度在93.6%至98.9%之間，編碼蛋白氨基酸序列相似度在98.6%至99.4%之間，該毒株的S1/σ1與MRV-1型毒株的序列相似度達(dá)98.5%/98.9%，在S1基因節(jié)段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹上與MRV-1型毒株聚為一支，表明YNSZ/V207/2017毒株為MRV-1型。

基因重配是基因組分節(jié)段RNA病毒進(jìn)化主要動力之一，因此，對病毒的免疫原性、致病性、傳播與感染特性等均有深刻影響，歷史上幾次大范圍流感病毒的暴發(fā)與流行，均與基因重排產(chǎn)生變異毒株有關(guān)[34]。MRV基因組分節(jié)段，可感染幾乎所有的哺乳動物，為病毒通過基因重配產(chǎn)生多種形式的變異毒株創(chuàng)造了條件；蝙蝠免疫系統(tǒng)的特殊性和生活習(xí)性，使其成為產(chǎn)生MRV基因重配變異毒株的“病毒庫”，在MRV傳播和變異中扮演重要角色[8-10,16-17]。本研究分離MRV-1型毒株的L1至L3、M2、M3與S3基因節(jié)段與人上分離的MRV-2型毒株親緣關(guān)系最近；而M1、S1、S2和S4基因節(jié)段則分別與白尾鹿、水貂、果子貍和棕蝠分離的不同血清型MRV毒株序列相似度最高，這與我國腹瀉病豬分離的MRV-1與MRV-2型毒株的基因重配特征類似[12,14]，提示MRV可通過基因重配進(jìn)而適應(yīng)不同的宿主環(huán)境，推動病毒在不同宿主間傳播與擴(kuò)散。

初步的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在云南省師宗縣采集的血清樣本中，牛、羊和豬的MRV-1抗體陽性率分別達(dá)到32.5%、20.0%和42.5%，表明該血清型病毒在當(dāng)?shù)氐募倚笾袕V泛流行。目前有關(guān)我國家畜中MRV的流行病學(xué)調(diào)查研究報(bào)道較少，在四川10個(gè)豬場采集的78份腹瀉豬糞樣本中MRV-2的陽性率為14%[12]，而師宗縣豬血清中MRV-1中和抗體陽性率為42.5%，我們認(rèn)為除去病毒的差異外，飼養(yǎng)環(huán)境的不同也是造成兩地MRV感染率差異較大的原因。四川省生豬的規(guī)?；B(yǎng)殖程度較高，而師宗縣生豬養(yǎng)殖以散養(yǎng)為主；MRV對外界環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，高濕度有利于病毒的存活[35-36]，我們推測病毒可通過感染動物的糞便污染水源，而后通過糞口途徑感染造成病毒在當(dāng)?shù)貏游镏械牧餍?。由于目前尚無MRV疫苗，因此，通過控制環(huán)境衛(wèi)生仍是控制MRV在動物中擴(kuò)散的有效措施。

目前，不同血清型MRV毒株在我國的遺傳背景、流行情況、致病性等問題尚不完全清楚。在進(jìn)一步的工作中，我們計(jì)劃建立不同血清型MRV的核酸檢測技術(shù)，在云南省開展家畜與野生動物MRV的流行病學(xué)調(diào)查研究，開展病毒分離及全基因組測序，分析流行株的致病性，為MRV的防控提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)保障。

利益沖突：無

引用本文格式：李占鴻，肖雷，李卓然，等.云南牛血液標(biāo)本中哺乳動物正呼腸孤病毒(YNSZ/V207/2017)的分離鑒定[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：1-9.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.167