高漸飛， 周 瑋， 劉 妮， 楊 艷

( 1. 貴州科學(xué)院/貴州省山地資源研究所， 貴陽 550001； 2. 貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴陽 550008； 3. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550014 )

黑老虎()又名冷飯團(tuán)、布福娜、大葉五味子等，為多年生常綠木質(zhì)藤本植物，南五味子屬五味子科，分布于貴州、廣西、云南等地。其根莖俗稱大血藤，是一種重要的中藥材，用于治療胃腸潰瘍、急性腸胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛等(國家中醫(yī)藥管理局，1999；舒永志等，2011)，由于具有抗氧化、抗腫瘤、抗HIV、保肝、調(diào)節(jié)血脂等作用(Puet al., 2008;Ban et al., 2009; 延在昊等，2013；Ma et al., 2014)，因此受到廣泛關(guān)注。黑老虎藥用部位除主要成分為木脂類和三萜類外，還有一些倍半萜類、甾體類和氨基酸等(舒永志等，2012)，總木脂素含量為0.93%～2.11%。目前，已從中分離得到南五味子素、冷飯團(tuán)素、異戊?；?日本南味子木脂素 A等70余種木脂素類化合物，緋紅南五味子酮A和B、黑老虎酸等80余種三萜類化合物(舒永志等，2012；段林坪，2018；李力等，2020)。同時，倍半萜、甾體類化合物、原兒茶酸、香草酸等成分逐步被分離鑒定，揮發(fā)油中的主要成分(烯類、醇和烴類)也相繼被檢出(李昕等，2014；楊艷和高漸飛，2018)。

黃酮類化合物是藥用植物的主要活性成分之一，具有重要的生物活性和藥理作用，在藥物和食品保健領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛(文開新等，2010；蘇明媛等，2011；Roohbakhsh et al., 2015; 鄒麗秋等，2016)。關(guān)于黑老虎藥用和非藥用部位的類黃酮多樣性和豐度的代謝組學(xué)信息還鮮有報道。代謝組學(xué)通過高通量化學(xué)分析技術(shù)對生物樣品中的小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，能夠直接反映生命體終端和表型信息，已應(yīng)用于解析植物不同的階段、組織、加工方式中物質(zhì)的變化規(guī)律(錢瑞等，2019；孫偉麗等，2019；方賢勝等，2020；戴宇樵等，2020)。利用廣泛靶向代謝組學(xué)方法，鑒定黑老虎植株葉、莖、根中的代謝物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)配置進(jìn)行歸類，解析黃酮類成分在不同部位的富集格局，旨在闡明葉和莖中與根類似或高度富集物質(zhì)，為挖掘黑老虎的利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和提取方法

所用黑老虎為人工栽培，所處環(huán)境為80%遮陽網(wǎng)塑料大棚，位于貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)普渡村，定期修剪管理、長勢良好，栽培6 a，藤蔓已木質(zhì)化。2020年7月29日，選3株長勢較為接近的植株進(jìn)行取樣。用小鏟子輔助刨開土壤，每株剪下2～3個主根及細(xì)根作為根部樣品，2～3個地表以上約10 cm起的主蔓之一為其莖部，5～6片中下部長勢較好的成熟葉片作為葉；分別用10 mL凍存管取3個重復(fù)，分別編號為KR1-3(根)、KS1-3(莖)和KL1-3(葉)；之后，迅速置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)運到-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將3組供試樣品真空冷凍干燥，研磨儀(MM 400，Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀；稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中；每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，置于4 ℃冰箱過夜；離心(轉(zhuǎn)速 12 000 r·min，10 min)后，吸取上清，用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中用于分析。

1.2 色譜質(zhì)譜采集條件

采用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對樣本進(jìn)行物質(zhì)鑒定，液相條件如下。色譜柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm × 100 mm；流動相：A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)；洗脫梯度： 0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)(配備了ESI Turbo離子噴霧接口)檢測電噴霧離子源(ESI)，由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行(Xu et al., 2020)。ESI源操作參數(shù)：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負(fù)離子模式)；離子源氣體I(GS I)，氣體Ⅱ(GS Ⅱ)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60、25.0 psi，參數(shù)設(shè)置為高。

1.3 樣本質(zhì)控

質(zhì)控(quality control，QC)樣本由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每3個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于邁維(武漢)生物技術(shù)有限公司MVDB V 2.0 數(shù)據(jù)庫和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，之后用三重四極質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)定量。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正(Fraga et al., 2010)。采用多元統(tǒng)計分析，對樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)，正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型分析代謝組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步展示各分組之間的差異。OPLS-DA模型的預(yù)測參數(shù)及解讀如Thévenot等(2015)和戴宇樵等(2020)所述。基于OPLS-DA結(jié)果，進(jìn)一步參照差異代謝物篩選方法(戴宇樵等，2020)，按照：(1)選取fold change≥2 和fold change≤0.5 的代謝物為差異顯著；(2)選取VIP≥1 的為差異顯著。同時，將得到的相應(yīng)差異代謝物(differentially accumulating metabolites, DAMs)提交到KEGG網(wǎng)站，進(jìn)行相關(guān)通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控及主成分分析

通過對不同質(zhì)控QC樣本質(zhì)譜檢測分析的MRM代謝物檢測多峰圖(多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC)進(jìn)行重疊展示分析，可以看到重復(fù)樣本不同物質(zhì)的離子峰值重疊性比較好(圖1)，說明實驗過程具有穩(wěn)定性，檢測結(jié)果可靠。

圖 1 MRM代謝物檢測多峰圖Fig. 1 Multimodal diagram of MRM metabolite detection

通過對樣本(包括質(zhì)控樣本)進(jìn)行主成分分析，判別黑老虎的葉(KL1-3)、莖(KS1-3)、根(KR1-3)各樣本組間和組內(nèi)的變異度大小。全部樣本 PCA得分圖(圖 2)結(jié)果顯示，LC-MS分析所得原始數(shù)據(jù)在PC1、PC2兩種主成分中得到良好呈現(xiàn)。由圖2可知，第一主成分的貢獻(xiàn)率為65.3%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為 26.6%，代表2個主成分能夠基本反映檢測樣本的主要特征信息。3組樣本在二維圖上表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明對各樣本數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，各樣本間存在明顯差異。

圖 2 樣本 PCA 得分圖Fig. 2 PCA score chart of samples

2.2 代謝物分析

經(jīng) LC-MS/MS 檢測后，根據(jù)保留時間、質(zhì)荷比及峰強的矩陣進(jìn)行代謝物注釋，鑒定出黑老虎根、莖、葉中代謝物，基于其結(jié)構(gòu)配置進(jìn)行分類。其中，黃酮類化合物有85個，葉、莖和根中分別含有80、73和67個，3個部位均有61個相同的黃酮類化合物(表 1)。進(jìn)一步將檢出的類黃酮分類，包括查耳酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮、黃酮醇、黃酮碳糖苷和黃烷醇類7類，其中以黃酮和黃酮醇占主導(dǎo)，占總數(shù)的54.1%；二氫黃酮醇和黃酮碳糖苷最少，分別為1個和2個。葉和莖中黃酮醇分別為34個和31個，遠(yuǎn)高于根中的22個，黃酮碳糖苷和黃烷醇類數(shù)量相同，其余類數(shù)量較接近(圖3)。這表明黃酮醇數(shù)量分布不均是造成3個部位類黃酮總數(shù)差異的主要原因。

表 1 黑老虎根、莖和葉中黃酮類成分Table 1 Flavonoid compounds in roots, stems and leaves of Kadsura coccinea

續(xù)表1

續(xù)表1

通過離子流強度累計，葉中類黃酮離子流強度24.00 × 10、莖中13.45 × 10、根中9.05 × 10，含量分別為22.8%、15.6%和8.8%，呈現(xiàn)連續(xù)大幅度下降趨勢。其中，黃酮醇在莖、根中持續(xù)向下表達(dá)最為顯著，黃酮也明顯下調(diào)，二者分別是所在部位類黃酮成分富集量最主要的貢獻(xiàn)者(另外是黃烷醇類和查爾酮) (圖3)。由此可知，黑老虎葉、莖、根中類黃酮富集量差異顯著，其主要受黃酮醇和黃酮積累模式(向下或向上)的影響。

圖 3 黑老虎根、莖和葉中黃酮類代謝物數(shù)量分布Fig. 3 Quantitative distribution of flavonoid metabolites in roots, stems and leaves of Kadsura coccinea

2.3 差異代謝物篩選分析

為了鑒別出具體有哪些DAMs造成了分離現(xiàn)象，建立黑老虎葉與莖(KL vs KS)、葉與根(KL vs KR)、莖與根(KS vs KR)之間的3 組OPLS-DA 模型。3組比較OPLS-DA得分結(jié)果顯示， 模型具有很好的預(yù)測能力和可靠性，能夠很好地表現(xiàn)各組間代謝物的變化趨勢；對OPLS-DA 模型進(jìn)行200次排列驗證，<0.05模型最佳(表2)，可根據(jù) VIP 值分析篩選其DAMs。

圖 4 黑老虎葉、莖和根中黃酮類代謝物分布及豐度Fig. 4 Distribution and accumulation of flavonoid metabolites in roots, stens and leaves of Kadsura coccinea

表 2 3組比較的OPLS-DA 模型驗證值Table 2 OPLS-DA model validation values for three groups

基于OPLS-DA結(jié)果，根據(jù)DAMs篩選標(biāo)準(zhǔn)，KL vs KS篩選到的DAMs最少，為55個，KL vs KR和KS vs KR 分別篩選到67個和59個(圖5)。3 組對比DAMs總數(shù)為74個，均為DAMs的有38個，其中33個呈連續(xù)下調(diào)趨勢，僅有3個為連續(xù)上調(diào)；下調(diào)DAMs比例均在80%左右，其以黃酮醇占主導(dǎo)。這表明3個部位類黃酮的分離現(xiàn)象主要由黃酮醇類DAMs所造成。

圖 5 不同對照組中差異代謝物數(shù)量Fig. 5 Number of differentially accumulated metabolites (DAMs) among the three pairwise groups

進(jìn)一步選出差異倍數(shù)排在前20(上調(diào)和下調(diào))的DAMs(圖6)，3組對照中DAMs下調(diào)的倍數(shù)明顯大于上調(diào)，下調(diào)物質(zhì)以黃酮醇為主，其中山萘酚-3--半乳糖苷(三葉豆苷)的倍數(shù)最大，為20.05(下調(diào))。

A. 葉與莖; B. 葉與根； C. 莖與根。A. KL vs KS; B. KL vs KR； C. KS vs KR.圖 6 差異倍數(shù)最大的 20 種代謝物Fig. 6 Top 20 DAMs among the three pairwise groups

2.4 代謝通路分析

利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫對3組對照中的DAMs進(jìn)行注釋，并進(jìn)行通路富集分析。以<0.01 為閾值篩選顯著富集通路，獲得 1條富集極顯著的通路，即黃酮和黃酮醇的生物合成途徑(flavone and flavonol biosynthesis)。3組對照共有12個DAMs注解到該通路中，分別是山奈酚、槲皮素、3,7-二--甲基槲皮素、丁香亭、山奈酚-3--半乳糖苷(三葉豆苷)、山奈酚-3--葡萄糖苷(紫云英苷)(黃芪苷)、木犀草素-7--葡萄糖苷 (木犀草苷)、槲皮素-3--葡萄糖苷(異槲皮苷)、木犀草素-7--新橘皮糖苷 (忍冬苷)、山奈酚-3--蕓香糖苷(煙花苷)、槲皮素-3--桑布雙糖苷、槲皮素-3--蕓香糖苷 (蘆丁)。通過代謝通路圖可以看出，其中有10個DAMs在葉中豐度顯著高于莖和根，僅有2個在根中向上表達(dá)(圖7)，進(jìn)一步表明黑老虎葉(莖)中富含黃酮和黃酮醇相關(guān)代謝物。

黑點處為非DAMs，紅點處為DAMs，名稱附近的熱圖代表該物質(zhì)在3個部位中豐度 (離子流強度經(jīng)log10轉(zhuǎn)化)。Metabolites with black dot denote non-differentially accumulated metabolites, while those with red dot denote differentially accumulated metabolites detected in leaf (KL), stem (KS) and root (KR). The heatmap near each DAMs gives the level of abundance in each organ (The ion intensity of each metabolite is transformed by log10).圖 7 黃酮和黃酮醇生物合成途徑的代謝物Fig. 7 Metabolites involved in flavone and flavonol biosynthesis pathway

3 討論與結(jié)論

本研究基于廣泛代謝組學(xué)技術(shù)，在黑老虎葉、莖、根中鑒定出多種富集度高，具有重要生物活性和藥理作用的黃酮類化合物，表明其具有顯著利用價值。例如，3個部位中兒茶素及衍生物在文中表達(dá)量都較高，研究證實這類物質(zhì)不僅具有抗炎癥、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，而且可以預(yù)防心腦血管疾病(Nance et al., 2009; Tadashi et al., 2010)以及可以保護(hù)腎臟、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等(延璽等，2012)。此外，兒茶素還是茶葉中的主要功能成分。同時，葉中富含槲皮素及其衍生物，其具有優(yōu)異的抗氧化特性(Pu et al., 2008)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥、肝臟疾病、心血管疾病、細(xì)菌和真菌感染(Yao et al., 2008)、抗癌(Chou et al., 2010)等疾病中具有重要藥理作用，對維持人體健康至關(guān)重要。

本研究中，黑老虎作為民間中藥材之一，主要以根入藥，而代謝組解析發(fā)現(xiàn)，葉和莖中類黃酮多樣性和豐度都優(yōu)于根，提示其可藥用的可能。根中特有類黃酮成分3個，分別為2′-羥基-3,4,5,3′4′,6′-六甲氧基查耳酮、5,7,8,4′-四甲氧基黃酮、5-羥基-7,8,2′,6′-四甲氧基黃酮，研究表明多甲氧基黃酮的生物學(xué)活性明顯優(yōu)于非多甲氧基黃酮(Kurowska & Manthey, 2004; Whitman et al.,2005)，但是否為支持其傳統(tǒng)藥用方式的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。本研究葉和莖中含有大量與根相同和多種根中沒有的黃酮類成分，表明3個部位會具有相似的生物活性，可考慮替代或互補利用(尤其近10 a黑老虎藥用資源明顯減少，而其果實作為一種新型水果被廣泛關(guān)注， 種植面積不斷擴大，有大量被修剪的莖和葉)。篩選到的顯著富集通路(黃酮和黃酮醇生物合成途徑)，為進(jìn)一步利用生物工程定向積累具有重要生物學(xué)功能的類黃酮提供參考。

本研究在黑老虎植株中共鑒定出黃酮類代謝物85個，其中以黃酮和黃酮醇占主導(dǎo)，黃酮醇類、黃酮類、黃烷醇類和查爾酮類富集度較高。葉、莖、根中類黃酮多樣性和豐度存在顯著差異，黃酮醇類分布不均衡是多樣性差異的主要原因，而豐度主要受黃酮醇和黃酮積累模式(向下或向上)的影響。