賈 興，張 星，張 沛*，耿智霞，瞿紅穎，宋婷婷，劉 靜，郭李珉，劉 欣，曹興元

(1.河北遠征藥業(yè)有限公司，石家莊 050041；2.河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種高度傳染性、致死性呼吸道疾病，以急性出血和慢性的纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣鳎俏：︷B(yǎng)豬業(yè)的幾大細菌感染性疾病之一。目前豬傳染性胸膜肺炎的防治仍主要依靠化學(xué)藥物[1-2]。泰地羅新是一種動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，為泰樂菌素的衍生物，對一些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均具有抗菌活性，對引起豬、牛呼吸系統(tǒng)疾病的病原菌如胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌、溶血性曼海姆菌、睡眠嗜組織菌等尤其敏感[3-5]。本研究對泰地羅新注射液進行了人工感染豬傳染性胸膜肺炎的臨床試驗，以明確該藥對目標疾病的臨床療效、確定臨床使用劑量，為該藥在獸醫(yī)臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗藥物 受試藥物泰地羅新注射液，河北遠征藥業(yè)有限公司，規(guī)格50 mL：2 g，批號TILDI4-1-03；對照藥物泰地羅新注射液，默沙東動物保健品有限公司，規(guī)格100 mL:4 g，批號A147A01。

菌種，V型(血清型)胸膜肺炎放線桿菌，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥安全評價中心保存。

1.2 試驗動物及試驗地點 健康杜×長×大三元雜交豬，2～3月齡，體重20～30 kg，共80頭。未接種過胸膜肺炎放線桿菌疫苗，15 d內(nèi)未接受過全身性抗菌藥物和抗炎藥物(糖皮質(zhì)激素、NSAIDs等)治療。購入試驗豬轉(zhuǎn)運至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物樓豬舍進行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 菌種鑒定及染毒菌液制備 菌種鑒定：將冷凍保存的胸膜肺炎放線桿菌(APP)解凍后混勻，醮取少量接種于TSA瓊脂平板，置于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，對菌落進行染色觀察，采用16S rDNA基因 PCR方法進行鑒定。

菌液制備：挑取已鑒定確認APP的單菌落，接種于TSB 肉湯，置于恒溫搖床振蕩培養(yǎng)12～16 h；采用平版計數(shù)法獲得1 mL原菌液的菌落形成單位(CFU)。用無菌生理鹽水將原菌液稀釋至合適濁度后進行染毒復(fù)制疾病。

1.4 人工發(fā)病 將APP菌液稀釋至合適濁度盛于滅菌噴瓶中[6]，以一定的染毒量對隨機選擇的8頭試驗豬進行一次性鼻腔噴霧。染毒后觀察感染豬的臨床表現(xiàn)，記錄各染毒豬出現(xiàn)臨床癥狀的時間，對死亡的染毒豬或癥狀典型的染毒豬進行剖檢，采集病變組織分離鑒定病原菌。通過8頭試驗豬的預(yù)試驗，確定將7×108cfu/mL的菌液按0.25 mL/kg體重的染毒量給試驗豬一次性鼻腔噴霧，可以復(fù)制出豬傳染性胸膜肺炎疾病模型。

1.5 試驗設(shè)計 將72頭受試豬隨機分為6個組(I、II、III、IV、V、VI組)，每組12頭。按確定的染毒方法對其中5個組(I、II、III、IV、V組)的試驗豬進行染毒復(fù)制豬傳染性胸膜肺炎，1個組(VI組)不染毒(鼻腔噴霧0.25 mL/kg體重的無菌生理鹽水)作為健康對照。待染毒豬出現(xiàn)明顯癥狀后(染毒15 h左右)進行單次肌內(nèi)注射治療，給藥方案如表1所示。用藥后持續(xù)觀察15 d。試驗豬按組隔離飼養(yǎng)于不同圈舍，自由采食和飲水。豬飼料為自配，飼料和飲水不含任何藥物成分。

表1 試驗豬給藥方案

1.6 療效評價指標與標準 分別在染毒前、給藥前、給藥后檢查各豬臨床癥狀表現(xiàn)，分別于染毒前、給藥前、試驗結(jié)束后對各組試驗豬進行肺部X光檢查；對各組試驗期間死亡豬、試驗結(jié)束時部分存活豬進行剖檢，觀察胸腔臟器病變并按標準進行評分；在試驗結(jié)束時，綜合上述各項指標觀測結(jié)果，按標準判定每頭豬的療效(治愈、有效、無效)，計算各組的治愈率和有效率；稱量計算試驗期間各組豬的增重、耗料和飼料轉(zhuǎn)化率。

治愈：病豬體溫、呼吸、狀態(tài)正常；體重明顯增加；剖檢胸腔臟器無病變；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子無胸膜肺炎放線桿菌檢出。治愈率=(組內(nèi)治愈豬頭數(shù)/組內(nèi)用藥豬頭數(shù))×100%。

有效：病豬體溫、呼吸、狀態(tài)趨于正常；體重不變或有所增加；剖檢胸腔臟器病變較微；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子無胸膜肺炎放線桿菌檢出。有效率=[(組內(nèi)有效豬頭數(shù)+治愈豬頭數(shù))/組內(nèi)用藥豬頭數(shù)]×100%。

無效：用藥后病豬出現(xiàn)死亡；病豬狀態(tài)異常，發(fā)熱明顯，存在嚴重呼吸癥狀；體重下降；剖檢胸腔臟器病變明顯；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子有胸膜肺炎放線桿菌檢出。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS軟件，各組豬的體溫、狀態(tài)/呼吸/發(fā)熱評分、胸腔臟器病變評分、增重以平均值±標準差(M±SD)表示，采用T檢驗進行統(tǒng)計分析；各組病豬的病原菌檢出率、飼料轉(zhuǎn)化率、死亡率、治愈率和有效率以百分比(%)表示，采用卡方(X2)檢驗進行統(tǒng)計分析。比較組內(nèi)不同時間點和/或組間相同時間點上述指標的差異顯著性。

2 試驗結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果 試驗結(jié)果顯示，各組(I、II、III、IV、V、VI)試驗豬染毒前精神良好、食欲旺盛，呼吸正常。給I、II、III、IV、V組試驗豬人工感染胸膜肺炎放線桿菌，12～15 h后染毒豬均出現(xiàn)了不同程度的精神不振，采食量下降，氣喘，咳嗽呼吸困難，體溫升高等臨床癥狀，個別試驗豬還出現(xiàn)了嘔吐現(xiàn)象。按低、中、高劑量給發(fā)病豬單次肌內(nèi)注射河北遠征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，均可有效緩解病豬的上述癥狀。用藥1 d開始起效，用藥4～5 d多數(shù)病豬恢復(fù)正常，之后精神食欲穩(wěn)定，呼吸恢復(fù)正常，癥狀未見反復(fù)。

2.2 試驗豬肺部X光檢查結(jié)果 人工感染胸膜肺炎放線桿菌，可引起豬肺部出現(xiàn)炎癥性病變，X光檢查肺野呈現(xiàn)大面積或局灶性的團塊狀、云霧狀陰影。按低、中、高劑量給發(fā)病豬單次肌內(nèi)注射河北遠征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，可有效消除病豬肺部的炎癥性病變，其中中、高劑量的效果無明顯差異，與按推薦劑量單次肌內(nèi)注射默沙東動物保健品有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液相當(dāng)，均優(yōu)于低劑量。

2.3 試驗豬剖檢及胸腔腔器病變評分結(jié)果 試驗期間死亡豬、試驗結(jié)束時各組存活豬剖檢胸腔腔器病變評分統(tǒng)計結(jié)果見表2。比較各組試驗結(jié)束時剖檢胸腔臟器病變的評分，藥物對照組(I組)、各受試藥物組(II、III、IV組)、感染對照組(V組)、健康對照組(VI組)之間無顯著差異(P<0.05)。比較整個試驗期間各組尸檢和剖檢胸腔臟器病變的合計評分，感染對照組(V組)顯著高于健康對照組(VI組)和受試藥物高劑量組(IV組)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 試驗豬胸腔臟器病變評分結(jié)果統(tǒng)計

2.4 試驗豬增重及飼料轉(zhuǎn)化率 各組試驗豬的增重和飼料轉(zhuǎn)化率(料重比)統(tǒng)計結(jié)果見表3。試驗結(jié)束時各組試驗豬的體重均有不同程度增加，其中以健康對照組(VI組)的體重最高；其后依次為受試藥物高、中劑量組(IV、III組)、藥物對照組(I組)和受試藥物低劑量組(II組)，增重最低的是感染對照組(V組)。II組和V組試驗豬D15的體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，均顯著低于其他組(P<0.05)，而I、III、IV、VI組之間也無顯著差異(P>0.05)。試驗期間各組豬的平均增重和日增重，I、III、IV、VI組顯著高于II、V組(P<0.05)，II組顯著高于V組(P<0.05)，其他組間無顯著差異(P>0.05)。試驗期間各組試驗豬的料重比，健康對照組(VI組)的料重比最低；其后依次為為受試藥物高、中劑量組(IV、III組)、藥物對照組(I組)和受試藥物低劑量組(II組)；料重比最高的是感染對照組(V組)。

表3 試驗豬增重、耗料及飼料轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(n=12)

2.5 藥物療效評價 試驗結(jié)束后，綜合各試驗豬的死亡情況、臨床表現(xiàn)(狀態(tài)、呼吸、發(fā)熱評分)、體重變化、胸腔臟器病變評分，按標準進行療效評價，統(tǒng)計各組試驗豬的治愈率、有效率和無效率，結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示，對照藥物和低、中、高劑量受試藥物對人工感染豬傳染性胸膜肺炎病豬均有治療效果。其中高劑量受試藥物(Ⅳ組)的有效率和治愈率最高；其次為推薦劑量對照藥物(I組)和中劑量受試藥物(III組)。分別比較低、中、高劑量受試藥物之間以及各劑量受試藥物與推薦劑量對照藥物之間的有效率、治愈率和無效率，均無顯著差異(P>0.05)。

表4 試驗豬藥物療效評價結(jié)果統(tǒng)計

3 討論與結(jié)論

2011年荷蘭英特威動物保健品公司以泰地羅新為主要成分研制的商品名為 Zuprevo無菌注射液通過了歐洲藥物管理局(EMA)獸用藥委員會的審批，并相繼投放市場。泰地羅新對牛、豬的呼吸道疾病具有十分明顯的治療效果[7]，藥效強于同類藥物泰樂菌素、替米考星，而且具備動物專用、用量少、一次給藥全程治療、超長的消除半衰期、生物利用度高、低殘留等眾多優(yōu)點[8-9]。

根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則[10]，計算各組的有效率、治愈率和無效率，作為療效評價指標，初步評價了泰地羅新對靶動物豬適應(yīng)癥的防治作用和安全性，確定合理的給藥劑量方案。以7×108CFU/mL濁度按0.25 mL/kg體重的染毒量給20～30 kg的仔豬一次性鼻腔噴霧胸膜肺炎放線桿菌新鮮培養(yǎng)菌液，可成功復(fù)制豬放線桿菌胸膜肺炎疾病模型。染毒15 h左右，感染豬出現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，攝食減少，呼吸困難等典型癥狀；X光檢查感染豬，肺野呈現(xiàn)大面積或局灶性的團塊狀、云霧狀陰影；剖檢感染死亡豬，可見出血性、纖維素性胸膜肺炎等典型病變；采集肺部病料，可分離出胸膜肺炎放線桿菌。

按低、中、高劑量給人工感染胸膜肺炎放線桿菌病豬單次肌內(nèi)注射河北遠征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，對人工感染豬傳染性胸膜肺炎病豬有治療效果?？捎行Ь徑夂拖∝i發(fā)熱、精神食欲不振、呼吸困難等臨床癥狀；有效清除豬體感染的胸膜肺炎放線桿菌；對抗病原所致機體的炎癥性損傷，促進肺部病變的修復(fù)；降低飼料轉(zhuǎn)化率。用藥1 d開始起效，用藥4～5 d多數(shù)病豬恢復(fù)正常，之后癥狀未見反復(fù)。其中，中、高劑量的效果無明顯差異，中、高劑量的有效率超過90%，治愈率超過80%，與按推薦劑量單次肌肉注射默沙東動物保健品有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液相當(dāng)，均優(yōu)于低劑量。

根據(jù)本試驗結(jié)果，傳染性胸膜肺炎病豬使用泰地羅新注射液治療較安全、有效，推薦泰地羅新注射液按一次量每公斤體重4 mg，肌內(nèi)注射治療豬傳染性胸膜肺炎。