井波鑫，張 彥，王 森，武選民

（1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西省西安市冶金醫(yī)院，陜西 西安 710077；3.陜西省西安風(fēng)吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，陜西 西安 710065）

紫蘇為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉、莖、干燥成熟果實(shí)[1]。一年生草本，分布于中國(guó)、不丹、印度、印度尼西亞、日本、朝鮮等國(guó)家。我國(guó)各地廣泛栽培。紫蘇既是傳統(tǒng)中藥又是藥食兩用佳品。紫蘇莖梗、葉及果實(shí)均可入藥，紫蘇葉發(fā)汗、解毒，治感冒；紫蘇梗有寬胸理氣、安胎之功；紫蘇子能鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘[2]。食品中用紫蘇葉可增加肉類(lèi)的香味，其辛香氣味的主要來(lái)源為揮發(fā)油，已從紫蘇揮發(fā)油提取物中分離出紫蘇醛、紫蘇醇、薄荷酮、薄荷醇、丁香油酚、白蘇烯酮等活性成分[3]。紫蘇子榨出的蘇子油可供食用，又有防腐作用，在工業(yè)與畜牧生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[4]。中藥浴足包為中藥外洗劑，是用于殺蟲(chóng)止癢的中醫(yī)治療產(chǎn)品。目前市場(chǎng)上的浴足包以苦參等中藥飲片或硫黃等礦物原料為主成分。本研究所用的紫蘇浴足包以紫蘇中藥飲片加工凈選和食品加工時(shí)的殘葉、花托等廢棄物為主要原料，輔以柴胡、丹參等地上部分。該浴足包實(shí)際用于煎煮或浸泡后外洗，但其煎煮浸泡的具體方法并未十分清楚，本研究從抗氧化劑抗菌研究方面為其使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑 紫蘇浴足包（楊凌子蘇生物科技有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)Q/0934szzz001-2020）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)桿菌、銅綠假單胞菌均由西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提供。M-H瓊脂培養(yǎng)基（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司，批號(hào)20201203，直徑90 mm）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司]；阿莫西林膠囊（哈藥集團(tuán)制藥總廠(chǎng)，國(guó)藥準(zhǔn)字H23020932）；抗壞血酸、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇等（均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器及設(shè)備 Read Max 1900/1900Plus型酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）、D3024R型臺(tái)式高速（冷凍型）微量離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份有限公司]、SXKW數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)）、H H-S6型電熱恒溫水浴鍋（上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司）、KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）、SQP分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、BOV101-70-Ⅱ型鼓風(fēng)干燥箱（中華人民共和國(guó)上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠(chǎng)）、96孔板（廣州潔特生物過(guò)濾制品有限公司）等。

2 方法

2.1 紫蘇浴足包樣品提取液的制備 紫蘇浴足包浸泡法提取液:取1袋紫蘇浴足包（20 g）在1 L 100℃的蒸餾水中浸泡，10 min后過(guò)濾獲得浸泡法提取液，放至常溫。紫蘇浴足包煎煮法提取液:取1袋紫蘇浴足包（20 g）在1 L 100℃蒸餾水中煎煮，5 min后過(guò)濾獲得煎煮法提取液，放至常溫。兩種紫蘇浴足包提取液濃度約為0.02 g/m L。

2.2 紫蘇浴足包的抗氧化活性測(cè)定[5-7]

2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 將兩種樣品提取液分別與0.3 mmol/L DPPH溶液混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min。采用酶標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定吸光度，于517 nm處測(cè)吸光值。蒸餾水與DPPH溶液混合反應(yīng)作為陰性對(duì)照；抗壞血酸與DPPH溶液混合反應(yīng)作為陽(yáng)性對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)3次，取平均值并求方差。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率＝[（A陰－A測(cè)）/（A陰－A陽(yáng)）]×100%。式中A測(cè)、A陰、A陽(yáng)分別為樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。

兩種紫蘇浴足包提取液分別定至0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/m L，測(cè)定各濃度下 DPPH 自由基清除率，并計(jì)算半抑制濃度（IC50）值。

2.2.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定 取3.840 g ABTS粉末溶于1 L無(wú)水乙醇中，得到7 mmol/L ABTS無(wú)水乙醇溶液。取5.406 4 g過(guò)硫酸鉀粉末溶于1 L蒸餾水中，得到20 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液。將ABTS無(wú)水乙醇溶液與過(guò)硫酸鉀水溶液混合，避光常溫反應(yīng)12～16 h。將反應(yīng)后的混合溶液用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?43 nm處調(diào)試吸光度，使混合溶液吸光度為（0.30±0.02），此為 ABTS工作液。分別取0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/m L紫蘇浴足包浸泡法提取液和煎煮法提取液6μL，分別與194μL的ABTS工作液混合，避光反應(yīng)6 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。將無(wú)水乙醇與ABTS工作液混合反應(yīng)作為空白組；樣品提取液與蒸餾水混合反應(yīng)作為對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)3次，取平均值并求方差。ABTS自由基清除率的計(jì)算公式如下:

ABTS清除率＝[1－（Ai－Ai0）/A0]×100%。式中A0、Ai0、Ai分別為空白組、對(duì)照組、樣品組的吸光度。

2.2.3 羥自由基清除率測(cè)定 取1.241 g水楊酸粉末溶于1 L無(wú)水乙醇中，得到9 mmol/L水楊酸-無(wú)水乙醇溶液。取1.367 g硫酸亞鐵粉末溶于1 L無(wú)水乙醇中，得到9 mmol/L硫酸亞鐵溶液。取紫蘇浴足包浸泡法提取液、紫蘇浴足包煎煮法提取液各0.4 m L，分別依次加入0.4 m L 9 mmol/L硫酸亞鐵、0.4 m L 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和0.4 m L 9.9 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，37℃下水浴30 min，取混合溶液200μL于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。將加入樣品的量替換成蒸餾水作為空白組；將加入過(guò)氧化氫的量替換成蒸餾水作為對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)3次，取平均值并求方差。羥自由基清除率的計(jì)算公式如下:

從圖5、圖6和圖7所示的特征結(jié)果可以看出，在旋轉(zhuǎn)整流器正常工作、單管開(kāi)路故障和雙管開(kāi)路故障3種情況下，相同信號(hào)分量計(jì)算獲取的能量值差異較明顯，因而可利用上述獲取的故障特征參數(shù)對(duì)同步交流發(fā)電機(jī)旋轉(zhuǎn)整流器實(shí)施故障診斷操作。

羥自由基清除率＝[（1－（A2－A1）/A0]×100%。式中A0、A1、A2分別為空白組、對(duì)照組、樣品組的吸光度。

2.3 紫蘇浴足包的體外抑菌活性測(cè)定[8-9]對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)桿菌、銅綠假單胞菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。先制備瓊脂平板若干（1種菌只需制備1個(gè)平板），取菌液0.2 m L涂布均勻，制成帶菌瓊脂平板。用打孔器打出6 mm直徑的濾紙片，并浸泡在各消毒劑樣品溶液中。陽(yáng)性對(duì)照浸泡于阿莫西林水溶液中。在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h并觀(guān)察抑菌圈的大小以判定消毒劑敏感度和后續(xù)生長(zhǎng)情況。對(duì)有效配方制作濃度梯度判斷是否具有量效關(guān)系。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin 8.5軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 紫蘇浴足包的抗氧化活性結(jié)果

3.1.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果 不論是用浸泡法還是煎煮法的紫蘇浴足包都有一定的抗氧化活性，其中煎煮法清除DPPH較好。同一煎煮時(shí)間下，在0.02～0.08 g/m L濃度下，紫蘇浴足包濃度越高抗氧化活性越好。在0.08～0.32 g/m L濃度下，紫蘇浴足包濃度越高而抗氧化活性越差。見(jiàn)表1。最佳濃度為0.053 g/m L，最高清除率為58.11%。見(jiàn)圖1。紫蘇浴足包煎煮法DPPH自由基清除率的IC50值為35.515 mg/m L。

表1 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品不同濃度DPPH自由基清除率結(jié)果比較(%)

3.1.2 ABTS自由基清除率、羥自由基清除率 煎煮法ABTS自由基清除率較好，而浸泡法的羥自由基清除率較高。見(jiàn)表2。

表2 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品的ABTS自由基清除率、羥自由基清除率比較(%)

3.2 紫蘇浴足包的體外抑菌活性檢查結(jié)果 紫蘇浴足包浸泡法僅在0.02 g/m L濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，而對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門(mén)桿菌無(wú)效。紫蘇浴足包煎煮法僅對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，濃度越大，抑菌活性越低。見(jiàn)表3。

表3 兩種使用方法的紫蘇浴足包樣品不同濃度對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)桿菌的抑制情況比較(mm)

4 結(jié)論

中醫(yī)認(rèn)為，紫蘇葉有發(fā)汗、解表散寒的功效，紫蘇梗有寬中利氣的作用。有文獻(xiàn)提及，藿香正氣方中的紫蘇等成分有抑制葡萄球菌作用[10]。紫蘇浴足包所取紫蘇為地上部分，包括葉、梗、花托等，均打粉入藥。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，無(wú)論是浸泡法還是煎煮法，紫蘇浴足包有一定的抗氧化活性和抑菌活性，推斷可能是紫蘇地上部分中的黃酮、酚酸、揮發(fā)油等成分發(fā)揮作用。紫蘇浴足包外用可抵抗氧自由基減少引起的足部皮膚的衰老，保護(hù)足部皮膚，抑制皮膚致病菌引起的足部病變。

總之，紫蘇浴足包煎煮法抗氧化活性要優(yōu)于浸泡法，煎煮法抑菌活性?xún)?yōu)于浸泡法。本研究煎煮時(shí)間在5 min，最佳濃度為0.053 g/m L左右。紫蘇浴足包對(duì)人體皮膚主要的革蘭氏陽(yáng)性致病菌中的金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，提示臨床可將紫蘇浴足包應(yīng)用于金黃色葡萄球菌引起的皮膚感染疾病，如膿包病、毛囊炎等[11]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為紫蘇浴足包的使用方法提供了有效的依據(jù)。紫蘇浴足包最佳使用方法為煎煮法:用1 L 100℃的蒸餾水煎煮5 min后，再添加適量溫水至合適水溫使用。紫蘇浴足包具有一定的抗氧化和抑菌活性，可使人體足部皮膚光滑，并起到抗衰老和殺菌消毒的作用。本研究目前只做了抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，后續(xù)可對(duì)抗炎活性與機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。人體足部皮膚病也可能是由真菌感染引起的，因時(shí)間有限，本研究未能完成對(duì)真菌的觀(guān)察，后期將繼續(xù)研究。此外，今后還將對(duì)浴足包進(jìn)行劑型改進(jìn)，如浴足液或泡騰片可直接加入至溫水中，省去煎煮步驟，力求使用更加方便；對(duì)紫蘇浴足包助睡眠、預(yù)防高血壓等方面進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)。