梁靜，李秀璋，陳建博，唐楚煜，王濤，劉欣，李玉玲

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

冬蟲夏草(Cordycepssinensis)是麥角菌科冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體[1]，是青藏高原特有的生物資源。冬蟲夏草最早記載于《月王藥診》，距今有一千多年的應(yīng)用歷史[2，3]，具有補(bǔ)肺益腎，抗衰老，增強(qiáng)免疫，促進(jìn)代謝等作用[4]。它主要分布于青藏高原及周邊地區(qū)海拔3 000 m以上、雪線以下的地區(qū)，在我國的分布包括西藏、青海、甘肅、四川、云南5省區(qū)的高寒草甸草原[5]。作為冬蟲夏草菌重要的寄主昆蟲，蝙蝠蛾的種群動(dòng)態(tài)和生態(tài)習(xí)性不僅是限制冬蟲夏草蘊(yùn)藏量的基礎(chǔ)，也是冬蟲夏草資源可持續(xù)利用的關(guān)鍵[6]。研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草寄主主要分布于我國青藏高原、云貴高原和橫斷山脈等地[7]。蝙蝠蛾的繁殖限制因素眾多，李秀璋等[8]人的研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草寄主蝠蛾卵的孵化與溫度和濕度有關(guān)，溫度只有在適宜的范圍內(nèi)，才能促進(jìn)蝙蝠蛾卵的孵化。

蝙蝠蛾的卵在常溫下易霉變、不耐儲(chǔ)存、孵化時(shí)間緩慢且孵化率低。為了探究蝙蝠蛾卵收集后的最佳儲(chǔ)存方式，本試驗(yàn)以采集自化隆縣巴燕鎮(zhèn)的蝙蝠蛾卵為對(duì)象，研究其在不同儲(chǔ)存溫度及儲(chǔ)存時(shí)間下的孵化情況，并對(duì)其孵化率、孵化速率、孵化期、孵化歷期等卵孵化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以找到最適合的儲(chǔ)存條件，為蝙蝠蛾的人工繁育提供一定的數(shù)據(jù)支持，為人工栽培冬蟲夏草提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究供試蝙蝠蛾卵于2021年7月采集自青海省化隆縣巴燕鎮(zhèn)(E：102°19'，N：36°13'；H：3 200 m)。經(jīng)初步篩選后，將蝙蝠蛾卵置于培養(yǎng)皿中遮光保存于4±1 ℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

將篩選的蝙蝠蛾卵分別置于25 ℃(常溫)、15 ℃、5 ℃、-5 ℃及-15 ℃干燥環(huán)境下儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間設(shè)置為2周、4周、6周和8周。試驗(yàn)時(shí)，將儲(chǔ)存的蝙蝠蛾卵取出再次篩選，選出飽滿度均一的蝙蝠蛾卵使用1%的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒3 min，隨后使用無菌水沖洗3次，將消毒后的蝙蝠蛾卵置于超凈工作臺(tái)的無菌濾紙上自然風(fēng)干30 min。將風(fēng)干后的蝙蝠蛾卵擺放到培養(yǎng)皿中，置于15 ℃人工氣候箱中進(jìn)行遮光孵化，每個(gè)培養(yǎng)皿放置蝙蝠蛾卵100粒，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Microsoft Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理及繪圖，采用SPSS 19.0軟件對(duì)不同儲(chǔ)存溫度和時(shí)間下蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化速率、孵化期及孵化歷期進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Pearson相關(guān)性分析儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蝙蝠蛾卵孵化率及孵化速率的影響

如圖1所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，蝙蝠蛾卵的孵化率呈逐漸下降的趨勢(shì)，在儲(chǔ)存溫度和時(shí)間分別為15 ℃、2周處理下，蝙蝠蛾卵孵化率最高，達(dá)到50.67%，顯著高于其他2個(gè)儲(chǔ)存溫度處理下蝙蝠蛾卵的孵化率(P<0.05)。儲(chǔ)存溫度和時(shí)間分別為-5 ℃、8周處理下，蝙蝠蛾卵的孵化率僅為6.82%，顯著低于其他處理(P<0.05)。儲(chǔ)存溫度和時(shí)間分別為15 ℃、6周處理下，蝙蝠蛾的孵化速率最大，達(dá)到0.038。儲(chǔ)存時(shí)間和溫度分別為4周、5 ℃和-5 ℃處理下，蝙蝠蛾的孵化速率最小，僅為0.029。相對(duì)于其他處理，在儲(chǔ)存溫度為15 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化率相對(duì)較高，在儲(chǔ)存溫度為-5 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化率相對(duì)較低。

圖1 儲(chǔ)存溫度和時(shí)間對(duì)蝙蝠蛾卵孵化的影響注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，圖柱上不同小寫字母表示不同儲(chǔ)存條件之間蝙蝠蛾卵孵化率在0.05水平下的差異顯著性

2.2 儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蝙蝠蛾卵孵化時(shí)間的影響

如圖2所示，在儲(chǔ)存時(shí)間和溫度分別為4周、5 ℃和-5 ℃處理下蝙蝠蛾卵的孵化期最長(zhǎng)為34天。儲(chǔ)存溫度和時(shí)間分別為15 ℃、4周處理下蝙蝠蛾卵的孵化期最短為26 d。儲(chǔ)存溫度為15 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈先減少后增加的變化趨勢(shì)；儲(chǔ)存時(shí)間為5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈先增加后減少的變化趨勢(shì)；儲(chǔ)存時(shí)間為-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化期隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈先增加后減少的變化趨勢(shì)。儲(chǔ)存溫度分別為5 ℃和15 ℃，儲(chǔ)存時(shí)間分別為4周和8周處理下,蝙蝠蛾卵孵化歷期最長(zhǎng)為13 d；儲(chǔ)存時(shí)間和溫度分別為8周、-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期最短僅為3 d。儲(chǔ)存溫度分別為15 ℃和-5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈先增加后減少的變化趨勢(shì)；在儲(chǔ)存時(shí)間為5 ℃處理下，蝙蝠蛾卵的孵化歷期隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加呈先增加后減少再增加的變化趨勢(shì)。

圖2 儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)蝙蝠蛾卵孵化時(shí)間的影響注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，圖柱上不同小寫字母表示不同儲(chǔ)存條件之間蝙蝠蛾卵孵化率在0.05水平下的差異顯著性

2.3 儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關(guān)性分析

為了分析蝙蝠蛾卵的孵化率、孵化期等與儲(chǔ)存溫度及儲(chǔ)存時(shí)間的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析(表1)，儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間與蝙蝠蛾卵的孵化率具有極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與蝙蝠蛾卵的孵化速率和孵化期具有正相關(guān)關(guān)系，與蝙蝠蛾卵的孵化期具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性均不顯著(P>0.05)。

表1 儲(chǔ)存溫度和時(shí)間與蝙蝠蛾卵孵化情況的相關(guān)性系數(shù)

3 討論

蝙蝠蛾卵的儲(chǔ)存過程中，溫度起到了至關(guān)重要的作用，也是其發(fā)育的直接影響因素[9，10]。儲(chǔ)存過程中，溫度過高或者過低都會(huì)直接殺死卵，本試驗(yàn)中蝙蝠蛾卵在儲(chǔ)存溫度為25 ℃和-15 ℃條件下均能孵化出幼蟲。通過對(duì)不同溫度處理下冬蟲夏草蝙蝠蛾的孵化研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草蝙蝠蛾卵的最適孵化溫度為14～16 ℃，孵化率達(dá)到85.67%[11，12]。通過對(duì)冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾卵孵化過程中不同儲(chǔ)存溫度處理發(fā)現(xiàn)，在2 ℃條件下保存7 d后的蝙蝠蛾卵比4 ℃條件下保存7 d的卵孵化率有所降低[13]。王宏生等[14]研究了蝙蝠蛾卵在-2 ℃、0 ℃、5 ℃條件下儲(chǔ)存孵化的情況，認(rèn)為卵保存在-2 ℃條件下已不能孵化出幼蟲，5 ℃條件下保存的卵孵化率比0 ℃條件下保存的卵孵化率高，且蝙蝠蛾的卵在0 ℃和5 ℃條件下儲(chǔ)存15 d比儲(chǔ)存30 d孵化期縮短了。本試驗(yàn)將蝙蝠蛾的卵保存于不同溫度下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蝙蝠蛾卵的儲(chǔ)存溫度為15 ℃、時(shí)間為2周時(shí)，孵化率顯著高于其他處理的孵化率，達(dá)到50.67%；蝙蝠蛾卵的儲(chǔ)存溫度越低，其孵化期越長(zhǎng)，當(dāng)儲(chǔ)存溫度為-5 ℃時(shí)蝙蝠蛾卵的孵化期顯著高于其他處理的孵化期，達(dá)到34 d；當(dāng)蝙蝠蛾卵的儲(chǔ)存溫度為15 ℃和5 ℃時(shí)，孵化歷期最長(zhǎng)，達(dá)到13 d，而儲(chǔ)存溫度為-5℃時(shí)，其孵化歷期僅有3 d。這一結(jié)果顯示，適宜的溫度有利于提高蝙蝠蛾卵的孵化率，縮短其孵化期，這與前人的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾卵儲(chǔ)存在-5 ℃時(shí)，雖然孵化率低，但能孵化出幼蟲，這與前人的研究結(jié)果不一致。這可能與供試冬蟲夏草寄主昆蟲的種類差異有關(guān)。此外，蝙蝠蛾能在0 ℃以下生存可能因?yàn)槠渎阎泻刑?、脂肪酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，這些物質(zhì)同原生質(zhì)形成一定的有機(jī)結(jié)構(gòu)可以抵抗低溫[15]，其內(nèi)在機(jī)制尚需要深入研究。

儲(chǔ)存時(shí)間也是影響冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵孵化的重要因素之一。通過對(duì)冬蟲夏草蝙蝠蛾的卵進(jìn)行不同時(shí)間的儲(chǔ)存發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存15 d卵的孵化率高于儲(chǔ)藏30 d卵的孵化率，且保存的時(shí)間越長(zhǎng)卵的孵化率越低[14]。本試驗(yàn)將蝙蝠蛾的卵分別儲(chǔ)存了2周、4周、6周和8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加不同溫度下蝙蝠蛾卵的孵化率均顯著降低，這與前人的研究結(jié)果一致。蝙蝠蛾的卵隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，孵化率有所下降可能與儲(chǔ)存時(shí)間久后卵消耗自身的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

昆蟲卵的孵化是多種生態(tài)因素共同作用的結(jié)果[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間與冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵的孵化率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。當(dāng)儲(chǔ)存溫度為15 ℃、時(shí)間為2周條件下，蝙蝠蛾卵的孵化率最高，達(dá)到50.67%；當(dāng)儲(chǔ)存溫度為-5 ℃、時(shí)間8周條件下，其孵化率最低，僅為6.82%；當(dāng)儲(chǔ)存溫度為5 ℃、時(shí)間4周條件下，其孵化期和孵化歷期最長(zhǎng)，分別為34 d和13 d；而當(dāng)儲(chǔ)存溫度為15 ℃、時(shí)間為4周條件下，其孵化期最短，為26 d，當(dāng)儲(chǔ)存溫度為-5 ℃、時(shí)間8周條件下，其孵化歷期最短僅有3 d。

本文僅對(duì)采集自青?；】h境內(nèi)的冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵在不同儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間條件下的孵化情況進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存溫度為15 ℃、儲(chǔ)存時(shí)間為2周處理下蝙蝠蛾卵的孵化率最高；儲(chǔ)存溫度為15 ℃、儲(chǔ)存時(shí)間為4周條件下，其孵化期最短；儲(chǔ)存溫度為5 ℃、儲(chǔ)存時(shí)間4周條件下，其孵化歷期最長(zhǎng)，然而蝙蝠蛾卵的孵化對(duì)儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間的響應(yīng)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。盡管研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間和儲(chǔ)存溫度對(duì)蝙蝠蛾卵的孵化有影響，但除此之外蝙蝠蛾卵儲(chǔ)存的位置、環(huán)境中的光等因素可能也是影響蝙蝠蛾卵孵化的關(guān)鍵因子。綜合考慮冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵對(duì)儲(chǔ)存條件的響應(yīng)，篩選出冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾卵的最適儲(chǔ)存條件，為冬蟲夏草的人工培育提供技術(shù)支撐。