柳婷婷，李 萍，楊文輝，金大智，高 姍，王 菁，王景林，康 琳，辛文文

霍亂弧菌(Vibriocholerae)屬于革蘭陰性菌，普遍存在于不同的水生環(huán)境中。根據(jù)其主要表面耐熱抗原O，目前霍亂弧菌可分為近200多種血清群[1]，其中O1群和O139群能夠產(chǎn)生霍亂毒素(Cholera Toxin，CT)，是引起霍亂的病原菌。O1血清群可進一步分為3種血清型——小川型(Ogawa)、稻葉型(Inaba)和彥島型(Hikojima)[2]。

霍亂是人類感染了產(chǎn)毒素的霍亂弧菌而引起的急性水樣腹瀉病，暴發(fā)突然且易傳播，死亡率高，屬于國際檢疫傳染病[3]。病原菌分子分型是追溯霍亂傳染源，調(diào)查傳播途徑的主要手段?；魜y弧菌有許多種血清型，不同血清型的細菌，生理生化特性可能相同，但是對人類和動物的致病性可能完全不同。因此，對霍亂弧菌進行快速分型具有重要意義。目前以核酸序列差異分析為主的分子分型手段對霍亂弧菌進行分型與進化的研究是較為先進且最為靈敏準(zhǔn)確的，主要方法包括腸桿菌基因間重復(fù)一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC)PCR[4]、脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)及多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)技術(shù)等[5]。MLST技術(shù)能夠在無細菌純培養(yǎng)物的情況下，直接從臨床樣本中擴增出特定位點基因片段進行分析，直觀反映等位基因的變異情況，并且能夠?qū)崿F(xiàn)全球范圍內(nèi)的實驗室數(shù)據(jù)交流共享。隨著基因組測序成本的降低，目前正處于從MLST到全基因組測序分型的過渡階段[6]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的鑒定[7]。MALDI-TOF MS具有亞型區(qū)分的潛力，是研究菌株親緣關(guān)系、確定暴發(fā)菌株和地域特征間密切關(guān)聯(lián)的有力工具[8]。目前，MALDI-TOF MS對多血清型細菌的鑒定和分類仍處于起步階段，如對副溶血弧菌O3群等均表現(xiàn)出較好的分型能力[9]，在對艱難梭菌基因型ST37的表征區(qū)分[10]、流行性霍亂弧菌O1/O139群與非流行性霍亂弧菌[11]的快速區(qū)分也表現(xiàn)出了良好的效果，但是在其他物種的應(yīng)用上可能會受限制，需要實驗進行分析。

本研究利用MLST分型方法鑒定192株霍亂弧菌的MLST分型，進而分析其種群結(jié)構(gòu)。此外，利用MALDI-TOF MS技術(shù)分析霍亂弧菌蛋白指紋圖譜的相關(guān)性，并對兩種方法的結(jié)果進行比較。部分MLST數(shù)據(jù)庫中的O1群菌株也納入研究體系中，以進行相關(guān)的比較分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗采用的霍亂弧菌核酸和滅活蛋白來自863計劃項目(課題編號：2014AA021402)參與單位浙江省疾病預(yù)防控制中心，其中大部分屬于O1血清群，包括Inaba 63株、Ogawa 125株。其余4個菌株沒有相關(guān)血清型信息。

1.2 PCR擴增 根據(jù)霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫提供的方案，選擇adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM和pyrC這7個管家基因作為靶基因進行擴增(表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括正向和反向引物各0.5 μL(30 pmol/mL)、0.5 μL 10 mmol/L dNTP、5μL 10× Buffer(500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%TritonH X-100及15 mmol/L MgCl2)、2U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)和5 μL模板DNA，加ddH2O至總體積為50 μL。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s、56 ℃ 50 s、72 ℃ 80 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。使用PCR引物在ABI-3700測序儀上對擴增子進行雙向測序，并使用Contig-Express進行比對。使用Bioedit和MUSCLE version 3.8等軟件進行多序列比對和比較分析。對于16S rDNA，PCR擴增體系為25 μL，包含正向和反向引物各1 μL、12.5 μL的2×Taq PCR master Mix、2 μL模板DNA，加ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s、50 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 霍亂弧菌基因組7個等位基因MLST擴增引物

1.3 MALDI-TOF MS分析的樣品制備 首先使菌體蛋白(約10 mg)完全懸浮于300 μL ddH2O中，然后加入900 μL無水乙醇吹吸均勻，進行滅菌；12 000 r/min離心2 min后去除上清液(盡可能去除干凈)；向沉淀中加入50 μL 70%的甲酸，使菌體蛋白完全懸浮后再加入50 μL乙腈，充分混勻后12 000 r/min離心2 min；取1 μL上清液進行靶板點樣，并在室溫下干燥。樣本干燥后立即向樣本上覆蓋2 μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid, CHCA)并在室溫下干燥形成共結(jié)晶，后續(xù)即可上機分析。

1.4 序列多樣性分析 使用DnaSP 5.0計算7個等位基因的多樣性指數(shù)π、G+C含量及單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)個數(shù)。使用KaKs Calculator Version 2.0計算非同義和同義突變的比值dN/dS。

1.5 等位基因多樣性分析 將7個等位基因序列按照adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC的順序拼接在一起，將拼接序列結(jié)果與霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，確定其等位基因型(Allelic Profile, AP)和序列型(Sequence Type, ST)。新的AP和ST提交到PubMLST數(shù)據(jù)庫。依據(jù)序列型的等位基因信息，使用eBURST Version 3.0對STs進行分析，歸類為克隆群(Clonal Complex, CC)。CC包含至少3個基因位點不同的STs，7個位點中有6個及以上位點相同則定義為遺傳相關(guān)克隆。

1.6 種群結(jié)構(gòu)分析 利用STRUCTURE 2.2，采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)算法，分別分析評估本試驗得到的22個STs和40個數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的O1/O139群相關(guān)STs。計算種群內(nèi)群體數(shù)量K值，各個序列型間依據(jù)同源性高低而確定群體歸屬。本研究中，K值設(shè)置范圍為2～10，每100 000次重復(fù)并棄去前20 000次不穩(wěn)定結(jié)果。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用MUSCLE 3.8.31比對O1血清群的22個STs和40個STs的連接序列，并通過MEGA 5.0對獲得的核酸序列進行進化分析(1 000次重復(fù))，構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹。利用SplitsTree 4.0軟件，采用Neighbour-net算法構(gòu)建16S rDNA序列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖，檢驗種群間是否存在重組現(xiàn)象。

1.8 MALDI-TOF MS圖譜生成和聚類分析 采用正線性模式，每種菌株采集4～5張復(fù)合圖譜，每張復(fù)合圖譜由6張單圖譜組成。通過基線減法和平滑處理進行預(yù)處理。將屬于同一ST的分離株的蛋白指紋圖譜進行疊加，使用BioTyper 3.0軟件(Bruker Daltonics)中的PCA算法進行蛋白指紋圖譜分析，以便分析不同ST之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 核苷酸位點和等位基因序列多樣性 7個等位基因的遺傳多樣性結(jié)果如表2所示。等位基因型最多的是metE，共11個，最少的是purM，有3個。位于II號染色體上的pntA和pyrC均有10個等位基因型。pyrC共含有84個SNPs，顯示出最高的遺傳多樣性，其次是metE，含有58個SNPs。purM是最保守的基因，只有3個SNPs，且π是7個管家基因中最低的。pyrC的π水平最高，為0.060 58。除了pntA存在正選擇效應(yīng)外，其余等位基因均受到自然純化作用。

表2 核苷酸和等位基因序列多樣性

2.2 序列類型和克隆群 本研究22個STs中11個為新鑒定的ST。ST69為最主要的序列型，192株菌株中82株為ST69，其次是ST75，有40個菌株。新鑒定出的STs中，ST176包含的菌株數(shù)最多，有5個菌株。

圖1A顯示的是22個STs之間單等位基因位點變異關(guān)系(即7個等位基因中，至少有6個等位基因型相同)。22個STs形成2個CCs，均包含5個STs。CC176包含的5個STs分別是ST171、ST172、ST173、ST176和ST177，其中ST176為該CC的founder。CC430包含的5個STs分別是ST164、ST165、ST174、ST430和ST431，ST430為該CC的founder。剩下的12個STs形成了3個雙體和6個單體，ST69與ST75被分到兩個不同的雙體中。在對霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫中O1/O139血清群對應(yīng)的40個STs進行分析時，ST69與ST75分別形成了CC。CC69包含ST69、ST70和ST429，CC75包含ST75、ST169、ST170和ST182(圖1B)。圖1C顯示的是與數(shù)據(jù)庫中非O1/O139血清群STs的單等位基因位點變異關(guān)系，本研究中22個STs以紅色圓圈標(biāo)出。結(jié)果顯示，所有STs共形成6個CCs，分別為CC430、CC176、CC270、CC204、CC8和CC499。本研究中的22個STs未與數(shù)據(jù)庫中非O1/O139群對應(yīng)的STs形成新的克隆群。

注：彼此為單等位基因位點變異的ST用黑線連接。黑色圓點的大小與每個ST內(nèi)的菌株數(shù)量有關(guān)，圓點越大數(shù)量越多。每個CC的名稱用紅色標(biāo)出。

2.3 霍亂弧菌的系統(tǒng)發(fā)育和蛋白指紋圖譜分析 使用MEGA 5.0構(gòu)建鄰接(Neighbor joining, NJ)樹(圖2A)以分析本研究中22個STs與MLST數(shù)據(jù)庫中O1/O139群對應(yīng)的40個STs之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。22個STs形成2個譜系，ST169、ST75、ST429和ST69聚集在一個譜系中，其他18個STs在另一個譜系中。數(shù)據(jù)庫中40個STs之間的關(guān)系也分為2個譜系，2個譜系中都包含本試驗的22個STs(數(shù)據(jù)未顯示)。

采用neighbour-net方法，根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建了各個STs間分支網(wǎng)狀圖，如圖2B所示。192個菌株共含有13種不同的16S rDNA序列，其中8種序列包含1株以上的分離株和ST型。13種不同的序列中，4種序列都包含ST173，說明ST173分離株對應(yīng)的16S rDNA序列具有多樣性。此外，不同的16S rDNA序列存在共有的ST，如ST69、ST75和ST173。

A：采用最大似然法計算22個STs間的進化距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，新的ST用紅色圓點標(biāo)出；B：采用neighbour-net算法計算192株霍亂弧菌的16S rDNA序列與22個STs間的關(guān)系，并繪制成分支網(wǎng)狀圖，ST后括號內(nèi)的數(shù)字表示屬于同一ST的分離株數(shù)。

圖3A顯示了分別屬于22個STs的分離株的蛋白指紋圖譜的膠圖。不同STs的圖譜基本相同，質(zhì)量峰(m/z)均在2 000～12 500 Da范圍內(nèi)。另外，采用BioTyper 3.0對本研究中的22個STs的蛋白指紋圖譜的相關(guān)性也進行了分析，結(jié)果如圖3B所示。當(dāng)距離為200時，22個STs被分為2組，較大的組包含除ST171外的21個STs。當(dāng)距離為100時，22個STs被分成3組，ST179又形成了一個單獨的組。蛋白指紋圖譜分析結(jié)果與核苷酸序列分析結(jié)果不存在明顯相關(guān)性。

A：22個STs的蛋白指紋圖譜膠圖。相同ST的分離株圖譜疊加，視為1株分離株；B：根據(jù)22個STs的蛋白指紋譜生成的聚類分析樹狀圖，屬于相同ST的分離株視為1株分離株。

2.4 種群結(jié)構(gòu) 利用LDhat評估了霍亂弧菌7個等位基因的重組率(rho)與突變率(theta)，每個基因的重組率(purM除外)如表3所示。它們的比率范圍從0.31(gyrB)到388.52(adk)不等，7條序列總體比率為4.24。對于本研究中22個STs而言，在進化過程中，重組比突變更容易發(fā)生。此外，對霍亂弧菌MLST數(shù)據(jù)庫中已提交的屬于O1/O139血清群的40個STs，及所有霍亂弧菌的364個STs分析發(fā)現(xiàn)，包含所有STs的組的rho高于致病血清群STs的rho，平均重組率為863.46，而另外兩組的重組率均<1。IA值均>0，表明在a、b、c 3個組中均存在連鎖不平衡的傾向(表4)。

表3 各基因的重組檢測和評估

表4 各種群基因的重組檢測和評估

采用STRUCTURE 2.2進一步分析種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)22個STs被分成3個亞群，即K=3(圖4A)。ST69、ST429、ST75和ST169主要存在于第I組(紅色組)中，與第II組(綠色組)和第III組(黃色組)存在少量交叉。第II組包含11個STs，其中8個STs是本研究中新發(fā)現(xiàn)的，第III組中包含3個新發(fā)現(xiàn)的STs。圖4A中第I組(紅色組)包含的4個STs在圖4B中同樣也分布在同一組(黃色組)。圖4A中其余18個STs在圖4B中分布在同一個組(紅色組)。值得注意的是，圖4B中黃色組位于紅色組的中間，并將紅色組分為2個部分，表明黃色組在紅色組別間形成了“亞克隆群”。ST189、ST191和ST184存在2個不同組別間(綠色組和紅色組)的重組現(xiàn)象。為進一步分析O1群對應(yīng)的STs和非O1/O139群對應(yīng)的STs間的種群結(jié)構(gòu)關(guān)系。我們也對數(shù)據(jù)庫中的STs進行了種群結(jié)構(gòu)分析(圖4C)。結(jié)果顯示，所有的STs共形成4個亞群，絕大部分的STs都存在于紅色組，紫色和綠色對應(yīng)的亞群穿插在紅色組中，黃色組被紅色組分為距離較遠的2個部分。本研究中的22個STs全部存在于紅色組。

A：本研究中22個STs的種群結(jié)構(gòu)圖；B：數(shù)據(jù)庫中40個O1/O139血清群對應(yīng)的STs構(gòu)建的種群結(jié)構(gòu)圖；C：數(shù)據(jù)庫中STs構(gòu)建的種群結(jié)構(gòu)圖。不同的顏色代表不同的種群。

3 討 論

霍亂弧菌是霍亂的病原菌，通常會引起成人和兒童急性腹瀉疾病，是我國甲類腸道傳染病。目前已經(jīng)有許多針對霍亂弧菌O1血清群分離株的研究[12]，本研究選擇MLST方法來評估192株O1群霍亂弧菌的遺傳多樣性。MLST計算的是管家基因核酸位點的變化，不受操作條件的干擾，可實現(xiàn)最大的數(shù)據(jù)共享?；魜y弧菌已建立了MLST數(shù)據(jù)庫(www.pubmlst.org/vcholerae)，并且已有很多學(xué)者利用該方法對霍亂弧菌進行研究。此外，MALDI-TOF MS可以作為一種潛在的亞型區(qū)分方法區(qū)分大腸桿菌O157、O26和O111與其他血清型[13]，不過在某些物種的應(yīng)用上也會受限制[14]。

本研究中的菌株大多屬于血清型Inaba或Ogawa，Ogawa是最普遍的血清型。O1群的另一種血清型Hikojima較罕見且不穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)最保守的基因是purM，變化最大的基因是pyrC，這一結(jié)果與其他菌株的研究一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)7個管家基因在進化過程中，重組比突變更容易發(fā)生，尤其是adk基因的比率為388.52，遠高于其他研究中非O1/O139菌株的比率[12]?；魜y弧菌非O1/O139群與O1/O139群在系統(tǒng)發(fā)育上關(guān)系較遠[15]。類似研究結(jié)果也表明，非O1/O139群霍亂弧菌對應(yīng)的STs常形成單體，種群內(nèi)部存在異質(zhì)性[16]。本研究中，O1群對應(yīng)的STs與數(shù)據(jù)庫中非O1/O139群對應(yīng)的STs未能形成新的克隆群，且絕大部分非O1/O139血清群對應(yīng)的STs如星星狀散在分布，與上述研究結(jié)果相似。

ST69是第7次霍亂大流行分離株中的主要ST。類似的研究結(jié)果也表明，絕大部分O1/O139臨床菌株都是ST69[17]，但含有不同的毒力基因性狀，這可能是基因水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致[18]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)我國多地主導(dǎo)的ST 69被ST75所取代[19-20]。非O1/O139菌株比O1/O139菌株表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性，可能是由基因重組和/或突變引起[12]。ST69印度毒株與全球毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，ST69與ST429密切相關(guān)[21]，ST429由ST71突變而來。本研究的16S rDNA序列的Neighbor-net網(wǎng)狀分析結(jié)果表明，不同的16S rDNA序列存在共有的ST，如ST69、ST75和ST173，我們猜測這3個STs在新ST演變過程中起著重要作用。目前已有一些研究利用MALDI-TOF MS技術(shù)從蛋白指紋圖譜角度對霍亂弧菌進行分析。Telesmanich等[22]證明MALDI-TOF MS可以區(qū)分霍亂弧菌O1和非O1/O139菌株，并且可以分析它們的來源和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于本研究收集的菌株血清群單一(所有菌株都屬于O1血清群)且地域環(huán)境相似，獲得的蛋白指紋圖譜聚類分析結(jié)果與核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果間未發(fā)現(xiàn)明顯聯(lián)系，下一步我們將豐富菌株血清型和地域信息，已獲得更加全面的霍亂弧菌種群結(jié)構(gòu)信息。

總之，本研究通過MLST對我國沿海地區(qū)192株O1群霍亂弧菌的分子分型特征分析發(fā)現(xiàn)，ST69和ST75是O1群霍亂弧菌最主要的2個ST，管家基因重組比突變更容易發(fā)生，O1/O139群和非O1/O139群霍亂弧菌間存在較大差異，另外利用MALDI-TOF MS技術(shù)的分型研究有待進一步探究。

利益沖突：無

引用本文格式：柳婷婷，李萍，楊文輝，等.我國主要沿海地區(qū)O1群霍亂弧菌分子分型特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(1)：10-18.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.177