林靈超, 金 遷，陳卿卿，杜 強(qiáng)

(浙江福立分析儀器股份有限公司，浙江臺(tái)州 317500)

柴辛注射液，主要處方組成為柴胡和細(xì)辛，具有解表退熱、祛風(fēng)散寒、鎮(zhèn)痛抗炎的藥效，在馬、牛、羊、豬、犬等的感冒發(fā)熱的治療上被廣泛使用[1-2]。柴辛注射液的現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版，中藥卷)》[3]中，為基于校正因子-氣相色譜法對(duì)甲基丁香酚進(jìn)行含量測(cè)定與控制，但易出現(xiàn)準(zhǔn)確度低、峰型差、可操作性不強(qiáng)等缺點(diǎn)[4-5]。同時(shí)僅將甲基丁香酚作為柴胡的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，忽略對(duì)細(xì)辛藥效成分的分析，造成無法全面而準(zhǔn)確地對(duì)柴辛注射液的質(zhì)量控制做出評(píng)價(jià)，最終可能會(huì)導(dǎo)致因臨床療效的差異而產(chǎn)生對(duì)柴辛注射液價(jià)值的錯(cuò)誤判斷。

本文參考《中國(guó)藥典》2020年版第一部細(xì)辛[6]及相關(guān)文獻(xiàn)方法[7-14]，確定了以甲基丁香酚、細(xì)辛脂素為研究對(duì)象，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柴辛注射液中甲基丁香酚、細(xì)辛脂素含量的方法，為柴辛注射液產(chǎn)品質(zhì)量的控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑有：甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111642-200301)，細(xì)辛脂素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111889-201705)，均購自于中國(guó)食品藥品檢定研究所；純乙腈，色譜純，購自于美國(guó)TEADIA；水，Millipore超純水。

主要儀器有：LC5090型高效液相色譜系統(tǒng)，配置為自動(dòng)進(jìn)樣器、輸液泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等，購自于浙江福立分析儀器股份有限公司；SQP型電子天平，購自于賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；色譜分析柱Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，購自于日本ChromaNik Technologies。

柴辛注射液，10 mL(相當(dāng)于原生藥30 g)，批號(hào)為20200502，山東德信生物科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取甲基丁香酚和辛脂素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用純乙腈-純水(5∶5, v/v)溶解配制成濃度為150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

臨用前，用純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋成濃度為0.15、1.5、7.5、15、75、150 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 供試品溶液配制 精密移取柴辛注射液供試品2 mL，置于50 mL容量瓶中，加純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋至刻度，過濾待進(jìn)樣。

1.4 高效液相色譜方法 色譜柱為Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，流動(dòng)相為純乙腈-純水(5∶5, v/v)，流量為1.0 mL/min，柱箱溫度為40 ℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm，進(jìn)樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗(yàn) 依次注入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及空白溶液。結(jié)果顯示，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲基丁香酚和細(xì)辛脂素的保留時(shí)間分別為5.41 min、8.92 min；供試品溶液中甲基丁香酚和細(xì)辛脂素與混合對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間保持一致，分離度分別為5.5、1.6，理論塔板數(shù)分別為18123、26644，拖尾因子均為1.10，同時(shí)經(jīng)光譜掃描得到峰純度較高；空白溶液中，在甲基丁香酚和細(xì)辛脂素的保留時(shí)間位置均未見有雜質(zhì)峰的干擾。

2.2 方法學(xué)試驗(yàn)

2.2.1 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限 將上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣，測(cè)定各組分的峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)，不同濃度下所得峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的擬合曲線分別為為Y=7243X-258，R2=0.9999；Y=18853X-676，R2=0.9999。結(jié)果表明在0.15～150 μg/mL質(zhì)量濃度范圍之內(nèi)，甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的溶液濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

按照3倍噪音計(jì)算檢測(cè)限，10倍噪音計(jì)算定量限，得到甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的檢測(cè)限為0.025 μg/mL、0.012 μg/mL，定量限為0.083 μg/mL、0.040 μg/mL。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取20200502號(hào)柴辛注射液適量，以純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋并定容得到供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣7次，記錄甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的峰面積值。結(jié)果得到甲基丁香酚、細(xì)辛脂素峰面積RSD分別為0.15%、0.20%，表明分析方法精密度良好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、供試品溶液(b)、空白溶液(c)

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20200502號(hào)柴辛注射液適量，以純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋并定容得到供試品溶液，分別在0、2、6、12、24、48 h各進(jìn)行測(cè)定，記錄甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的峰面積，其RSD分別為0.51%、0.42%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率 取柴辛注射液適量，依次添加3個(gè)濃度水平的甲基丁香酚、細(xì)辛脂素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，后以純乙腈-純水稀釋定容。每個(gè)濃度水平平行測(cè)定3份，計(jì)算平均回收率。結(jié)果顯示，甲基丁香酚的平均回收率為97.47%～100.53%，RSD為0.92%～2.17%；細(xì)辛脂素的回收率為88.47%～92.23%，RSD為1.48%～3.55%，表明方法回收率良好。

2.2.5 樣品檢測(cè) 取平行配制的6份不同批次的柴辛注射液供試品溶液進(jìn)樣，依據(jù)線性擬合曲線，計(jì)算含量。結(jié)果每1 mL供試品中甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的平均含量為43.37 μg、1.21 μg，RSD分別為0.52%、1.65%。

3 討 論

目前對(duì)柴辛注射液中有效成分的檢測(cè)，主要為校正因子-氣相色譜法對(duì)甲基丁香酚進(jìn)行含量測(cè)定，極易出現(xiàn)準(zhǔn)確度低、峰型差、可操作性不強(qiáng)等缺點(diǎn)[3-6]，未見其他檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究選擇甲基丁香酚、細(xì)辛脂素分別代表柴辛注射液的兩劑處方柴胡、細(xì)辛的有效物質(zhì)，通過高效液相色譜法同時(shí)進(jìn)行其含量測(cè)定，以全面評(píng)價(jià)柴辛注射液的質(zhì)量。

研究對(duì)甲基丁香酚、細(xì)辛脂素在210～370 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，雖然兩者在230 nm也有較大吸收峰，但根據(jù)主成分的含量最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm。其次通過對(duì)比相同規(guī)格的Coreshell C18和其他全多孔型色譜柱，如Sunniest C18、Xtimate C18、Eclipse Plus C18、Wondasil C18等的效果，以保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)等參數(shù)做為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到當(dāng)使用Coreshell C18色譜柱時(shí)甲基丁香酚峰、細(xì)辛脂素的理論塔板數(shù)最高、分離度最大、最低檢出限最低、分析速度最短，因此確定Coreshell C18為本研究的色譜柱，此時(shí)分析方法具有更好的分離、更高的靈敏度和更快的分析速度的優(yōu)點(diǎn)，可以有效節(jié)省洗脫溶劑、降低分析成本。最后根據(jù)甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的性質(zhì)，分別對(duì)比了甲醇-純水、乙腈-純水等洗脫體系作流動(dòng)相時(shí)的分離效果。使用純甲醇作有機(jī)溶劑時(shí)，隨著純甲醇的組成比例的增加，流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度增加，甲基丁香酚峰會(huì)與溶劑峰共洗脫，同時(shí)細(xì)辛脂素與雜質(zhì)干擾物的分離度下降；當(dāng)純甲醇的組成比例逐漸降低，溶劑峰拖尾會(huì)增大，將甲基丁香酚峰包覆在溶劑峰中；所以純甲醇-純水作洗脫體系時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)甲基丁香酚、細(xì)辛脂素的有效分離和準(zhǔn)確定量；當(dāng)使用純乙腈作有機(jī)溶劑時(shí)，溶劑峰的峰寬明顯縮小。當(dāng)純乙腈的組成比例小于50%時(shí)，細(xì)辛脂素的保留時(shí)間過長(zhǎng)、甚至無法被洗脫；當(dāng)純乙腈的組成比例大于50%時(shí)，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度較大，導(dǎo)致甲基丁香酚峰與溶劑峰共洗脫，細(xì)辛脂素與雜質(zhì)干擾物的分離度下降，方法的定量準(zhǔn)確度受到影響；只有在純乙腈的組成比例為50%時(shí)，甲基丁香酚與溶劑峰、細(xì)辛脂素與雜質(zhì)干擾物的分離度均達(dá)到基線分離，且分析時(shí)間較短，兩者的峰形對(duì)稱。因此最終確定“純乙腈-純水(5∶5, v/v)”為研究的流動(dòng)相。

研究建立了高效液相色譜方法同時(shí)測(cè)定柴辛注射液中甲基丁香酚、細(xì)辛脂素含量的方法，方法的準(zhǔn)確度RSD小于1%、精密度RSD值小于0.3%，平均回收率在88%以上，被測(cè)樣品溶液放置48 h后含量RSD仍小于0.6%，準(zhǔn)確度高、峰形佳、色譜方法簡(jiǎn)單、操作性極強(qiáng)。上述表明本方法適應(yīng)于檢測(cè)柴辛注射液中的有效組分的含量。

試驗(yàn)已經(jīng)對(duì)3～5家的柴辛注射液產(chǎn)品進(jìn)行了分析檢測(cè)，但仍需收集更多的同類產(chǎn)品，用于擴(kuò)大方法的適用范圍，以最優(yōu)化現(xiàn)有方法。

4 結(jié) 論

研究選擇甲基丁香酚、細(xì)辛脂素作為研究對(duì)象，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柴辛注射液中兩種有效成分的方法，方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性、精密度高，可以適用于其質(zhì)量控制，可為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)的完善和產(chǎn)品療效的研究提供科學(xué)依據(jù)。