王華坤， 肖方靜， 賓萬娟， 傅春青， 尹 麗,2*

( 1. 玉林師范學院 生物與制藥學院, 廣西 玉林 537000; 2. 玉林師范學院地產(chǎn)藥用資源開發(fā)與生物工程技術中心, 廣西 玉林 537000 )

類風濕性關節(jié)炎又稱類風濕(rheumatoid arthritis, RA)，是一種病因未明的以關節(jié)滑膜炎癥病變?yōu)橹鞯娜硇月约膊?，滑膜炎癥、關節(jié)腫脹疼痛、軟骨和骨損壞、功能受限為主要癥狀(Kowalik et al., 2018; Zulfiqar et al., 2019; Pandey et al., 2019)，RA影響患者的生命周期、治療周期長且醫(yī)療費用較高。臨床上用于治療RA藥物主要有非甾體類抗炎(NSAIDS) (Zavodovsky & Sivordova, 2018; Malano & Strusberg, 2019; Abbasi et al., 2019)、改善病情抗風濕藥(DMARDs)(Roodenrijs et al., 2018; Cacciapaglia et al., 2018; Khilfeh et al., 2019)、糖皮質(zhì)激素(George & Baker,2019; Lillegraven et al., 2019)、生物劑制(Aletaha & Smolen, 2018)等，能夠改善僵硬及減緩痛楚，但常出現(xiàn)物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂、免疫耐受及胃腸道方面的副作用，不宜長期用藥(Krüger, 2018; Wilson et al., 2019)。因此，研究人員將重點轉向傳統(tǒng)中藥及方劑，篩選藥性溫和、毒副作用少、活性成分和作用機制比較明確的中藥緩解病患痛苦。

半楓荷()為金縷梅科半楓荷屬，全株入藥，是中國特有的單種屬植物(國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會, 1999)。藥用半楓荷始載于《嶺南采藥錄》，具有活血化瘀止痛、溫經(jīng)散寒除濕的作用(南京中醫(yī)藥大學, 2006)，主治“肢體麻痹、風濕腰腿痛、跌打損傷、關節(jié)不利、半身不遂、產(chǎn)后風癱”等，為民間驗方的組成之一，廣泛使用于苗族、瑤族、畬族、壯族等多個民族，有著悠久的臨床用藥歷史和確切的療效(中國科學院中國植物志編輯委員會, 1984; 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會, 1999; 中國科學院廣西植物研究所, 2005)。廣西壯族民間用半楓荷煎湯當茶飲，治療類風濕性關節(jié)炎療效甚佳，臨床上以金縷梅科半楓荷最為常用且抗風濕效果最佳(Liang et al., 2015; Yang et al., 2016)。由于半楓荷資源稀少，分布零散，所以目前對半楓荷的研究屬于起步階段。葉興狀等(2020)分析了半楓荷轉錄組中的SSR位點信息，為分子標記輔助育種提供參考。田曉明等(2018，2021)先后采用UPLC-QTOF/MS分析半楓荷根不同部位化學成分及半楓荷不同組織間差異代謝物，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸、膽酸、白藜蘆醇和7-羰基豆甾醇等化學成分在根皮中含量最高，不同組織中差異萜類化合物主要為三萜化合物。廖娜等(2019)成功制備金縷半楓荷的總多酚并證實其具有顯著的抗菌、抗氧化能力。蔣楊等(2021)發(fā)現(xiàn)半楓荷的水、醇提取物對小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用。目前，關于半楓荷的研究主要涉及遺傳育種、化學成分和藥理活性等方面，鮮少涉及代謝組學領域。

代謝組學可用于研究RA疾病特征和發(fā)病機制(Ma et al., 2018)，采用代謝組學和動物病癥模型相互結合的研究思路和方法，偏重應用現(xiàn)代分析手段考察類風濕性關節(jié)炎發(fā)展進程中的內(nèi)源性小分子代謝物，闡明疾病發(fā)病機制和藥物作用機制。本課題組前期通過圖譜指認以及文獻調(diào)研(梁偉紅等,2015; 盧海嘯等, 2015)，明確了半楓荷抗類風濕性關節(jié)炎的藥用部位為半楓荷根，抗炎鎮(zhèn)痛天然活性物質(zhì)含量豐富。同時，采用弗氏完全佐劑(CFA)誘導的大鼠類風濕性關節(jié)炎模型，以足腫脹、關節(jié)炎指數(shù)、大鼠體重增加、免疫器官指數(shù)、外周血液單核細胞中環(huán)氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧合酶(5-LOX)表達水平及大鼠血清中炎性細胞因子表達為依據(jù)，初步證實半楓荷根正丁醇提取部位高劑量組具有顯著的抗RA活性。半楓荷在廣西少數(shù)民族地區(qū)使用廣泛且療效確切，但活性成分及作用機制不清，為了進一步闡明該壯藥對RA調(diào)控作用，本研究借助UPLC/QTOF-MS對半楓荷根活性部位提取物給藥前后RA模型大鼠血漿進行非靶向代謝組學分析，擬探討以下問題：(1) 大鼠給藥組和模型組血漿是否存在差異代謝物；(2) 差異代謝物富集在哪些信號通路；(3) 半楓荷正丁醇提取物主要通過調(diào)節(jié)哪些內(nèi)源性代謝物水平從而調(diào)控RA。以期從內(nèi)源性代謝物的角度為半楓荷根抗RA的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

半楓荷 ()由玉林師范學院盧海嘯教授采集并鑒定為金縷梅科半楓荷屬植物半楓荷的干燥根。本課題組前期實驗結果顯示半楓荷根正丁醇提取部位高劑量組具有顯著的抗RA活性，故選其作為該文實驗用藥。提取方法：干燥的半楓荷根藥材經(jīng)粉碎過篩，選用75%乙醇回流提取2～3次，每次0.5～1.5 h，合并提取液，減壓濃縮得到浸膏，用水混懸后正丁醇進行萃取，合并3次萃取液用旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑并濃縮為稠浸膏即得，出膏率為10.67%。

1.2 動物

SPF級健康SD種雄性大鼠，體重(250±1) g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心 [許可證號：SCXK(桂)2014-0002]。飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，相對濕度：55%～70%。

1.3 試劑與儀器

ACQUITY UPLCBEH HILIC色譜柱(美國Waters公司)；Triple TOF 6600+四級桿高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司)；Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀和SHZ-D (III)循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；DZKW-S-8型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；FW100型高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；Micro21R型臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；ZNCL-T型電熱套(上?？粕齼x器有限公司)；ABS型小動物氣體麻醉機(上海玉研科學儀器有限公司)；色譜純甲醇和乙腈(德國Merck公司)；弗氏完全佐劑(美國Sigma-Aldrich公司)；Milli-Q 純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.4 方法

1.4.1動物給藥及樣品采集 24只雄性SD大鼠隨機分為兩組：模型組和給藥1 h組(經(jīng)預實驗，選用半楓荷根正丁醇提取液給藥1 h后取血)，=12；大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL CFA致炎造模，給藥前12 h禁食不禁水。根據(jù)前期試驗結果，半楓荷根正丁醇提取液給藥劑量按5.4 g·kg體重計算，模型組給予等體積生理鹽水；大鼠灌胃給藥1次，給藥后1 h后麻醉大鼠并經(jīng)肝門靜脈采集血樣，模型組同法操作；用抗凝管采血，4 ℃ 4 000 r·min離心15 min，收集血漿并分裝于離心管，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

1.4.2 樣本處理 吸取血漿100 μL置于不含抗凝劑的無菌Ep管中，加適量經(jīng)預冷處理的甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，v/v)，渦旋混勻后低溫超聲處理30 min，-20 ℃ 條件下放置10 min，4 ℃條件下以14 000離心20 min，真空干燥上清液，分析前加乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，v/v)100 μL復溶，4 ℃ 條件下以14 000離心 15 min，取上清液5 μL進樣分析。質(zhì)控(quality control，QC)樣本為所有血漿樣本混合后取100 μL，同法處理。

1.4.3 數(shù)據(jù)采集 樣品采用 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)配合ESI源，ACQUITY UPLCBEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)在正負離子模式下進行數(shù)據(jù)采集。柱溫 25 ℃；流速0.5 mL·min；進樣量2 μL；流動相組成A為水+25 mmol·L乙酸銨+25 mmol·L氨水，B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B從 95%線性變化至65%；7～8 min，B從65%線性變化至40%；8～9 min，B維持在40%；9～9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1～12 min，B維持在95%。HILIC 色譜分離后的 ESI 源條件如下：質(zhì)譜參數(shù)為霧化氣(GS1) 60 psi，輔助加熱氣(GS2) 60 psi，氣簾氣(CUR) 30 psi，溫度(TEM) 600 ℃，毛細管電壓(IS)±5 500 V(正負兩種模式)；TOF MS 掃描范圍為60～1 000 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍為25～1 000 Da，TOF MS 掃描累積時間為0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時間為0.05 s/spectra；二級質(zhì)譜采用信息依賴型獲取模式(IDA)獲得，并且采用超高靈敏度模式，去簇電壓(DP)±60 V(正負兩種模式)，CES碰撞能力疊加(35±15) eV。IDA 設置如下：排除4 Da內(nèi)的同位素，每個循環(huán)監(jiān)測的候選離子：10。采取隨機順序進行樣本連續(xù)分析，可以避免儀器檢測信號波動帶來的影響，取等量的各組樣品混合作為質(zhì)控樣本，每運行6個樣本采集一次質(zhì)控樣本，以評價和監(jiān)測系統(tǒng)穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)可靠性。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 UPLC/QTOF-MS導出原始數(shù)據(jù)，使用Progenesis(V2.3，UK)軟件進行數(shù)據(jù)預處理，去躁、基線校準、峰對齊、峰識別、積分、精確保留時間、計算歸一化峰強度。化合物鑒定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，利用 PeakView(AB SCIEX，USA)提取差異代謝物的二級碎片質(zhì)譜并借助HMDB(Human Metabolome Database)和 METLIN (metlin.scripps.edu)進行鑒定并驗證。所得數(shù)據(jù)矩陣作統(tǒng)計分析，利用 MarkerView(AB SCIEX，USA)進行一級質(zhì)譜的提取，經(jīng)數(shù)據(jù)校正和歸一化后導入SIMCA-P(14.0)進行PCA和OPLS-DA等多維統(tǒng)計分析。根據(jù)變量的VIP(variable importance in projection)>1和|Pcorr|(Pearson correlation)>0.52 為標準，挑選差異代謝物。SPSS(20.0)對篩出的變量進行兩組獨立樣本檢驗，挑選<0.05的代謝物。KEGG pathway(https://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫對血漿樣品差異代謝物作通路富集分析，用獨立樣本檢驗比較給藥前后試驗組的差異。

2 結果與分析

2.1 血漿代謝物定性分析及化學分類歸屬

用UPLC-MS技術對所有血漿樣本進行色譜分離及質(zhì)譜分析，代謝物在正離子和負離子模式下得到很好區(qū)分。通過重疊比較質(zhì)控樣本總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)(圖1)，發(fā)現(xiàn)各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明實驗進程中儀器誤差引起的變異較小。經(jīng)The Human Metabolome Database、Lipidmaps(V2.3)以及METLIN數(shù)據(jù)庫定性分析，正負離子模式合并后共鑒定出321種代謝物，其中負離子模式鑒定出174種代謝物，正離子模式鑒定出192種代謝物。所有鑒定的代謝物(合并正負離子鑒定到的代謝物)根據(jù)其化學分類歸屬信息進行分類統(tǒng)計歸為12種類型：有機酸及衍生物、脂類及類脂分子、有機雜環(huán)化合物、有機含氧化合物、核苷、核苷酸及類似物、苯環(huán)型化合物、有機氮化合物、有機硫化合物、苯丙烷類和聚酮酸類、未分類化合物。分類信息顯示有機酸及其衍生物和脂類及類脂分子這2類代謝物數(shù)量占比均較高，在代謝物中分別占20.87%和15.89%(圖 2)。

圖 1 正離子(A)和負離子(B)模式血漿樣本總離子流圖Fig. 1 LC-MS total ion chromatography (TIC) of plasma samples in ES+ mode (A) and ES- mode (B)

A. 未分類化合物; B. 有機酸及衍生物; C. 脂類及類脂分子; D. 有機雜環(huán)化合物; E. 有機含氧化合物; F. 核苷、核苷酸及類似物; G. 有機含氮化合物; H. 苯環(huán)型化合物; I. 苯丙烷類和聚酮酸類; J. 有機氮化合物; K. 有機硫化合物; L. 苯丙烷類和聚酮酸類/生物堿及衍生物。A. Undefiend; B. Organic acids and derivatives; C. Lipids and lipid-like molecules; D. Organic oheterocyclic compounds; E. Organic oxygen compounds; F. Nucleosides, nucleotides and analog-ues; G. Organic nitrogen compounds; H. Benzenoids; I. Phenylpropanoids and polyketides; J. Organic nonitrogen compounds; K. Organic sulfur compounds; L. Phenylpropanoids and polyketides/alkalo ids and derivatives.圖 2 鑒定的代謝物在各化學分類的數(shù)量占比Fig. 2 Percentage of identified metabolites by chemical classification

2.2 組間差異分析

2.2.1 單變量統(tǒng)計分析 分析給藥組和模型組血漿代謝物差異，主要的單變量統(tǒng)計分析方法包含變異倍數(shù)分析(Fold Change Analysis，F(xiàn)C Analysis)、檢驗/非參檢驗。 單變量分析法對正、負離子模式下得到的所有代謝物(含未被鑒定的代謝物)做差異性分析，采用火山圖(圖3)的形式來進行可視化展示，玫紅色表示FC > 1.5，< 0.05 顯著差異代謝物(上調(diào))，藍色表示FC<0.67，< 0.05 顯著差異代謝物(下調(diào))。

圖 3 正離子(A)和負離子(B)模式火山圖Fig. 3 Volcanic plots of ES+ mode (A) and ES- mode (B)

2.2.2 多元統(tǒng)計分析 非監(jiān)督性的主成分分析(PCA)評價儀器和方法的穩(wěn)定性，分析所有實驗樣本和質(zhì)控樣本提取得到的峰，如圖4：A所示。在PCA圖中，為決定PCA模型質(zhì)量的主要參數(shù)，經(jīng)過7次循環(huán)交互驗證得知(cum)=0.579>0.5，質(zhì)控樣本聚集緊密，顯示采集樣品期間儀器穩(wěn)定、方法穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，可進行下一步分析。另外，PCA圖也顯示給藥組和模型組血漿分離完全，兩組間代謝輪廓間存在顯著性差異，給藥組的代謝差異明顯區(qū)別于模型組。之后建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型驗證給藥組和模型組之間的代謝譜分離狀況。PLS-DA模型參數(shù)(cum)=0.997，(cum)=0.892>0.5，表明模型穩(wěn)定可靠(圖4：B)。為避免在建模過程中發(fā)生模型過擬合，對模型采用置換檢驗以保證模型的有效性。200次檢測結果隨著置換保留度逐漸降低，隨機模型的和均逐漸下降，表明原模型不存在過擬合狀況，模型良好穩(wěn)健，可以據(jù)此結果篩選差異代謝物。借助監(jiān)督性的OPLS-DA分析，進行潛在差異代謝物尋找，給藥組和模型組(圖4：C)分離完全，7次循環(huán)交互驗證和200次響應排序檢驗的結果顯示，(cum)=0.574，(cum)=0.963，=0.841，再次表明給藥前后血漿代謝物之間的差異顯著，OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠。同時，對該模型進行置換檢驗，隨著置換保留度逐漸降低，隨機模型的和均逐漸下降，沒有過擬合(圖4：D)。以上結果說明，在PCA模型、PLS-DA模型和OPLS-DA模型中給藥組和模型組的血漿樣本均存在顯著性差異，所獲得的數(shù)據(jù)可用于差異代謝物的篩選。本試驗以 OPLS-DA VIP>1 和<0.1為顯著差異代謝物篩選標準，最后一共篩選鑒定到12個潛在差異代謝物(表1)，如D-甘露醇、3-甲基組氨酸、二乙醇胺、D-脯氨酸、鞘氨醇、膽酸、DL-苯丙氨酸等。鑒定到的顯著性差異代謝差異倍數(shù)變化以柱狀圖直觀展示(圖5)。各代謝物在給藥組和模型組血漿中的相對水平通過熱圖分析可視化(圖 6)。

A. 總體樣本主成分分析得分圖； B. 偏最小二乘判別分析平面散點圖； C. 正交偏最小二乘判別分析得分圖； D. 正交偏最小二乘判別分析模型置換檢驗結果圖。A. Score plot for PCA model; B. Score plot for PLS-DA mode; C. Score plot for OPLS-DA model; D. Validation plot of OPLS-DA model.圖 4 給藥組和模型組血漿代謝物多維統(tǒng)計分析結果Fig. 4 Multivariate statistical analysis of plasma metabolites in administration and model groups

表 1 正離子模式顯著性差異代謝物表Table 1 Metabolite table with significant difference in positive ion mode

A. 四氫巴豆甾酮; B. L-色氨酸; C. ?；蛆Z(去氧)膽酸; D. 1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿; E. N-二十二碳酰-4-鞘氨醇-1-O-磷酰膽堿; F. 1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺; G. 1-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油; H. 1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿; I. 甜菜堿; J. 二甲基砜; K. 牛膽素; L. L-苯丙氨酸; M. 尿素; N. L-組氨酸; O. 肌酸; P. 2-乙氧基乙醇; Q. 神經(jīng)鞘氨醇; R. 3-羥基丁酸乙酯; S. 泛酸酯; T. L-纈氨酸; U. 煙酰胺; V. 甜菜醛; W. 尿嘧啶; X. 皮質(zhì)酮; Y. 二乙醇胺; Z. (3-羧基丙基)三甲基銨陽離子; a. 1-甲基煙酰胺; b. 氧化三甲胺; c. 2-甲基丁基肉堿; d. 膽酸。A. Tetrahydrocroticosterone; B. L-tryptophan; C. Taurochenodeoxycholate; D. 1-Stearoyl- 2- oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (SOPC); E. N-Docosanoyl-4-sphingenyl-1-O-phosphorylcho-line; F. 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; G. 1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol; H. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine; I. Betaine; J. Dimethyl sulf one; K. Taurine; L. L-Phenylalanine; M. Urea; N. L-Histidine; O. Creatine; P. 2-Ethoxyethanol; Q. Sphingosine; R. Ethyl 3-hydroxybutyrate; S. Pantothenate; T. L-valine; U. Nicotinamide; V. Betaine aldehyde; W. Uracil; X. Corticosterone; Y. Diethanolamine; Z. (3-Carboxypropyl) trimethylammonium cation; a. 1-Methylnicotinamide; b. Trimethylamine N-oxide; c. 2-Methyl butyroyl carnitine; d. Cholic acid.圖 5 顯著性差異代謝物表達差異倍數(shù)分析Fig. 5 Difference multiple analysis of significant metabolites expression

A. 甜菜堿; B. 1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺; C. ?；蛆Z膽酸鹽; D. 1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿; E. L-色氨酸; F. 四氫巴豆甾酮; G. 1-硬脂酰-2-花生四烯醇-sn-甘油; H. 1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿; I. N-二十二碳酰-4-鞘氨醇-1-O-磷酰膽堿; J. L-纈氨酸; K. 牛膽素; L. 泛酸酯; M. 甜菜醛; N. 二乙醇胺; O. 2-乙氧基乙醇; P. 3-羥基丁酸乙酯; Q. L-組氨酸; R. 2-甲基丁基肉堿; S. 1-甲基煙酰胺; T. 膽酸; U. 尿嘧啶; V. 氧化三甲胺; W. 尿素; X. (3-羧基丙基)三甲基銨陽離子; Y. 肌酸; Z. 煙酰胺; a. 皮質(zhì)酮; b. L-苯丙氨酸; c. 神經(jīng)鞘氨醇; d. 二甲基砜。A. Betaine; B. 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; C. Taurochenode- oxycholate; D. 1-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphocholine(SOPC); E. L-tryptophan; F. Tet-ahydrocroticosterone; G. 1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol; H. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero- 3-phosphatidylcholine; I. N-docosanoyl-4-sphingenyl-1-O-phosphorylcholine; J. L-valine; K. Taurine; L. Pantothenate; M. Betaine aldehyde; N. Diethanolamine; O. 2-Ethoxyethanol; P. Ethyl 3-hydroxy- butyrate; Q. L-histidine; R. 2-Methylbutyroylcarnitine; S. 1-Methylnicotinamide; T. Cholic acid; U. Uracil; V. Trimethylamine N-oxide; W. Urea; X. (3-Carboxypropyl)trimethylammonium cation; Y. Creatine; Z. Nicotinamide; a. Corticosterone; b. L-phenylalanine; c. Sphingosine; d. Dimethyl sulfone.圖 6 大鼠模型組和給藥組血漿差異代謝物熱圖分析Fig. 6 Heat map of difference metabolites of plasma differential metabolites in model and administration groups

2.3 差異代謝物通路富集

通路富集分析得知12種差異代謝物的37個通路有顯著性差異(<0.05)。以氣泡圖形式呈現(xiàn)代謝通路富集分析結果(圖7)， 以橫坐標和氣泡大小的形式體現(xiàn)代謝通路的影響因子大小，氣泡大小與影響因子成正比；以縱坐標和氣泡顏色示意富集分析的值，顏色越深值越小，富集程度越顯著。通路富集表明， 氨基酸代謝通路較為豐富，分別為甘氨酸，絲氨酸與蘇氨酸代謝、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、-丙氨酸代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，蛋白質(zhì)的消化和吸收、腫瘤膽堿代謝通路和ABC轉運蛋白富集到的差異代謝物數(shù)量最多。37個通路均表現(xiàn)為顯著上調(diào)(表2)。

A. EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥; B. 癌癥膽堿代謝; C. 非洲錐蟲病; D. 脂肪細胞脂解; E. 鞘脂信號通路; F. 癌癥中樞碳代謝; G. 蛋白質(zhì)消化吸收; H. 逆行內(nèi)酰苷信號; I. 礦質(zhì)吸收; J. 泛酸和輔酶A生物合成; K. β-丙氨酸代謝; L. 醛固酮合成和分泌; M. 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; N. 氨酰tRNA生物合成; O. 初級膽汁酸生物合成; P. 嘧啶代謝; Q. 甘油磷脂代謝; R. 脂肪酸生物合成; S. ABC轉運蛋白; T. 膽汁分泌。A. EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance; B. Choline metabolism in cancer; C. African trypanosomiasis; D. Regulation of lipolysis in adipocytes; E. Sphingolipid signaling pathway; F. Central carbon metabolism in cancer; G. Protein digestion and absorption; H. Retrograde endocannabinoid signaling; I. Mineral absorption; J. Pantothenate and CoA biosynthesis; K. β-Alanine metabolism; L. Aldosterone synthesis and secretion; M. Glycine,serine and threonine metabolism; N. Aminoacyl-tRNA biosynthesis; O. Primary bile acid biosynthesis; P. Pyrimidine metabolism; Q. Glycerophospholipid metabolism; R. Fatty acid biosynthesis; S. ABC transporters; T. Bile secretion.圖 7 大鼠給藥組和模型組血漿差異代謝物KEGG通路富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of plasma differential metabolites in administration and model groups

表 2 大鼠給藥組和模型組KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathways of administration and model groups

3 討論與結論

針對鑒定得到的半楓荷活性部位調(diào)控疾病的差異代謝物及通路進行分析，可知佐劑型關節(jié)炎代謝異?；衔锏姆N類錯綜復雜，涉及的代謝通路多且富集在脂類代謝和氨基酸代謝通路。半楓荷根正丁醇提取物主要影響氨基酸(如苯丙氨酸、脯氨酸、組氨酸和色氨酸等)、嘧啶(尿嘧啶)和脂類代謝產(chǎn)物(1-硬脂酰-2-花生四烯酰--甘油、二乙醇胺、神經(jīng)鞘氨醇、D-甘露醇、1-硬脂酰-2-烯酰--甘油3-磷酸膽堿等)等內(nèi)源性代謝物的表達水平。本研究表明，氨基酸、神經(jīng)鞘氨醇、磷脂等內(nèi)源性代謝物體內(nèi)表達量與RA疾病發(fā)展息息相關，氨基酸代謝紊亂直接影響RA疾病進展。多種氨基酸介導炎癥因子的產(chǎn)生，導致體內(nèi)氨基酸水平甚至能夠調(diào)控疾病疼痛程度。色氨酸可反映膝關節(jié)骨關節(jié)炎的存在和嚴重程度，色氨酸代謝增加，提示其機體內(nèi)存在炎癥反應。色胺酰-tRNA合成酶 (tryptophanyl-tRNA-synthetase，TTS)能介導色氨酸與tRNA特異性結合，催化合成的色胺酰-tRNA復合物直接構成了蛋白質(zhì)合成的色氨酸儲存庫，在局部組織內(nèi)激發(fā)色氨酸水平升高，進而刺激淋巴細胞的增殖和分化。外周血微環(huán)境中的色氨酸代謝途徑失衡可通過激活RA患者自身反應性免疫細胞破壞自身組織，導致RA發(fā)病(Han et al., 2017)。陳雙雙等(2020)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥方法治療前、后，RA患者血清中的游離氨基酸表達水平具有顯著性差異，治療后患者血清谷氨酸、天冬氨酸及苯丙氨酸水平降低，-氨基酸、亮氨酸、色氨酸、?；撬峒案拾彼岬乃缴呙黠@，提示蛋白分解代謝增強，本實驗研究結果與這些報道一致。3-甲基組氨酸為多肽鏈上的組氨酸經(jīng)過甲基化所得的產(chǎn)物，屬于動物骨骼肌蛋白分解代謝產(chǎn)物之一(Kochlik et al., 2018)，可參與蛋白質(zhì)消化吸收代謝，組氨酸能夠治療心臟病、貧血、風濕性關節(jié)炎等，RA患者適量多食用富含組氨酸食物有益于關節(jié)健康。本研究中半楓荷根正丁醇提取物降低了大鼠血漿中的3-甲基組氨酸含量，推測其通過抑制大鼠骨骼肌蛋白分解代謝，調(diào)控能量代謝，進而調(diào)節(jié)肌肉收縮功能障礙等原因，改善了給藥組大鼠類風濕性關節(jié)炎癥狀。神經(jīng)酰胺是炎癥關鍵信號分子，神經(jīng)鞘氨醇是神經(jīng)酰胺細胞內(nèi)的合成原料來源之一，被認為是細胞凋亡信號傳導的一個機械性途徑(mechanistic pathway)(Goins & Spassieva, 2018)。本研究表明鞘氨醇在給藥組和模型組之間存在差異，給藥組血漿內(nèi)鞘氨醇水平降低，參與蛋白質(zhì)消化吸收通路，表明鞘氨醇合成大量神經(jīng)酰胺對炎癥反應進行應答。D-甘露醇和D-脯氨酸參加ABC轉運蛋白代謝通路，其作為滲透性脫水劑迅速提高血漿滲透壓并能誘導細胞凋謝，兩者水平在給藥大鼠體內(nèi)下調(diào)，緩解了體內(nèi)血液滲透壓，從而使半楓荷根正丁醇提取物達到改善關節(jié)炎的效果。文獻顯示，RA發(fā)病與體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常同樣存在密切關系。日常餐飲中改變脂肪成分能夠影響機體內(nèi)細胞膜脂肪酸構成，包括細胞免疫系統(tǒng)，而這些變化也可以改變膜的功能，進而影響風濕性疾病的發(fā)生和發(fā)展。脂肪酸的免疫調(diào)節(jié)功能參與代謝和免疫之間的相關性，作為一種信號分子，通過多種方式參與炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路，誘發(fā)炎癥反應(Tong & Zhou, 2018)。Pang等(2018)采用血漿代謝組學技術評估CIA大鼠代謝變化，同樣得出RA發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常相關這一結論。鞘氨醇等鞘脂代謝物參與RA等疾病的發(fā)展過程，調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥反應，揭示了本研究結果中RA模型組和給藥組血漿內(nèi)脂質(zhì)代謝物表達差異的原因。本研究從內(nèi)源性代謝物角度科學合理地解釋半楓荷根正丁醇提取物對RA的調(diào)控方式，主要是通過調(diào)節(jié)與疾病發(fā)生密切相關的氨基酸和脂類等異常代謝物的表達水平而發(fā)揮作用。本研究結果可為半楓荷藥用資源的深入開發(fā)提供新研究策略。