張盧慧，趙志強(qiáng)，郭慶元

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。新疆辣椒產(chǎn)業(yè)近年來發(fā)展速度非?？靃2]，2019年新疆產(chǎn)區(qū)年種植辣椒總面積達(dá)到3.67×104hm2。近幾年辣椒病害逐年增加，制約著辣椒的品質(zhì)及產(chǎn)量。發(fā)生于新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)的辣椒細(xì)菌性條斑病是當(dāng)?shù)乩苯飞a(chǎn)中發(fā)生普遍，危害較大的病害?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外已報(bào)道的辣椒細(xì)菌性病害主要有細(xì)菌性瘡痂病、細(xì)菌性葉斑病、軟腐病、青枯病等，陳新等[3]報(bào)道引起辣椒細(xì)菌性瘡痂病的病原菌為野油菜黃單胞桿菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(Doidge)Dye)，該病害主要危害辣椒的葉片、莖、果實(shí)，侵染癥狀為圓形或不規(guī)則性、暗褐色、邊緣隆起中央凹陷的病斑，粗糙呈瘡痂狀，與辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病極為相似。鄧剛[4]報(bào)道引起甘肅張掖地區(qū)番茄細(xì)菌性葉斑病的病原菌為丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyrinagepv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wikie)，該病害主要危害葉片，危害癥狀為葉片產(chǎn)生深褐色至黑色不規(guī)則斑點(diǎn)，果實(shí)呈黑色隆起的小斑點(diǎn)，果實(shí)中央形成木栓化瘡痂，且該病原菌也可侵染辣椒。肖濟(jì)全[5]報(bào)道引起四川省廣元市辣椒軟腐病的病原菌為Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora,該病害主要危害果實(shí)，病果初期出現(xiàn)水漬狀暗綠色斑，后期果實(shí)內(nèi)部腐爛，果皮變白。周安韋[6]報(bào)道引起貴州地區(qū)的辣椒青枯病的病原菌為青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，該病害危害癥狀為初期全株葉片萎蔫，后期整株植株萎蔫枯死?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】針對辣椒細(xì)菌性病害的病原鑒定、致病機(jī)理與防治等進(jìn)行了研究，而關(guān)于主要在果實(shí)上引起條斑的辣椒細(xì)菌性果實(shí)條斑病，尚未見到相關(guān)報(bào)道。2018年在新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種主要引起辣椒細(xì)菌性果實(shí)條斑的病害。該病害主要侵染辣椒果實(shí)、葉柄及嫩莖，以果實(shí)病斑最為顯著，葉片無明顯癥狀，發(fā)病的辣椒果實(shí)表面布有褐色的條形病斑。該病害的發(fā)病癥狀與國內(nèi)外已報(bào)道的辣椒細(xì)菌性病害及辣椒條斑病毒病不同，是一種國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)病害，需進(jìn)行病原鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集田間病樣，采用組織分離純化、柯赫氏法則回接證病、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定的方法，研究發(fā)生于新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)的辣椒細(xì)菌性條斑病的病原，為田間病害規(guī)律為病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年在新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)內(nèi)紅龍23號(hào)品種上發(fā)現(xiàn)一種新的辣椒病害。在新疆巴州和碩縣辣椒種植區(qū)采集的多份辣椒果實(shí)病樣為供試樣品。

供試培養(yǎng)基：NA固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂17 g，蒸餾水1 L，pH調(diào)至7.2。

1.2 方法

1.2.1 噴菌現(xiàn)象觀察

田間采集辣椒病樣用自來水沖洗表面，晾干后切取病健交界處一小塊組織，在載玻片上滴加一滴蒸餾水，切取的組織置于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速將制好的玻片放在顯微鏡下觀察，以確認(rèn)組織切口處是否有大量的細(xì)菌溢出。

1.2.2 病原菌的分離純化

田間采集回的辣椒病樣表面用自來水沖洗1min，用75%的酒精棉球擦拭表面并晾干后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)切取病健交界處一小塊組織(5 mm ×5 mm)，采用平板劃線法[7]分離組織，75%酒精浸泡表面消毒30s，1%次氯酸鈉浸泡表面消毒1 min，無菌水清洗3次，每次沖洗30～40 s，用滅過菌的濾紙吸干組織表面水分，在培養(yǎng)皿加入1 mL的無菌水，將病組織放入培養(yǎng)皿中并將病組織剪碎成小塊，靜置15～20 min，用接種環(huán)蘸取一環(huán)浸泡液進(jìn)行平板劃線，28℃培養(yǎng)2 d后，挑取培養(yǎng)基表面長出的單菌落反復(fù)純化2～3次，純化2～3次后轉(zhuǎn)接到NA斜面試管上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原菌致病性

1.2.3.1 菌懸液制備

采用平板劃線法，將從田間病樣上分離、純化獲得的細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)接于NA 固體培養(yǎng)基平板上，28℃活化培養(yǎng)48 h后，挑取培養(yǎng)基表面長出的單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)液中， 28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用無菌水將培養(yǎng)液稀釋成濃度約為108CFU/mL的菌懸液，供辣椒致病性回接和煙草過敏性反應(yīng)測定用。

1.2.3.2 辣椒致病性回接

從田間采集的辣椒果實(shí)病樣中分離、純化共得到30個(gè)單菌落菌株。對30個(gè)分離菌株采用針刺接種法進(jìn)行的致病性回接。將回接用的離體辣椒果實(shí)表面用自來水沖洗干凈，再用75%的酒精棉球擦拭辣椒表面，待辣椒表面晾干后，用一次性的2.5 mL無菌注射器吸取制備好的菌懸液，用針頭在健康辣椒果實(shí)表面針刺8～9個(gè)孔，在針刺的同時(shí)將菌懸液注入到針刺孔中，以針刺注射無菌水作為對照，將針刺接種后的辣椒果實(shí)及其對照置于有保濕濾紙的發(fā)芽盒中，28℃，恒溫、保濕培養(yǎng)，觀察辣椒果實(shí)表面發(fā)病情況。待辣椒果面發(fā)病后取發(fā)病組織再次組織分離，確認(rèn)接種后致使辣椒果面發(fā)病的菌株是否與所接種的菌株一致。

1.2.3.3 煙草過敏性反應(yīng)

選用室內(nèi)種植的長有5～6片真葉的煙草葉片，用2.5 mL一次性無菌注射器吸取菌懸液，從離體煙草葉片背面針剌接種，以注入無菌水葉片作為對照，接種后的煙草葉片及其對照置于有保濕濾紙的發(fā)芽盒中，28℃，恒溫、保濕培養(yǎng)，觀察煙草葉片接種區(qū)域是否有過敏性枯斑出現(xiàn)，24～48 h內(nèi)產(chǎn)生過敏性枯死斑的為陽性反應(yīng)，72 h后才產(chǎn)生枯死斑的為陰性反應(yīng)。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化反應(yīng)測定

在NA平板培養(yǎng)基上觀察供試菌株菌落特征，通過染色和鏡檢觀察菌體形態(tài)，參照《植物病原細(xì)菌鑒定試驗(yàn)指導(dǎo)》[8]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》[9]測定菌株生理生化指標(biāo)。

1.2.4.2 病原菌分子鑒定1.2.4.2.1 基因組DNA提取

采用文獻(xiàn)已報(bào)道的煮沸法[10]提取菌株的基因組DNA。用無菌槍頭挑取平板培養(yǎng)的單菌落，將單菌落轉(zhuǎn)到加有100 μL ddH2O的1.5 mL離心管中，沸水煮沸10 min，室溫冷卻5 min后，12 000 r/min離心5 min，離心后得到的上清液即為菌株基因組DNA樣品，將其置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2.2 16SrDNA基因擴(kuò)增

采用16SrDNA通用引物27F/1492R[11]對提取出的4個(gè)供試菌株的DNA樣品進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，上游27F序列(5'-3'端):AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游1492R序列(5'-3'端)：GGYTACCTTGTTACGACTT；反應(yīng)體系(25 μL)：2 x SanTaqPCR Mix12.5 μL、DNA模板2 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，擴(kuò)增片段長度為1 500 bp左右。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程進(jìn)行測序。獲得序列后，登錄NCBI網(wǎng)站，將測序獲得的菌株序列進(jìn)行Blast同源性比對，比對后選取同源性高的序列，并從LPSN網(wǎng)站上下載模式菌株，采用 MEGA 7.0 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定病原菌的種。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒細(xì)菌性條斑病癥狀及發(fā)病特點(diǎn)

研究表明，該病害癥狀主要表現(xiàn)在辣椒果實(shí)、葉柄和嫩莖上，葉片無明顯癥狀。該病害在6～7月為高發(fā)期，發(fā)病初期莖部形成水漬狀斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展成褐色條斑。以果實(shí)病斑最為顯著，且在果實(shí)中上部病斑較多，果實(shí)尖端病斑較少。病果實(shí)表面布有幾個(gè)至幾十個(gè)長短不一的黃褐色條形斑，以及尚處于侵染初期的褐色水浸狀斑點(diǎn)，病斑周圍無明顯的黃色暈圈。該病在田間有明顯的由初侵染斑點(diǎn)擴(kuò)展為條斑，由短條斑擴(kuò)展為長條斑的病斑擴(kuò)展過程，有明顯的由輕病情很快擴(kuò)展為重病情的侵染擴(kuò)散現(xiàn)象，有蔭蔽高濕處發(fā)病較重的發(fā)病特點(diǎn)，有明顯的抗性差異，相似環(huán)境下有幾乎不發(fā)病的對該病表現(xiàn)為高抗的辣椒品種。病害樣品經(jīng)室內(nèi)顯微鏡觀察有明顯的噴菌現(xiàn)象，確定其為細(xì)菌性果實(shí)條斑病。圖1

注：a、b:田間自然侵染條件下辣椒表面發(fā)病癥狀；c:回接癥狀；d:CK；e:菌株煙草過敏性反應(yīng)

2.2 病原菌分離及致病菌株篩選

研究表明，有4個(gè)菌株(KHL1、KHL4、KHL6、KHL9)表現(xiàn)出明顯的致病性，接種2 d后果面產(chǎn)生水漬狀小條斑；接種3 d后病斑顏色變深擴(kuò)展成暗褐色長條形斑，病斑周圍無明顯的黃色暈圈；接種7 d后病斑連成片，果實(shí)面腐爛；室內(nèi)針刺接種后的辣椒果面發(fā)病癥狀與田間辣椒果面發(fā)病癥狀相同，而用無菌水針刺的健康辣椒果面無發(fā)病癥狀。從接種發(fā)病病樣上再次分離得到的細(xì)菌形態(tài)特征與所接種的細(xì)菌形態(tài)特征一致；再分離菌株16SrDNA基因測序結(jié)果與所接種菌株16SrDNA基因測序結(jié)果一致，且4個(gè)菌株煙草過敏反應(yīng)測定均為陽性。4個(gè)菌株(KHL1、KHL4、KHL6、KHL9)為辣椒細(xì)菌性條斑病的致病菌。圖2

注：a：菌落在NA培養(yǎng)基上的形態(tài)；b:菌體形態(tài);c:菌體大小

2.3 形態(tài)學(xué)特征及生理生化性狀

研究表明，4個(gè)致病菌株在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)無差異，圓形、黃色、表面光滑有光澤、邊緣整齊，隆起且生長較快。4個(gè)致病菌株菌體為直或稍彎的短桿狀，G-，大小為0.34～0.50 μm×1.35～2.12 μm，有1根極生鞭毛，無莢膜，無芽孢。以4個(gè)菌株接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，不水解明膠?？衫肈-果糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，不可利用麥芽糖、纖維二糖、菊糖、肌醇、木糖醇、山梨醇產(chǎn)酸。表1

表1 供試4個(gè)菌株生理生化特性測定結(jié)果

2.4 病原菌分子鑒定

研究表明，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均獲得1 500 bp左右的目標(biāo)條帶，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測序，其擴(kuò)增片段大小分別為1 468、1 434、1 440和1 438 bp。將測序得到的4個(gè)菌株的核苷酸序列提交到GenBank中，分別獲得登錄號(hào)MW084715、MW084716、MW084717、MW084718。4個(gè)分離菌株均與P.argentinensis(登錄號(hào)：AY691189.2)、P.argentinensis(登錄號(hào)：NR043115.1)、P.argentinensisCH01T (登錄號(hào)：AY691188)聚在一個(gè)進(jìn)化發(fā)育分支中，與模式菌株P(guān).argentinensisCH01T (AY691188)的相似性達(dá)到了99.2 %。菌株KHL-1、KHL-4、KHL-6、KHL-9鑒定為P.argentinensis。圖3，圖4

注：M:2000 D Ladder marker；1-4：菌株KHL1、KHL4、KHL6、KHL9 16SrDNA擴(kuò)增結(jié)果；CK:陰性對照

圖4 供試菌株KHL1、KHL4、KHL6、KHL9基于16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

盛強(qiáng)[12]、鄧剛[13]、管晶晶[14]、Gappa-Adachi等[15]對不同地區(qū)發(fā)生的辣椒細(xì)菌性葉斑病的病原進(jìn)行了鑒定，分別報(bào)道為黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)、丁香假單胞菌甜菜致病變種(Pseudomonassy-ringaepv. Aptata)、丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringae)、菊苣假單胞菌(Pseudomonaschicory)等病原細(xì)菌。在澳大利亞、美國、印度等國家，以及中國東北、內(nèi)蒙古、山西、北京等地均有野油菜黃單胞桿菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria)引起的辣椒細(xì)菌性瘡痂病的報(bào)道[16-18]。辣椒細(xì)菌性病害可由多種細(xì)菌性病原菌引起。孫福在等[19]報(bào)道細(xì)菌性葉斑病在辣椒莖稈及果實(shí)上的侵染癥狀主要表現(xiàn)為凸起的黑色斑點(diǎn)。Scott J W等[20]報(bào)道細(xì)菌性瘡痂病在辣椒果實(shí)上侵染癥狀為圓形或近圓形的黑色瘡痂斑，研究中新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌性條斑病在果實(shí)及莖稈上的侵染癥狀主要為褐色條形斑，病斑不凸起，與前人報(bào)道的辣椒細(xì)菌性病害有所不同，而國內(nèi)文獻(xiàn)尚未有對該病害的報(bào)道。

Alvaro Peix等[21]于2005年從阿根廷科爾多瓦的土壤樣本中分離出一種新的假單胞菌屬物種，通過形態(tài)特征、生理生化測定結(jié)合分子鑒定方法將該物種鑒定為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)。該菌具有多樣性和廣泛性，可以從植物、土壤、動(dòng)物、人體分離出來[22-24]。Pallavi Mansotra[25]、Manisha Phour等[26]研究報(bào)道該菌有增強(qiáng)植物的抗病性，促進(jìn)作物在鹽脅迫下生長的功能，被作為PGPR菌株研究應(yīng)用。Hariharan H等[27]報(bào)道該菌可以從動(dòng)物的口腔中分離出來，能夠感染動(dòng)物引發(fā)腦膜炎、腹膜炎等。Sameer A等[28]于2014年首次報(bào)道該菌從人體感染的皮膚中分離出來，造成人體皮膚感染。阿根廷假單胞菌作為一種致病菌，能夠侵染動(dòng)物、人體，但引起植物侵染的病害少有報(bào)道，研究中引起辣椒侵染的阿根廷假單胞菌是否與引起人體、動(dòng)物侵染的致病菌具有一樣的特性，還有待于進(jìn)一步的研究。

致病菌株除了利用乳糖、蔗糖產(chǎn)酸結(jié)果不同外，其它生理生化特性結(jié)果均與阿根廷假單胞菌一致，可能與在不同環(huán)境中分離有關(guān)。在田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的辣椒種植區(qū)栽植密度過大，尤其在一膜四行的中間行下部較為蔭蔽，不利于通過風(fēng)、透氣、降溫，不利于作物的光合作用的地方，易造成病菌的侵入和感染；并且該種植區(qū)連續(xù)十幾年種植辣椒，長期單一連作會(huì)導(dǎo)致土壤中的有害菌的種類和數(shù)量增加，對植物易造成侵染。這些因素可能是造成該病害發(fā)生的因素，關(guān)于該病害的發(fā)病規(guī)律、寄主范圍等是今后研究工作的重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

根據(jù)病害癥狀特點(diǎn)及田間發(fā)病特點(diǎn)和噴菌現(xiàn)象確定發(fā)生在新疆巴音郭楞蒙古自治州和碩縣辣椒種植區(qū)的辣椒病害為細(xì)菌性病害，是發(fā)生在辣椒上的一種新病害，擬以“辣椒細(xì)菌性果實(shí)條斑病”為病害名稱。經(jīng)組織分離、純化、致病性測定形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定該病病原菌為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)。