叢碧橋 劉曉萍 陳嘉雯 李洪利 范欣，

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，濰坊 261000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心，濰坊261053

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）可發(fā)生于舌前2/3、牙齦、硬腭、口底、嘴唇、頰黏膜等[1]。盡管采用多學(xué)科聯(lián)合診療可以改善患者的預(yù)后[2]，但OSCC 患者的5 年生存率仍不理想，25%～50%OSCC 患者可能會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。2020 年有45 萬人因頭頸部鱗狀細(xì)胞癌而死亡，OSCC 占其中主要構(gòu)成[4]。因此，深入研究OSCC 的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，可以為該疾病的治療帶來新的思路。

微小RNA（miRNA）是一類短的，不具有編碼能力的RNA[5]，可以與靶向基因的3’-非翻譯區(qū)中的互補(bǔ)位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本的降解或翻譯抑制[6]，在OSCC 的異常表達(dá)中起重要作用[7]，其失調(diào)可通過調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響腫瘤的進(jìn)展[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在OSCC中發(fā)揮作用，miR-663b 在子宮內(nèi)膜癌[9]、鼻咽癌[10]中發(fā)揮作用，但尚未有探討miR-663b 在OSCC 中的作用。

本研究通過生物信息學(xué)方法篩選OSCC相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物，選擇上調(diào)的差異表達(dá)基因miR-663b 作為研究對(duì)象，并預(yù)測(cè)其靶基因?yàn)镾H3BP2。探討miR-663b是否可以通過靶向SH3BP2影響OS‐CC 的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mes‐enchymal transition，EMT），為OSCC 的診療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 獲取組織標(biāo)本 收集2021 年1—12 月于濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除且資料完整的患者24例，每位患者術(shù)前未接受放、化療，切取獲得的病理標(biāo)本診斷均為OSCC。參與研究的患者男性13例，女性11例，年齡5～85歲，中位年齡62歲，獲取的新鮮組織標(biāo)本立即放入?150 ℃冰箱保存。患者或其家屬簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 其他材料獲取 人正常口腔上皮細(xì)胞（HOEC 細(xì)胞株）（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院），HEK293T（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），OSCC 細(xì)胞CAL27、HN30 和SCC-9（上海市口腔頜面部腫瘤組織樣本及生物信息數(shù)據(jù)庫專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)）。miR-663b 莖環(huán)結(jié)構(gòu)（上海生物工程有限公司），兔抗人SH3BP2 單克隆抗體、小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam 公司，英國(guó)），pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT（野生型）和pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT（突變型）雙熒光素酶報(bào)告基因載體、miR-663b 敲除質(zhì)粒（Anti-miR-663b）以及陰性對(duì)照質(zhì)粒Anti-NC（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司），熒光素酶報(bào)告基因載體（普洛麥格公司，美國(guó)）。

1.2 在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站

使用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omni‐bus，GEO）中OSCC miRNA（GSE28100 和GSE-45238）與mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE78060 和GSE-13601），使用R Studio 進(jìn)行差異表達(dá)分析，以P<0.05且|logFC|>1作為篩選閾值。

MiRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和microRNA目標(biāo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫（microRNA Target Prediction Database，miRDB）預(yù)測(cè)與miR-663b存在互補(bǔ)序列的靶基因。人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜（the human protein atlas，HPA）采用高度特異性的抗體，用免疫組化技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，為研究提供新的思路和幫助，查找SH3BP2 在OSCC 組織和正常組織中的表達(dá)情況?；虮磉_(dá)譜分析（gene expression profilling interactive analysis，GE‐PIA）在線網(wǎng)站下載SH3BP2 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者生存曲線。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HN30、CAL27、SCC-9 均使用RPMI 1640 培養(yǎng)基，HOEC、HEK293T 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），培養(yǎng)箱環(huán)境：5%CO2、37 ℃以及97%的濕度，2～3 d及時(shí)換液傳代。使用Lipo‐fectamine2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行分組：1）Anti-NC/HN30 組：轉(zhuǎn)入miR-663b 的對(duì)照質(zhì)粒；2）Anti-miR-663b/HN30 組：轉(zhuǎn)入miR-663b 的敲除質(zhì)粒；3）Anti-NC+Scr/HN30 組：轉(zhuǎn)入miR-663b 的對(duì)照質(zhì)粒和SH3BP2 空載對(duì)照質(zhì)粒；4）Anti-NC+SiSH3BP2/HN30 組：轉(zhuǎn)入miR-663b的對(duì)照質(zhì)粒和SH3BP2 敲低質(zhì)粒；5）Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 組：轉(zhuǎn)入miR-663b 的敲除質(zhì)粒和SH3BP2敲低質(zhì)粒。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

細(xì)胞培育良好后，使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，合成cDNA 并稀釋，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR。miR-663b上游引物序列：5’-GGTGGCCCGGCCGTGC-3’，下游引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；莖環(huán)結(jié)構(gòu)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTCAG；采用U6 作為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt分析的方法進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)：取含有4×104個(gè)細(xì)胞的懸液200 μL，小室不含Matrigel 基質(zhì)膠，將懸液添加到上室中，下室加入500 μL 胎牛血清。侵襲實(shí)驗(yàn)：取含有4×104個(gè)細(xì)胞的懸液200 μL，小室添加Matrigel 基質(zhì)膠，將細(xì)胞懸液添加到上室中，下室加入500 μL胎牛血清。培養(yǎng)24 h，甲醇固定20 min，PBS清洗干凈后染色35 min，清洗晾干后，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)良好視野拍照，計(jì)數(shù)穿過小室細(xì)胞的平均值為結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

分別將Anti-NC/HN30組和Anti-miR-663b/HN-30 組提取總蛋白質(zhì)，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，上樣后凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗過夜，洗膜，二抗常溫孵育1 h，洗膜，膠片曝光，分析灰度值。抗體配制如下：β-actin（1∶1 000）、SH-3BP2（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cad‐herin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

293T接種到24孔板，將miR-663b敲除質(zhì)粒及其對(duì)照分別與SH3BP2 的3’UTR 野生型（pGL3-SH3BP2 3’UTR-WT）和突變型（pGL3-SH3BP2 3’UTR-MUT）共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，棄上清后PBS 清洗，加PLB 裂解15 min；收集裂解液，并與空載對(duì)照比較熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)比較；單因素方差分析用于多組間比較，所有實(shí)驗(yàn)均相同條件重復(fù)3 次，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)分析，選擇研究對(duì)象

在GSE28100 和GSE45238 數(shù)據(jù)集中，以P<0.05，|logFC|>1 作為篩選閾值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSE-28100中有113個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA，36個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA；GSE45238 中有29 個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA，51 個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA，熱圖顯示部分差異表達(dá)miRNAs（圖1A）。在GSE28100 和GSE-45238 數(shù)據(jù)集上調(diào)的miRNAs 中有17 個(gè)交集miR‐NAs（圖1B），除miR-663b 及miR-33a 未有研究，其余均已有研究，選擇差異表達(dá)倍數(shù)更高的miR-663b 作為后續(xù)研究。通過對(duì)GSE28100 和GSE-45238 數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-663b 在OSCC 組織中的表達(dá)升高（P<0.05）（圖1C）。

圖1 GSE28100和GSE45238差異表達(dá)分析Fig 1 Differential expression analysis of GSE28100 and GSE45238

2.2 miR-663b 在OSCC 組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

通過qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織比較，OSCC 組織中miR-663b 的表達(dá)升高（P<0.05）（圖2）。

圖2 miR-663b在OSCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of miR-663b in OSCC tissues and adja‐cent normal tissues

2.3 敲除miR-663b可以抑制OSCC細(xì)胞HN30的遷移和侵襲能力

使用qRT-PCR 檢測(cè)miR-663b 在HN30、CAL-27、SCC-9 和HOEC 細(xì)胞中表達(dá)情況。結(jié)果顯示miR-663b在OSCC 細(xì)胞CAL-27、HN30、SCC-9中表達(dá)高于人HOEC 細(xì)胞，其中HN30表達(dá)最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3A），因此選用HN30 作為后續(xù)研究。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HN30 中miR-663b 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Anti-miR-663b/HN30 組中的miR-663b 表達(dá)明顯降低，Anti-NC/HN30 組的表達(dá)較高，2 組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3B），表明轉(zhuǎn)染成功。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Anti-NC/HN30 組中穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯多于Anti-miR-663b/HN30 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3C）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示Anti-NC/HN30 組中穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量多于Anti-miR-663b/HN30 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)miR-663b 的表達(dá)降低時(shí)，OSCC細(xì)胞HN30的遷移和侵襲能力受到抑制。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)miR-663b表達(dá)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HN30細(xì)胞的遷移和侵襲能力Fig 3 qRT-PCR detection of miR-663b expression and Transwell experiment to detect the migration and invasion ability of HN30 cells after transfection

2.4 敲除miR-663b 可以抑制OSCC 細(xì)胞HN30 的EMT發(fā)生

采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anti-NC/HN30組和Anti-miR-663b/HN30 組中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示與Anti-NC/HN30 組相比，Anti-miR-663b/HN30 組中相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin 和Vimentin的表達(dá)下調(diào)（P<0.05）（圖4）。結(jié)果表明，敲除miR-663b可抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-663b敲除質(zhì)粒后抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生Fig 4 Inhibition of EMT of OSCC HN30 after transfection of miR-663b interference plasmid

2.5 miR-663b與SH3BP2靶向結(jié)合

利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（miRWalk 和miRDB）預(yù)測(cè)與miR-663b存在互補(bǔ)序列的靶基因分別為15 023個(gè)和333個(gè)。GSE78060和GSE13601兩個(gè)數(shù)據(jù)集中以P<0.05，|logFC|>1作為篩選閾值，下調(diào)差異表達(dá)miRNAs分別為1 710個(gè)和741個(gè)，在4組數(shù)據(jù)中取交集，SH3BP2既具有與miR-663b結(jié)合靶點(diǎn)又在OSCC中表達(dá)下調(diào)（圖5A）。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示相較于低表達(dá)SH3BP2 的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，高表達(dá)SH3BP2 的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后更好（圖5B）。觀察熒光素酶活性，miR-663b敲除質(zhì)粒與pGL3-SH3BP2 3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染后活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5C），miR-663b 與SH3BP2 靶向結(jié) 合。Western blot 結(jié)果顯示，SH3BP2在Anti-miR-663b/HN30組中的表達(dá)高于在Anti-NC/HN30 組中的表達(dá)（P<0.05）（圖5D），表明miR-663b可以影響SH3BP2的表達(dá)。利用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OSCC 組織和癌旁正常組織中的SH3BP2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，SH3BP2在正常組織中表達(dá)高于癌癥組織（P<0.05）（圖5E）。綜上所述，miR-663b與SH3BP2存在靶向結(jié)合關(guān)系。

圖5 SH3BP2是miR-663b的靶點(diǎn)Fig 5 SH3BP2 is the target of miR-663b

2.6 敲除miR-663b 可以靶向SH3BP2 抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生

檢測(cè)Anti-NC+Scr/HN30、Anti-NC+SiSH3BP2/HN30和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30組中E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示與Anti-NC+Scr/HN30組和Anti-miR-663b+SiSH3BP2/HN30 相比，Anti-NC+SiSH3BP2/HN30組中E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，而N-cadherin 和Vimen‐tin的表達(dá)上調(diào)（圖6）。結(jié)果表明，miR-663-b可以靶向SH3BP2影響OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生。

圖6 敲除miR-663b可以靶向SH3BP2抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生Fig 6 knockout of miR-663b can inhibit EMT of HN30 in OSCC by targeting SH3BP2

3 討論

OSCC是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的主要類型，是一種轉(zhuǎn)移后生存率較低的惡性腫瘤[11]。為尋找新而有效的治療方法，本文通過差異表達(dá)分析等生物信息學(xué)方法展開研究，具有樣本數(shù)據(jù)量大、臨床和預(yù)后信息全面等優(yōu)點(diǎn)，本文還將生信與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證增加靶點(diǎn)可信度。

miRNA與靶向基因的3’-非翻譯區(qū)中的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，從而發(fā)揮作用。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-663b 通過直接靶向鼻咽癌中的SMAD 家庭成員7（SMAD family member 7，SMAD7）促進(jìn)細(xì)胞增殖和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，Shu 等[12]驗(yàn)證，敲低miR-663b 可以通過調(diào)節(jié)腫瘤蛋白p73 的表達(dá)抑制骨肉瘤的細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。Du 等[13]發(fā)現(xiàn)血漿中的miR-497 和miR-663b 水平可能是膀胱癌的新生物標(biāo)志物。本研究對(duì)miR-663b 在OSCC 中發(fā)揮的作用進(jìn)行探討。通過microRNA 分析網(wǎng)站分析并檢測(cè)miR-663b 在OSCC 組織中的表達(dá)并選為目的基因，通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-663b在OSCC 細(xì)胞HN30 中表達(dá)較高（P<0.05），Transwell 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-663b 敲除質(zhì)?？梢种芆SCC 細(xì)胞HN30的遷移及侵襲能力，表明miR-663b在OS‐CC的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。

EMT 是一種復(fù)雜且可逆的生物學(xué)過程，可以使上皮細(xì)胞變成間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞，在腫瘤進(jìn)展中的重要性已經(jīng)被證實(shí)[14]。E-cadherin 表達(dá)降低的同時(shí)，往往伴隨N-cadherin表達(dá)升高，即“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化”，EMT 主要通過影響E-cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附和信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，E-cadherin 表達(dá)降低可抑制EMT[15-16]。在本研究中通過Western blot 實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染miR-663b 敲除質(zhì)?？墒笶-cadherin 表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin 和Vimen‐tin 的表達(dá)下調(diào)，表明敲除miR-663b 可抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生。

SH3BP2 是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，主要在免疫細(xì)胞（包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及破骨細(xì)胞）中表達(dá)[17]，與多種疾病密切相關(guān)，Kawahara 等[18]發(fā)現(xiàn)SH3BP2缺乏可改善小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡，可為自身免疫性疾病的治療提供新的方法。SH3BP2與腫瘤的發(fā)展也有一定關(guān)系，Lin 等[19]證實(shí)敲低SH3BP2 可以促進(jìn)小鼠腫瘤的形成。SH3BP2 與牙周病的發(fā)展有一定關(guān)系，Kittaka 等[20]發(fā)現(xiàn)SH3BP2是一種新型的牙周炎牙槽骨吸收調(diào)節(jié)劑。本研究發(fā)現(xiàn)miR-663b 在OSCC 中發(fā)揮原癌基因的作用與SH3BP2 有關(guān)。通過基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站及基因芯片篩選出可以靶向miR-663b 并且在OSCC 中表達(dá)下調(diào)的SH3BP2，生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)SH3BP2 的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后較好，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-663b 與SH3BP2 存在靶向結(jié)合關(guān)系，Western blot 實(shí)驗(yàn)則驗(yàn)證了敲除miR-663b 可以靶向SH3BP2抑制OSCC細(xì)胞HN30的EMT發(fā)生。

綜上所述，miR-663b 在OSCC 組織呈高表達(dá)，敲除miR-663b會(huì)上調(diào)SH3BP2的表達(dá)并導(dǎo)致OSCC細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的降低，在以后的發(fā)展中，為抑制OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移，提供新的理論支持。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。