戴振寧 鄭蔚晗 利時(shí)雨，

1.廣東省第二中醫(yī)院口腔科，廣州 510095；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)3D打印應(yīng)用轉(zhuǎn)化創(chuàng)新平臺(tái)，廣州510630

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是常見(jiàn)的口腔疾病，通常由牙菌斑生物膜作為始動(dòng)因子，造成牙周組織的破壞，牙周炎晚期牙齒周?chē)浗M織和骨組織嚴(yán)重破壞吸收，引起牙齒的松動(dòng)和脫落[1]。在生理狀態(tài)下，由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)分泌，與由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)分解，往往處于動(dòng)態(tài)平衡；而在病理性骨吸收狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞的過(guò)度激活[2-3]。以往研究[4-6]顯示，在細(xì)菌引起的炎性環(huán)境中，牙周組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞對(duì)炎性因子產(chǎn)生應(yīng)答，如M1型巨噬細(xì)胞加速牙周炎病程，CD4+T 細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、腫瘤壞死因子α（tumor ne‐crosis factor-α，TNF-α）激活破骨細(xì)胞導(dǎo)致牙槽骨吸收，B 淋巴細(xì)胞通過(guò)分泌核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB li‐gand，RANKL）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收等。然而，對(duì)于牙周組織中的牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）在CP 的病理性骨吸收中扮演何種角色，目前缺乏相關(guān)研究。

干細(xì)胞可通過(guò)旁分泌機(jī)制調(diào)控細(xì)胞本身和周?chē)?xì)胞的生物學(xué)功能，外泌體（exosomes，Exo）是干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要媒介[7]。Exo是一種由細(xì)胞分泌的微小的細(xì)胞外囊泡，粒徑通常在30～150 nm，其中含有豐富的蛋白、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)[8]。在不同的生理、病理環(huán)境下，Exo中的成分會(huì)隨來(lái)源細(xì)胞蛋白、核酸表達(dá)譜改變而發(fā)生同步變化[9]。因此，CP 病程中，炎性牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs-CP）可能經(jīng)其分泌的Exo，實(shí)現(xiàn)抑制骨形成或促進(jìn)骨吸收的功能。

本研究提取了健康牙周膜組織、炎性牙周膜組織中PDLSCs 的Exo，通過(guò)對(duì)Exo 蛋白組分的分析，初步研究PDLSCs-CP 中Exo 對(duì)RAW264.7 破骨細(xì)胞分化的影響，為CP 的病理性骨吸收發(fā)展機(jī)制提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、試劑、儀器

1.1.1 細(xì)胞株 細(xì)胞原代提取已獲患者知情同意，本研究實(shí)驗(yàn)已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。正常表型PDLSCs（PDLSCs-WT）來(lái)源于3例正畸治療前拔除的健康牙的牙周膜組織，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：牙周健康、因正畸需要拔牙。PDLSCs-CP來(lái)源于3例CP 拔牙患者的炎性牙周膜組織，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：重度牙周炎、患牙Ⅲ度松動(dòng)、牙槽骨吸收至根1/3、牙周袋>5 mm、有反復(fù)發(fā)作的牙周溢膿、腫痛史。RAW264.7細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 無(wú)Exo 胎牛血清（EXO-FBS-50A-1，SBI 公司，美國(guó)），DMEM 培養(yǎng)基（1196-5092）、雙抗（15140122）、0.25% 胰蛋白酶（25200072）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS）（14190144）、Ⅰ型膠原酶（171018029）（Gibco 公司，美國(guó)），蛋白濃度檢測(cè)（bicinchoninic acid assay，BCA）試劑盒（23227，Thermo 公司，美國(guó)），抗體：CD63（ab134045）、Alix（ab-275377）、CD9（ab2366-30）、CD44（ab243894）、CD45（ab40763）、CD-105（ab2529）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）（ab-126758）、kappa B 抑制因子激酶β（inhibitor of kappa B kinase beta，IKKβ）（ab1249-57）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）-p65（ab16502）、整合素β3（Integrin β3）（ab17-9473）、Goat anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（Abcam公司，英國(guó)）；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（DG-12110H，北京Dogesce 公司），RAN-KL ELISA 試劑盒（EK5377）、IL-1α ELISA 試劑盒（EK-8147）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）ELISA 試劑盒（EK5130）（SAB 公司，美國(guó)），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）ELISA試劑盒（H0287，上海信裕生物科技有限公司），RANKL蛋白、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）（蘇州Novoprotein 公司），總RNA 提取試劑盒（Axygen公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）試劑盒（Roche 公司，瑞士），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）。

1.1.3 主要設(shè)備 流式細(xì)胞儀（FACSAria Ⅲ，BD公司，美國(guó)），多功能高效離心機(jī)、智能超高速離心機(jī)（Beckman Coulter公司，美國(guó)），低速冷凍離心機(jī)（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)），Nano Sight 納米粒徑儀（Malvern 公司，英國(guó)），倒置激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國(guó)），熒光聚合酶鏈反應(yīng)（poly‐merase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國(guó)），超高效液相色譜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)譜儀（Thermo公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 原代提取及細(xì)胞培養(yǎng) 刮下根中1/3 牙周膜組織，用含1%雙抗、3%慶大霉素的DPBS溶液洗滌1 min。將牙周膜組織加入含3 g·L?1Ⅰ型膠原酶的DPBS 中，于37 ℃水浴中消化1 h。消化后過(guò)70 μm 濾膜過(guò)濾獲得分散均勻的細(xì)胞，100g離心5 min后，用完全培養(yǎng)基（含10%無(wú)Exo血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基）重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×104個(gè)，接種于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。1 d后全換液去除未貼壁細(xì)胞，后續(xù)2～3 d 全換液1 次，于細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè) 分別將1 名正畸患者和1 名CP患者的第2代PDLSCs-WT和PDLSCs-CP去掉培養(yǎng)液，用0.25%的胰蛋白酶消化1 min，用PBS洗滌后制成每毫升含有1×106個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。分入4 組試管，每管20 μL，分別檢測(cè)CD44、CD45、CD105，滴加10 μL 一抗，冰上放置30 min。每管加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，每管加入二抗4 μL，室溫下避光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌3 次，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)，每次計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.3 差速離心法提取Exo 分別將2 名正畸患者和2 名CP 患者 的PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 細(xì) 胞分別接種至10 個(gè)T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)約80%融合，用PBS 洗滌2 次，每次1 min。用含10%無(wú)Exo 血清、1%雙抗的完全培養(yǎng)基進(jìn)行全換液，每瓶加入培養(yǎng)基50 mL。3 d 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液（共500 mL）用作Exo 提?。? ℃條件下，依次離心300g10 min，2 000g10 min，10 000g30 min，每次離心后取上清繼續(xù)離心。繼續(xù)4 ℃100 000g離心70 min，棄上清，每支離心管用2 mL DPBS 重懸沉淀。進(jìn)而100 000g離心70 min，棄上清，每支離心管用200 μL DPBS重懸沉淀。用0.22 μm 孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾除菌，用EP 管分裝置于?80 ℃保藏用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，取用時(shí)避免反復(fù)凍融。PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 細(xì) 胞的Exo 分別記為Exo-WT、Exo-CP。

1.2.4 Exo 鑒定 1）Western blot 檢測(cè)Exo 標(biāo)志物：Western blot 根據(jù)常規(guī)方法依次對(duì)細(xì)胞和Exo 的蛋白樣品進(jìn)行BCA 蛋白濃度測(cè)定、配制15%的分離膠和5%的濃縮膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、孵育一抗、孵育HRP 標(biāo)記二抗、電化學(xué)發(fā)光（electroche‐miluminescence，ECL）檢測(cè)。2）納米粒徑檢測(cè)：將1 mL外泌體樣品緩慢注入Nanosight納米粒徑儀樣品池中，將溫度計(jì)探頭放入激光模塊的銅孔內(nèi)，調(diào)整焦距后，在標(biāo)準(zhǔn)操作程序中選擇對(duì)樣品進(jìn)行粒徑觀測(cè)和計(jì)算。3）透射電子顯微鏡（transmis‐sion electron microscope，TEM）檢測(cè)：將10 μL 外泌體樣品滴加在銅網(wǎng)上，靜置3 min，用無(wú)塵紙吸去浮液。在銅網(wǎng)上滴加10 μL 磷鎢酸，靜置1 min，無(wú)塵紙吸去浮液。室溫干燥5 min，使用TEM 進(jìn)行成像，操作電壓為90～120 kV。

1.2.5 Exo蛋白質(zhì)譜檢測(cè) 通過(guò)常規(guī)步驟對(duì)Exo-WT和Exo-CP進(jìn)行BCA 濃度測(cè)定、烷基化、酶解。酶解后肽段用液相色譜流動(dòng)相A 溶解后使用EASYnLC 1200 超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動(dòng)相B 為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置：0～96 min，4%～19%B；96～115 min，19%～32%B；115～118 min，32%～80%B；118～120 min，80%B，流速維持在500.00 nL·min?1。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI 離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)Exploris 480質(zhì)譜分析。所得二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用PD 2.4進(jìn)行檢索，將半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl（C）設(shè)置為固定修飾，可變修飾為［‘Acetyl（Protein N-term）’，‘Oxidation（M）’，‘Deamidation（NQ）’］。

1.2.6 ELISA 檢測(cè) 將Exo-WT、Exo-CP 稀釋為1 mg·mL?1，采用TNF-α、RANKL、IL-1α、TGFβ1、BMP-2 的ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)：根據(jù)試劑盒說(shuō)明配置梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品和工作液，Exo與工作液反應(yīng)后于酶標(biāo)儀中檢測(cè)光密度（optical den‐sity，OD）值。于Origin 8 軟件中生成標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線(xiàn)，根據(jù)樣品OD值計(jì)算蛋白濃度。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè) 將RAW264.7以細(xì)胞密度為每毫升1×105個(gè)接種于12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)約80%融合，分別給予5 種條件進(jìn)行培養(yǎng)：完全培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基（分別含10、100、1 000 μg·mL?1Exo-WT 或Exo-CP）、無(wú)血清培養(yǎng)基（含50 ng·mL?1RANKL 和25 ng·mL?1M-CSF）于5 d 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-poly‐merase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)破骨分化相關(guān)基因TRAP、人組織蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、降鈣素受體（caltitonin receptor，CTR）表達(dá)水平：將12 孔板中的培養(yǎng)基去除，用DPBS 洗滌2 次，每次3 min。用細(xì)胞刮轉(zhuǎn)移RAW264.7 細(xì)胞至EP 管中，液氮冷凍后將樣品磨碎成粉末，用總RNA 提取試劑盒提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。逆轉(zhuǎn)錄完成后加入引物，引物序列如下。TRAP 上游引物序列：CTGGAGTGCAC‐GATGCCA，下游引物序列：TCCGTGCTCGGC‐GATGGA；Cath-K 上游引物序列：ATGTCTGTC‐TAAGTTTCTG，下游引物序列：CGCTCCTGG‐TATGGGCAGA；CTR 上游引物序列：CGACTATCCACTGCTACCG，下游引物序列：GTTGCTGATTGGAGGATTC；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceralde‐hyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：ACCCAGAAGTGTGGATCC，下游引物序列：CACATTGGGGGTAGGAACAC。于RT-qPCR分析儀中，利用2?ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.8 Western blot檢測(cè) 根據(jù)1.2.7分組，對(duì)TRAF-2、IKKβ、NF-κB-p65、Integrin β3 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，方法如1.2.4（1）。

1.2.9 TRAP 染色 根據(jù)1.2.7 分組，采用試劑盒固定RAW264.7細(xì)胞5 min，蒸餾水洗滌2次。室溫避光染色1 h，蒸餾水洗滌2次，鏡檢。采用ImageJ軟件計(jì)算除破骨細(xì)胞外其余RAW264.7細(xì)胞的長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs細(xì)胞及其Exo的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)正畸前患者PDLSCs-WT 細(xì)胞和CP患者PDLSCs-CP細(xì)胞的表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1A。PDLSCs-WT 和PDLSCs-CP 均高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD105；幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45，符合PDLSCs的表面標(biāo)記物特征。

通過(guò)差速離心法從PDLSCs-WT和PDLSCs-CP培養(yǎng)液中提取Exo，分別記為Exo-WT 和Exo-CP，Exo 樣品和細(xì)胞蛋白樣品經(jīng)過(guò)Western blot 免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1B。Exo-WT 和Exo-CP 都顯著表達(dá)Exo 特征性標(biāo)志物Alix、CD63、CD9，幾乎不表達(dá)細(xì)胞內(nèi)參蛋白β-actin；在相同濃度的蛋白樣品中，細(xì)胞樣品的Alix、CD63、CD9 表達(dá)水平較低。TEM 結(jié)果見(jiàn)圖1C，2 種PDL-SCs 來(lái)源的Exo均為典型的“杯口狀”囊泡。經(jīng)BCA 法檢測(cè)Exo-WT 和Exo-CP 的蛋白濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1D，從細(xì)胞培養(yǎng)液中差速離心提取的Exo，經(jīng)過(guò)重懸樣品體積和原細(xì)胞培養(yǎng)液體積的換算，每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液中可分離獲得的Exo 分別為26.45 μg±2.36 μg 和26.92 μg±5.74 μg，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)納米粒徑追蹤分析檢測(cè)Exo的粒徑尺寸，結(jié)果見(jiàn)圖1E，Exo-WT和Exo-CP的粒徑分布主要集中在30～150 nm范圍內(nèi)，少量囊泡的粒徑可達(dá)200 nm。

圖1 PDLSCs細(xì)胞及其Exo鑒定結(jié)果Fig 1 Characterization of PDLSCs and Exo

2.2 Exo的蛋白組分分析

蛋白質(zhì)譜共檢測(cè)到378個(gè)蛋白，可定量的蛋白有246 個(gè)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布結(jié)果見(jiàn)圖2A。Exo-WT 與Exo-CP 所鑒定到的蛋白主要富集于細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，符合Exo蛋白分布特征。在這些可定量蛋白中Exo-WT/Exo-CP共篩選出33 個(gè)差異表達(dá)的蛋白，其中20 個(gè)表達(dá)下調(diào)，13 個(gè)表達(dá)上調(diào)。下調(diào)水平顯著的蛋白包括TNFSF11、TNFSF2、IL1A、GLUT1、ODRF、OSCAR、MMP9、C3、MMP14；上調(diào)顯著的蛋白包括TGFB1、TGFBR2、TGFBR3、BMP2B1、FG‐FR2、CCL4等（圖2B）。

2.3 蛋白功能注釋富集分析

根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）富集分析，分別描述Exo-CP/Exo-WT 中差異蛋白的生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖2C。差異蛋白的分子功能主要與骨吸收，細(xì)胞組分組織或合成和吞噬作用有關(guān)；差異表達(dá)蛋白所處的亞細(xì)胞定位主要集中在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間和細(xì)胞膜；差異表達(dá)蛋白參與的生物過(guò)程主要與趨化因子活性，連接和催化活性有關(guān)。

利用KEGG 通路富集分析對(duì)Exo-WT/Exo-CP中差異蛋白涉及的信號(hào)通路予以描述，結(jié)果見(jiàn)圖2D。主要涉及的信號(hào)通路包括TNF 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化通路、NF-κB信號(hào)通路等。

圖2 Exo蛋白質(zhì)譜分析Fig 2 Analysis of Exo protein profile

2.4 ELISA檢測(cè)

利用ELISA 試劑盒對(duì)Exo-CP 和Exo-WT 所含TNF 信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表1。相對(duì)于Exo-WT 組，Exo-CP 組TNF-α、RANKL、IL-1α水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）；而TGF-β1、BMP-2 水平均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 外泌體細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果Tab 1 ELISA of exosomal cytokines ng·mL?1

2.5 不同濃度Exo-WT 和Exo-CP 對(duì)RAW264.7 破骨細(xì)胞分化的影響

利用RT-qPCR 檢測(cè)各處理組破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖3A。不同濃度Exo-WT 處理組的TRAP、Cath-K、CTR 基因表達(dá)水平基本與Control組保持一致。不同濃度Exo-CP處理組的TRAP、Cath-K 和CTR 基因的相對(duì)表達(dá)均上調(diào)，和Control 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其 中100、1 000 μg·mL?1濃 度Exo 組 和RANKL+M-CSF 陽(yáng)性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與10 μg·mL-1Exo 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Western blot 檢測(cè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖3B。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了RANKL、TNFα 的下游蛋白TRAF2，以及NF-κB 信 號(hào)通路的IKKβ、NF-κB-p65，破骨細(xì)胞特異表達(dá)蛋白Integ‐rin β3。在Exo-WT 組中，破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平基本與Control 組一致，TRAF2 和Inte‐grin β3 表達(dá)水平較低，IKKβ、NF-κB-p65 有檢測(cè)蛋白表達(dá)且與Exo-WT外泌體濃度呈正相關(guān)，但顯著低于Exo-CP組各濃度。在Exo-CP組中，上述破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均呈陽(yáng)性表達(dá)，與Exo-CP 外泌體濃度呈正相關(guān)，且1 000 μg·mL?1Exo-CP與RANKL+M-CSF組表達(dá)水平一致。

TRAP 染色后，胞質(zhì)呈紫紅色。各濃度Exo-CP 組和RANKL+M-CSF 組可見(jiàn)邊界清晰、胞體巨大、胞漿量豐富、圓形、多核的破骨細(xì)胞。鏡下視野中Control 組和Exo-WT 組的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯少于Exo-CP組和RANKL+M-CSF組（圖3C）。

對(duì)TRAP 染色結(jié)果中未分化為破骨細(xì)胞的RAW264.7 細(xì)胞長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖3D?？梢?jiàn)隨外泌體濃度提高，RAW264.7 的細(xì)胞偽足擴(kuò)張，細(xì)胞長(zhǎng)度提高，由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，該現(xiàn)象在Exo-WT 組尤為明顯。而對(duì)照組Control 組和RANKL+M-CSF組，細(xì)胞多呈圓形。

圖3 RAW264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化檢測(cè)Fig 3 Osteoclast differentiation detection of RAW264.7 cells

3 討論

CP 是由牙菌斑生物膜的細(xì)菌及其產(chǎn)物為始動(dòng)因子引起的牙周組織慢性炎癥，牙周組織長(zhǎng)期炎性浸潤(rùn)導(dǎo)致其力學(xué)緩沖、穩(wěn)固支持的生理功能喪失，造成牙齒松動(dòng)、牙槽骨吸收等病癥。本研究關(guān)注的PDLSCs 來(lái)源于牙周膜，大量研究[10-11]表示利用酶消化法從牙周膜組織中分離的PDLSCs 細(xì)胞，表達(dá)CD44、CD105 等基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物，與本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的表型一致。以往研究[12]證實(shí)了PDLSCs 的多向分化潛能，主要是成骨、成脂分化能力，也有研究[13]發(fā)現(xiàn)其具有向骨骼肌和神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞分化的潛能。本研究關(guān)注的牙槽骨吸收病理癥狀，涉及破骨細(xì)胞調(diào)控骨代謝、破骨細(xì)胞分化的相關(guān)功能，破骨細(xì)胞主要分化自單核巨噬細(xì)胞相互融合形成的多核巨細(xì)胞，不屬于PDLSCs的終末分化方向，但在CP 環(huán)境下PDLSCs 的Exo 是否調(diào)控破骨細(xì)胞的分化、募集、激活，尚無(wú)相關(guān)研究。

Exo是細(xì)胞分泌的微小囊泡，最初被發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是細(xì)胞代謝排出的廢物，后證實(shí)其中含有豐富的核酸、蛋白等成分，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要媒介。目前的研究中發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞、不同環(huán)境下細(xì)胞所分泌的Exo功能有所差異，如腫瘤細(xì)胞分泌的Exo 可能介導(dǎo)腫瘤血管新生、腫瘤細(xì)胞遷移等[14]。而間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的Exo含有豐富的旁分泌因子，可介導(dǎo)旁分泌作用對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行激活和募集[15]。本研究通過(guò)常用的差速離心方法提取Exo，通過(guò)不同離心力依次離心去除培養(yǎng)液中的細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜質(zhì)蛋白等物質(zhì)，最終收獲Exo。經(jīng)實(shí)驗(yàn)鑒定，本研究提取的Exo 高表達(dá)CD9、CD63 膜蛋白，以及Alix 外泌體內(nèi)容物蛋白，其微觀形態(tài)呈“杯口狀”囊泡，粒徑主要分布在30～150 nm范圍內(nèi)，符合外泌體的特征。值得注意的是，本研究采用了健康牙周組織的PDLSCs-WT和炎癥牙周組織的PDLSCs-CP進(jìn)行對(duì)照研究，以往研究[16]提出，細(xì)胞在缺氧、炎癥等[17]條件下可能促進(jìn)Exo分泌行為，但本研究通過(guò)蛋白濃度對(duì)Exo 進(jìn)行定量并未發(fā)現(xiàn)Exo 分泌水平的差異。

目前有關(guān)PDLSCs Exo 的研究表明，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，PDSLCs Exo 的miRNA 表達(dá)譜發(fā)生變化[18]，可發(fā)揮與間充質(zhì)干細(xì)胞Exo相似的組織修復(fù)功能，促進(jìn)骨組織再生[19]。并且對(duì)于PDLSCs在成骨分化總circRNA 和lncRNA 的表達(dá)譜變化也有報(bào)道，明確了PDLSCs Exo 對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用[20]。而對(duì)于Exo-CP 的研究則報(bào)道了其促血管化和改善炎癥微環(huán)境的作用：Liu等[18]發(fā)現(xiàn)Exo-CP中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平上調(diào)，miR-17-5p 下調(diào)，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管和牙周韌帶的血管化具有促進(jìn)作用。研究[21]構(gòu)建了脂多糖刺激的PDLSCs-CP 模型，其外泌體含有miR-155-5p，通過(guò)靶向炎性PDLSCs 的SIRT1 來(lái)調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡以改善炎性微環(huán)境。上述研究多圍繞Exo RNA成分的表達(dá)水平和功能，而本研究主要關(guān)注Exo-CP 的蛋白組分，并率先發(fā)現(xiàn)了其中破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的高表達(dá)。

在蛋白質(zhì)譜的分析結(jié)果中，Exo-WT、Exo-CP的蛋白成分亞細(xì)胞定位主要為細(xì)胞外成分和細(xì)胞質(zhì)成分，Exo-CP 高表達(dá)的TNFSF11、TNFSF2 即RANKL 和TNF-α，前者通過(guò)RANKL-RANK 信號(hào)途徑[22]，后者通過(guò)TNF-α-TNFR1 信號(hào)途徑，二者皆可介導(dǎo)NF-κB 通路活化以促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]，以往研究[24]報(bào)道TNFSF11 由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、活化T 細(xì)胞表達(dá)，與PDLSCs 表型一致。此外，鑒定的Exo-CP 高表達(dá)蛋白IL-1α、OSCAR、MMP9、MMP14 對(duì)于破骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞存活、骨吸收活性具有密切影響。反之，Exo-CP 低表達(dá)而Exo-WT 高表達(dá)的TGF-β、FGF、BMP 等細(xì)胞因子，對(duì)骨形成和成骨分化起促進(jìn)作用，反映出PDLSCs 和間充質(zhì)干細(xì)胞的Exo 可能起到相似的促組織再生作用。生物信息學(xué)富集的差異表達(dá)蛋白富集的TNF 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路證實(shí)了PDLSCs-CP Exo 富含促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。根據(jù)蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果，對(duì)表達(dá)差異較大且功能作用突出的5種細(xì)胞因子TNF-α、RANKL、IL-1α、TGF-β1、BMP-2 進(jìn)行了ELISA 驗(yàn)證，定量的細(xì)胞因子濃度與蛋白質(zhì)譜鑒定的表達(dá)水平相吻合。

為驗(yàn)證Exo-CP 對(duì)破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，本研究將不同濃度的Exo-WT 和Exo-CP 加入RAW264.7 進(jìn)行共培養(yǎng)，通過(guò)RT-qPCR、Western blot、TRAP 染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)過(guò)Exo-CP 作用，有效促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化。由于難以對(duì)體內(nèi)環(huán)境中PDLSC分泌外泌體的水平進(jìn)行測(cè)定，本研究采用由低到高10、100、1 000 μg·mL?1的外泌體濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，Exo-CP 低濃度誘導(dǎo)即與Con‐trol 組產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而中、高濃度組和RANKL+M-CSF 陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)破骨分化基因表達(dá)水平的上調(diào)作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)破骨細(xì)胞分化相關(guān)通路的蛋白水平檢測(cè)中，檢測(cè)到TNF 信號(hào)通路的TNF-α 受體相關(guān)因子TRAF2，NF-κB 信號(hào)通路的IKKβ、NF-κB-p65，以及破骨細(xì)胞特異性膜蛋白Integrin β3，在Exo-CP 誘導(dǎo)下蛋白表達(dá)水平上升，這與蛋白質(zhì)譜分析的富集信號(hào)通路是一致的。此外，TRAP 染色結(jié)果觀察到Exo 濃度對(duì)RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響，高濃度Exo 處理后細(xì)胞偽足擴(kuò)張，根據(jù)以往研究，分析該現(xiàn)象可能是RAW264.7 細(xì)胞對(duì)Exo 的內(nèi)化伴隨著吞噬行為[25]，進(jìn)而因吞噬抗原而刺激活化，促使細(xì)胞分化出偽足[26]。而Exo-WT 較Exo-CT 更加促進(jìn)細(xì)胞偽足伸長(zhǎng)，可能和Exo膜蛋白以及Exo蛋白成分相關(guān)，其具體原因有待深入探索。

本研究尚存在值得進(jìn)一步深入探索的問(wèn)題，對(duì)于Exo所含成分的分析，本研究主要根據(jù)旁分泌途徑影響生物學(xué)行為的觀點(diǎn)出發(fā)，關(guān)注了Exo的蛋白組分，而對(duì)于核酸如mRNA、miRNA、lncRNA等未能一一進(jìn)行檢測(cè)。此外，本研究明確了PDLSCs-CP Exo 對(duì)破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，是導(dǎo)致CP 牙槽骨吸收的病理因素之一，但在體內(nèi)環(huán)境中，因PDLSCs Exo 引起的破骨細(xì)胞激活是否主導(dǎo)慢性牙周炎牙槽骨吸收的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

本研究初步分析了CP 中PDLSCs 細(xì)胞Exo 的蛋白組分，及其對(duì)RAW264.7 破骨細(xì)胞分化的影響。相對(duì)于PDLSCs-WT Exo，PDLSCs-CP Exo 富含RANKL和TNF-α，可通過(guò)激活TNF和NF-κB 相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。本研究為PDLSCs Exo 通過(guò)遞送RANKL 和TNF-α，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致慢性牙周炎的病理性骨吸收，提供了新的視角和思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。