劉 坤，王淑婷，田麗華，王玉東*，宋翠平*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物及動物產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，山東 青島 266032；2.青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島266400)

頭孢噻呋(ceftiofur)又名“賽得福”，是第一個專門用于動物的第三代頭孢類抗菌素[1]，由Benard Labeouw在1984年率先合成，后由美國法瑪西亞-普強公司[2]制作成鹽酸鹽懸濁液和鈉鹽凍干粉。1988年，該藥在美國首次上市，因其抗菌活性優(yōu)良，藥物動力學(xué)良好的特點，先后被日本、美國等國家正式批準(zhǔn)用于動物的呼吸道感染疾病的治療，顯示了在獸醫(yī)臨床應(yīng)用的廣闊前景[3]。近年來，該藥物在我國被廣泛使用，被制成各種劑型，廣泛用于獸醫(yī)臨床。2021年我國批準(zhǔn)了美國2家公司的鹽酸頭孢噻呋注射液2種新獸藥的進口注冊[4]。頭孢噻呋在體內(nèi)分布廣泛，在體內(nèi)生成有活性的代謝產(chǎn)物，進一步轉(zhuǎn)化成無活性的產(chǎn)物，從糞和尿中排泄[5-6]。對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性較強[7]，具有廣譜殺菌作用，對頭孢噻呋敏感的病原菌主要有溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌[8-9]，及葡萄球菌、鏈球菌等。其作用機制為作用于細菌內(nèi)的轉(zhuǎn)肽酶，阻斷粘肽的合成,可使細菌缺失細胞壁而死亡,達到快速殺菌的效果[10]。臨床主要用于治療溶血性巴氏桿菌和胸膜肺炎放射桿菌引起的動物呼吸道感染疾病。

頭孢噻呋對動物的的毒性作用較小，不良反應(yīng)一般在用藥幾天后才出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為皮疹等過敏癥狀。頭孢噻呋與妥布霉素或氨基糖苷類藥物聯(lián)合使用對腎有毒性作用，如何減少毒副作用，對藥物進行藥代動力學(xué)研究非常必要。本試驗旨在通過比較三種鹽酸頭孢噻呋注射液在白羽雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)變化規(guī)律，以判斷新研制的鹽酸頭孢噻呋的藥物動力學(xué)參數(shù)是否符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，同時，為國內(nèi)創(chuàng)新藥物研究和現(xiàn)有藥物的臨床合理用藥，以及確定用藥間隔及頻次、制定休藥期和防止獸藥殘留提供參考。

1 材 料

1.1 試驗動物 40只健康白羽雞，25日齡，體重1.4 kg左右，由山東亞太中慧雞場提供，雞群已按規(guī)定日齡接種新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病等疫苗，未使用過任何藥物。飼養(yǎng)在試驗雞舍普通飼養(yǎng)籠具內(nèi)，溫度控制在(20±2)℃。飼喂不含任何抗菌藥物的飼料，每天定時定量給料兩次。臨床觀察一周，表現(xiàn)健康。試驗前12小時及給藥后4小時禁食，供給充足飲水，禁食后水中加1%的葡萄糖以補充試驗動物體力。

1.2 試驗器材 Agilent 2100高效液相色譜儀；電子天平JY2012型，北京科技儀器廠；臺式離心機LGT-18G型，上海滬西儀器廠；微型渦旋混合儀WH-6型，天津精密科學(xué)儀器有限公司；分析天平AUY180型，島津試驗計測事業(yè)部；液體快速混合機YKZ型，哈爾濱醫(yī)療器械廠；超聲波清洗機XKQ-200B，南京超聲儀器有限公司；高速分散均質(zhì)機 FJ-400型，成都標(biāo)本模型廠；軌道式搖床KS510 digital型，德國IKA公司；MCX小柱MCX BondElut Varian 1CC 100MG，德國CNM公司。

1.3 試驗藥品及試劑 鹽酸頭孢噻呋注射液：美國鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g美國碩騰，含量5%，批號0A4SM。大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g河南大中農(nóng)動物藥業(yè)有限公司，含量5%，批號獸藥6288288。新研制鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g山東某生物科技公司，含量5%。

乙腈(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、氯化鉀(上海市化學(xué)試劑廠)、四硼酸鈉(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、三氟乙酸(美國TEDIA天地試劑有限公司)、二硫赤鮮醇(Amrosce 02450)、碘乙酰胺(美國ACROS生物有限公司)、乙酸銨(天津化工有限公司)

1.4 主要溶液的配制 頭孢噻呋儲備液：稱取頭孢噻呋對照品，用0.05 mol/L的乙酸銨溶液稀釋成每1 mL中約含頭孢噻呋1000 μg的溶液，作為頭孢噻呋備用液，臨用前用0.05 mol/L的乙酸銨溶液配成梯度濃度為0.5-200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。

2 方 法

2.1 動物試驗

2.1.1 分組及給藥 40只健康白羽雞，隨機分成四組?？瞻捉M10只，注射生理鹽水，2.5 ml/kg體重。另外三組肌肉注射(美國鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋、新研制鹽酸頭孢噻呋)給藥進行藥動學(xué)試驗，試劑均為2.5 mg/kg體重。

空白組(10只)：編號K1～K10

試驗1組(10只)：美國鹽酸頭孢噻呋編號A1～A10

試驗2組(10只)：大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋編號B1～B10

試驗3組(10只)：新研制鹽酸頭孢噻呋編號C1～C10

2.1.2 采樣及保存 通過雞翅下靜脈采集血液樣品。給藥前采一次空白血。按照2.5 mg.kg-1b.w劑量給試驗雞肌肉注射(美國鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋、新研制鹽酸頭孢噻呋)給藥后分別于15、30、45 min及1.5、2、2.5、4、6、8、24、30、48、72、96、144 h采集血樣。每次采血1.5-2 mL，放入含EDTA-2K的離心管中，離心、分離血漿、-20 ℃保存，待測。

2.2 血漿中藥物含量分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,ID)；流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈，按下表進行梯度洗脫；流速為每分鐘1 mL；檢測波長為266 nm；柱溫為30 ℃。進樣量為50 μL。

表1 色譜柱梯度洗脫表

2.2.2 樣品分析前預(yù)處理 將冷凍存放的血漿，放在常溫下自然解凍，然后搖勻取血漿0.5 mL放入10 mL具塞離心管中，加入1.2 mL提取液，渦旋1 min混勻，放入50 ℃恒溫搖床，20 min。取出靜置，待冷卻到室溫，加入0.5 mL 10%碘乙酰胺溶液，渦旋10 s，用錫紙包好放入30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，200 r/min衍生30 min。衍生后的混合液體加20%的磷酸100 μL酸化，加水1.25 mL混勻。4 ℃,12000 r/min離心20 min，取上清液備用。

MCX小柱依次加入3 mL甲醇、3 mL水活化，然后加入上一步衍生化所得的上清液，再依次加入3 mL水、3 mL色譜甲醇來淋洗；加入2 mL乙酸銨：乙腈(85+15，v/v)混合液洗脫；用0.22 μm微孔濾膜濾過所得的洗脫液，精確量取40 μL溶液注入液相色譜儀。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取9支離心管，依次加入空白血漿0.45 mL，再依次加入50 μL系列濃度的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)液(0.5-200 μg·mL-1)，渦旋混勻，制備的樣品中含頭孢噻呋的系列濃度為0.05-20 μg·mL-1，第一支管作空白對照。按2.2.2 樣品分析前預(yù)處理方法進行處理后，測定。將藥物峰面積與相應(yīng)藥物濃度作線性回歸，求標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和回歸方程。

2.2.4 靈敏度(最低檢測限、最低定量限)、回收率、精密度的考察 分別將0.1、2和40 μg·mL-1三種藥物濃度的樣品當(dāng)作考察對象，每個濃度制作三份樣品，按照血漿樣品分析前預(yù)處理方法處理，進行高效液相測定，測出日間變異系數(shù)、日內(nèi)變異系數(shù)，連續(xù)測3 d。

回收率：加樣提取液的藥物峰面積/標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積×100%

日內(nèi)、日間變異系數(shù)(精密度)：標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù)×100%

最低檢測限：三倍信噪比時，儀器測定的進樣藥物量與樣品溶液濃度的比值。

最低定量限：十倍信噪比時，進樣藥物量被定量測定的最低量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法專屬性 在試驗建立的色譜條件下，血漿中的DCA與其他干擾雜質(zhì)可以有效分離，色譜見圖3-圖6。DCA的出峰時間在9.2 min。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 空白血漿添加鹽酸頭孢噻呋色譜圖

圖4 實測色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 經(jīng)過不斷摸索試驗條件,血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的藥物濃度線形范圍、回歸方程均符合試驗的要求。線性范圍在0.05至40之間，相關(guān)系數(shù)是0.999。回歸方程(x：標(biāo)準(zhǔn)品在空白血漿的濃度，y：藥物峰面積)和相關(guān)系數(shù)見表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖6。

圖6 雞肌注射美國鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和新研制鹽酸頭孢噻呋后血藥濃度-時間曲線

表2 鹽酸頭孢噻呋在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

圖5 DCA在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)

3.3.1 靈敏度考察 最低檢測限：0.05 μg/mL；最低定量限：0.1 μg/mL。

3.3.2 回收率和精密度考察 血藥濃度在0.1、5、40 μg/mL時，回收都在90%左右，精密度在2.97至4.63之間，均符合試驗要求。按照樣品預(yù)處理方法，在血漿中添加藥物，測得精密度和回收率數(shù)據(jù)見表3。

表3 雞空白血漿添加鹽酸頭孢噻呋的方法學(xué)考察結(jié)果

3.4 血漿中的藥物濃度 白羽雞肌肉注射鹽酸頭孢噻呋后，體內(nèi)血藥濃度在4時達到最大值，30時已檢測不到藥物，表明藥物在30時藥物已基本代謝完。各時間點血漿藥物濃度測定結(jié)果見表4和圖7。

表4 雞單次肌注鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1)血藥濃度

3.5 頭孢噻呋藥物動力學(xué)參數(shù) 三種鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1 b.w.)的平均藥動學(xué)參數(shù)采用SPSS比較差異性，見表5。

通過表5中的各項平均藥物動力學(xué)參數(shù)可以看出，白羽雞肌肉注射美國鹽酸頭孢噻呋4個小時后，血藥濃度達到峰值，最高血藥濃度為2.47 μg.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.22 h，AUC為19.1 μg.h.mL-1，平均滯留時間MRT為7小時；注射大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋4 h后，血藥濃度達到峰值，最高血藥濃度為2.49 μg.h.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.02小時，AUC為21.1 μg.h.mL-1，平均滯留時間MRT為7 h；注射新研制鹽酸頭孢噻呋4 h后，血藥濃度達到峰值，最高血藥濃度為2.61 μg.h.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.22 h，AUC為24.1 μg.h.mL-1，平均滯留時間MRT為7 h。結(jié)果表明三種劑型的藥物動力學(xué)參數(shù)差異不顯著。

表5 三種鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1 b.w.)的平均藥動學(xué)參數(shù)差異性分析結(jié)果

4 討論與結(jié)論

白羽雞肌肉注射頭孢噻呋注射液后，三種藥物達峰時間一樣，都是注射藥物后4 h血藥濃度達峰值。通過注射液峰濃度來看，本新研制鹽酸頭孢噻呋的最高血藥濃度稍微偏高，這是優(yōu)勢。

4.1 血漿樣品的分離和提取 藥物進入體內(nèi)后快速的失去β-呋喃甲?；?，生成有活性的代謝產(chǎn)物，在血漿中很少以游離狀態(tài)存在，主要與半胱氨酸形成二硫化合物，與血漿蛋白或組織蛋白結(jié)合形成去呋喃甲酰蛋白復(fù)合物，還可形成二聚物。本試驗選用碘乙酰胺作為衍生試劑，采用二硫赤鮮醇作為提取劑，該方法每天處理四十多個樣品，簡單方便，比1990年Jalan[11]的每天處理十幾個樣品先進許多。新研制鹽酸頭孢噻呋的預(yù)處理方法可用于生物等效性的研究和藥動學(xué)的研究。

4.2 提取液濃度的選擇 在血漿樣品中加入不同濃度的提取液，觀察對回收率的影響。取含有0.02%、0.2%、2%三個濃度的二硫赤鮮醇提取液，每個濃度取5個重復(fù),回收率分別為65.61%、90.5%和67.46%，所以試驗中提取液濃度選為0.2%。加入不同濃度衍生試劑到樣品中，觀察對回收率的影響，取含有0.14%、1.4%、14%三個濃度的碘乙酞胺溶液提取液，每個濃度取5個重復(fù)，回收率分別是67.61%、90.53%和65.76%，所以試驗中衍生試劑的濃度選用1.4%。

4.3 組織樣品色譜條件的選擇 Barker等[12]曾報道了美國鹽酸頭孢噻呋在動物組織中的高效液相檢測方法，所用的色譜柱是AglentTC-C18柱。本試驗所采用的流動相也是AglentTC-C18柱。將衍生后的DCA進行高效液相檢測，經(jīng)紫外分光光度計測定，結(jié)果顯示，DCA在266 nm處有最大吸收峰，并且干擾較小，因此檢測DCA的檢測波長選用266 nm。

4.4 白羽雞肌肉注射鹽酸頭孢噻呋的藥動學(xué)特征 頭孢噻呋抗菌活性優(yōu)良，在臨床中前景廣闊。頭孢噻呋能治療犬的泌尿系統(tǒng)感染；馬、羊、豬的肺炎、呼吸道感染等疾病，還可用于仔豬的斷尾和斷齒等引起的傷口感染；牛的子宮炎、呼吸道感染、腐蹄炎；本藥對沙門氏菌和大腸桿菌等病原菌引起的雞苗死亡有顯著地防治效果[13-14]。

陳啟友等[15]隨機將12頭健康豬分為兩組，分別注射美國輝瑞美國鹽酸頭孢噻呋注射液、上海公誼獸藥廠的長效鹽酸頭孢噻呋注射液,每頭5 mg/kg。比較了進口頭孢噻呋注射液和國產(chǎn)頭孢噻呋注射液豬肌肉注后的藥物動力學(xué)特征。結(jié)果表明：參數(shù)tmax、Cmax、MRT差異極顯著(P<0.01)，長效鹽酸頭孢噻呋注射液肌注給藥比美國鹽酸頭孢噻呋注射液吸收慢,達峰時間推后,達峰濃度較低,駐留時間延長；參數(shù)AUC、Kel、t1/2無顯著性差異(P>0.05)。

張志成等[16]以制劑的穩(wěn)定性當(dāng)作評價指標(biāo), 以玉米油為溶媒,加入適量的輔料,采用正交設(shè)計的方法，據(jù)鹽酸頭孢噻呋藥物的特性設(shè)立了鹽酸頭孢噻呋混懸劑的制備方法。采用6個月加溫加濕，10天光加速試驗的方法對制備的混懸劑進行質(zhì)量評價,研究了對鹽酸頭孢噻呋混懸劑的穩(wěn)定性，結(jié)果外觀性狀、粒度等指標(biāo)均無明顯變化,表明該制劑對光、熱穩(wěn)定,基本符合藥劑學(xué)中規(guī)定的混懸劑的要求,可順利進行注射給藥。試驗證明該制劑穩(wěn)定性好,工藝簡單,刺激性小,具有較好的緩釋效果;制劑的主要制劑學(xué)參數(shù)與輝瑞公司生產(chǎn)的鹽酸頭孢噻呋注射用混懸劑的主要制劑學(xué)參數(shù)比較差異不顯著。藥物動力學(xué)是藥物通過各種途徑進入動物體內(nèi)后，吸收、分布、代謝和排泄的過程的“血藥濃度-時間”變化規(guī)律的一門科學(xué)。試驗結(jié)果表明，白羽雞肌肉注射進口藥、國產(chǎn)藥和新研制的藥后，三種藥物吸收和消除速度差異不顯著?？偟膩碚f，新研制鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和美國鹽酸頭孢噻呋注射液的藥物動力學(xué)相當(dāng)。

4.5 結(jié)論 試驗進行了三種劑型藥物動力學(xué)參數(shù)比較，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，通過比較顯示美國鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和新研制的藥物各種參數(shù)差異不顯著(P>0.05)。新研制鹽酸頭孢噻呋的各項參數(shù)符合藥物標(biāo)準(zhǔn)。