李保珍，劉 琪，樊金華，趙夏婷，賈 璐，楊琬芳

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801)

黃芪是臨床上最常用的補(bǔ)中益氣藥之一，其主要的有效成分為黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等，其中黃芪多糖是黃芪的水溶性主要成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)[1]，抗腫瘤、抗動脈硬化[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、抗病毒[5]和治療代謝性紊亂等作用[6]。近年來，隨著人民對中醫(yī)藥認(rèn)知度的逐年提高，黃芪用量也隨之增加，傳統(tǒng)利用方式已不能滿足需求。為了提高黃芪的利用率，許多新技術(shù)應(yīng)運而生。其中，微生物發(fā)酵技術(shù)能夠使黃芪等中藥活性成分充分釋放，起到增強(qiáng)藥效、節(jié)省藥材資源和維護(hù)生態(tài)環(huán)境等效應(yīng)，成為研究熱點[7]。然而，微生物發(fā)酵黃芪還存在作用機(jī)理不明確、優(yōu)良菌種少和發(fā)酵工藝難以控制等問題。因此，篩選能夠高效提高黃芪有效成分的優(yōu)良菌種并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，大幅減少成本的同時還增加藥效，仍是急需解決的難題。

沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris,R.palustris)屬于紫色非硫菌群，是地球上已發(fā)現(xiàn)的最古老的微生物之一，在黑暗好氧或光照厭氧條件下都可正常生長，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜禽、漁業(yè)、環(huán)保和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域[8-10]。本文以實驗室保藏的一株沼澤紅假單胞菌N菌株為發(fā)酵黃芪菌株進(jìn)行液體發(fā)酵來提高黃芪多糖的含量，為黃芪的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沼澤紅假單胞菌(R.palustris)N菌株[11]由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合細(xì)菌研究室贈予并保藏。

1.1.2 試劑與儀器 黃芪購自榆林市廣濟(jì)堂中藥開發(fā)有限責(zé)任公司(產(chǎn)地內(nèi)蒙古)；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇等試劑均為分析純；BioTek酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，Inc)；HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；湘立TGL16M離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)；雷磁PHS-25型數(shù)顯pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；BSD-TX345臺式恒溫振蕩器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電熱恒溫水箱600型(北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司)；LFP-800T高速多功能粉碎機(jī)(萊芙)等。

1.2 方法

1.2.1 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪 采用RCVBN培養(yǎng)基[12]進(jìn)行黃芪發(fā)酵。將黃芪粉碎過40目后按照1∶15的料液比制備培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，在菌種接種量為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃、初始培養(yǎng)基pH值為7.0和光照強(qiáng)度為1500 Lux條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 黃芪多糖的提取與測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照楊叔萍[13]所述方法，在490 nm處測定吸光度值。以黃芪多糖溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程式為y=0.0312x+0.00066，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9977。

黃芪多糖的提?。喝↑S芪發(fā)酵液20 mL置于振蕩器上，300 rpm/min振蕩1 h，4000 rpm離心10 min，棄沉淀，向上清中加入3倍體積的無水乙醇，置于4 ℃中過夜，離心收集沉淀，沉淀加水后于70 ℃進(jìn)行水浴，溶解并定容至50 mL容量瓶中，用于多糖含量的測定[13, 14]。

黃芪多糖含量的測定：參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制所述方法進(jìn)行吸光度值測定，代入回歸方程計算其含量。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響 在菌種接種量10%，初始培養(yǎng)基pH值7.0和發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，將發(fā)酵時間分別設(shè)計為3、4、5、6 d，考察發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響。

1.2.3.2 初始培養(yǎng)基pH值對黃芪多糖含量的影響 在菌種接種量10%，發(fā)酵時間6 d和發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，將初始培養(yǎng)基pH值分別設(shè)計為6.2，6.6，7.0，7.4，考察初始培養(yǎng)基pH對黃芪多糖含量的影響。

1.2.3.3 菌種接種量對黃芪多糖含量的影響 在初始培養(yǎng)基pH值為7.0，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間6 d的條件下，將菌種接種量分別設(shè)計為6%，8%，10%，12%，考察菌種接種量對黃芪多糖含量的影響。

1.2.3.4 發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響 在菌種接種量為10%，初始培養(yǎng)基pH值為7.0和發(fā)酵時間6 d的條件下，將發(fā)酵溫度分別設(shè)計為25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，然后進(jìn)行發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、菌種接種量、發(fā)酵溫度和初始培養(yǎng)基pH值4個因子，每個因子在三水平下，以黃芪多糖的含量為指標(biāo)考察沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪多糖含量的影響，進(jìn)行正交試驗并進(jìn)行方差分析。因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交設(shè)計因素水平表

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)以Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)和Origin 8.5作圖，同時采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，每組試驗重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響 發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響見圖1。由圖1可知，發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響較大，當(dāng)發(fā)酵時間為3-5 d時，黃芪多糖含量隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增加(P<0.05)，在5 d時達(dá)到最大。發(fā)酵時間是影響微生物發(fā)酵結(jié)果的重要因素，發(fā)酵時間短，產(chǎn)生相應(yīng)酶量相對較少，影響黃芪多糖釋放；然而發(fā)酵時間過長，培養(yǎng)基所能提供的養(yǎng)分不足，有可能會使產(chǎn)酶的性能下降，影響黃芪多糖產(chǎn)量。同時，隨著發(fā)酵時間延長，培養(yǎng)基中適宜于沼澤紅假單胞菌利用的碳源基本耗盡，此時沼澤紅假單胞菌具有將難降解的多糖作為碳源加以利用以維持其正常的生長代謝，這也可能是發(fā)酵后期黃芪多糖含量降低的原因之一。因此，發(fā)酵時間應(yīng)控制在5 d左右。

圖1 不同發(fā)酵時間對黃芪多糖含量的影響

2.2 菌種接種量對黃芪多糖含量的影響 菌種接種量對黃芪多糖含量的影響見圖2。如圖2所示，當(dāng)菌種接種量為6%時，黃芪多糖含量最大，之后隨著菌種接種量的增加，黃芪多糖含量有一個緩慢下降的趨勢。沼澤紅假單胞菌的生長受到接種量的影響較大，接種量過低會使發(fā)酵周期延長，不利于實際生產(chǎn)。因此，在利用沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪，選擇菌種接種量時應(yīng)控制在6%左右。

圖2 不同接種量對黃芪多糖含量的影響

2.3 發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響 發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響如圖3所示。由圖3可知，發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響較大，隨著溫度的升高黃芪多糖含量也顯著升高(P<0.05)，當(dāng)溫度為40 ℃時黃芪多糖含量達(dá)到最大。這種趨勢產(chǎn)生的原因可能是高溫有利于黃芪多糖的釋放，但沼澤紅假單胞菌的最適生長溫度為30-35 ℃，溫度過高的會嚴(yán)重抑制其正常生長代謝。因此，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪發(fā)酵溫度不易過高，應(yīng)該控制在40 ℃以內(nèi)。

圖3 不同發(fā)酵溫度對黃芪多糖含量的影響

2.4 初始培養(yǎng)基pH值對黃芪多糖含量的影響 初始培養(yǎng)基pH值對黃芪多糖含量的影響見圖4。由圖4可知，初始培養(yǎng)基pH值對黃芪多糖含量有一定的影響，起初黃芪多糖隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高而增加，在培養(yǎng)基初始pH值為6.6時黃芪多糖含量達(dá)到最大。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值繼續(xù)升高，黃芪多糖含量小幅下降，這一趨勢與沼澤紅假單胞菌的最適生長pH相似。因此，在培養(yǎng)基初始pH值應(yīng)控制在6.6左右。

圖4 不同初始培養(yǎng)基pH值對黃芪多糖含量的影響

2.5 正交試驗結(jié)果 由表2和表3可知，4個因子中，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對黃芪發(fā)酵液中的黃芪多糖含量產(chǎn)生了極顯著性的影響(P<0.01)。根據(jù)F值水平將各因子對黃芪多糖含量的影響強(qiáng)弱排序為：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>菌種接種量>培養(yǎng)基初始pH值。最佳發(fā)酵條件為A3B3C3D1，即發(fā)酵時間6 d、接種量10%、發(fā)酵溫度40 ℃和初始培養(yǎng)基pH為6.2，在此條件下，黃芪多糖含量達(dá)到了111.40 μg/mL，與對照組相比提高了51.56%。

表2 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪多糖含量影響的正交試驗結(jié)果

表3 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵對黃芪多糖含量影響的方差分析

3 討論與結(jié)論

植物源性中藥材的有效成分主要存在于細(xì)胞間質(zhì)包裹的胞漿和植物細(xì)胞壁中，而細(xì)胞壁是由不同纖維和膠質(zhì)類物質(zhì)組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。因此，在中藥提取過程中需要克服多重阻力，才能將胞漿中的有效活性成分釋放出來[7]。中藥發(fā)酵是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法，即以傳統(tǒng)中藥材為發(fā)酵原料，藥材中多糖類、苷類、黃酮類等物質(zhì)可為微生物的生長提供營養(yǎng)，同時微生物在生長代謝過程中分泌大量的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等胞外酶，可使植物細(xì)胞破裂，細(xì)胞間隙增大，可促進(jìn)中藥中有效成分的溶出，達(dá)到提高中藥有效成分提取率的目的[15]。陳麗艷等[16]研究結(jié)果顯示，黃芪經(jīng)側(cè)耳菌(Pleurotusostreatus)發(fā)酵后黃芪多糖的提取率及含量大幅提高，含量增加了71.70%，充分體現(xiàn)了中藥發(fā)酵可以使黃芪多糖較大限度的釋放；郭羽等[17]利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵黃芪，結(jié)果表明發(fā)酵對黃芪中多糖含量有一定影響，其產(chǎn)率與傳統(tǒng)法相比提高了14.28%；郭云霞等[10]通過甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌(Bacillusmethylotrophic)N-14發(fā)酵黃芪后總多糖的含量提高了57.31%。本文利用沼澤紅假單胞菌為發(fā)酵菌種，以中藥黃芪作為培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行液體發(fā)酵取得了相似的結(jié)果，在最佳發(fā)酵工藝條件下黃芪多糖含量比對照組提高了51.56%。微生物發(fā)酵黃芪是經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，會受到發(fā)酵菌種、發(fā)酵成分及發(fā)酵條件等因素的影響。李美潔等[10]報道沼澤紅假單胞菌能夠分解利用木質(zhì)素為碳源進(jìn)行生長，這可能是沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪導(dǎo)致黃芪多糖含量增加的原因之一。

目前報道的中藥發(fā)酵菌種主要是一些真菌和細(xì)菌，對于種類和數(shù)量眾多的微生物而言，僅為極少部分，因此具有極大的研究開發(fā)空間。本文利用實驗保藏的一株沼澤紅假單胞菌對黃芪進(jìn)行發(fā)酵，能顯著提高黃芪多糖的得率，豐富了中藥發(fā)酵技術(shù)的發(fā)酵菌種資源。此外，該沼澤紅假單胞菌新陳代謝方式多樣，可以通過自然界存在的 4 種代謝模式進(jìn)行生長，包括光合自養(yǎng)、光合異養(yǎng)、化學(xué)自養(yǎng)和化學(xué)異養(yǎng)[10]。因此，研究將為發(fā)酵黃芪的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的思路。

研究通過沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪，發(fā)酵后黃芪多糖較對照組顯著提高(P<0.01)。利用正交試驗優(yōu)化了沼澤紅假單胞菌發(fā)酵黃芪的條件，在最佳發(fā)酵條件下即發(fā)酵天數(shù)6 d，接種量10%，發(fā)酵溫度40 ℃和初始培養(yǎng)基pH為6.2時，黃芪多糖含量可高達(dá)111.40 μg/mL，與對照組相比提高了51.56%。研究結(jié)果將為微生物發(fā)酵黃芪提供菌種資源以及黃芪的高效利用提供理論支持。