田 凱，許 丹，盧 迪，謝書宇，趙寶凱*

(1.沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司.沈陽110020；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢.430070)

阿苯達(dá)唑(albendazole，ABZ)，別名丙硫咪唑，化學(xué)名稱為5-丙硫基-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是苯并咪唑類的廣譜抗寄生蟲藥，現(xiàn)已被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定成為抗棘球蚴病的首要藥物之一。近年來臨床應(yīng)用廣泛，且療效得到了廣泛認(rèn)可[1]。遺憾的是，阿苯達(dá)唑溶解性低、首過效應(yīng)強，在胃腸道吸收率極低，在血漿和肝臟組織中濃度不高，對非腸道寄生蟲如細(xì)粒棘球蚴病等治愈率僅為30%[2]。目前市場上阿苯達(dá)唑經(jīng)常使用的制劑類型以片劑、粉劑和混懸劑為主?；鞈覄┰诮o藥途徑上優(yōu)于片劑和粉劑，但由于阿苯達(dá)唑溶解度較差，普通混懸液的生物利用度依然很低。目前阿苯達(dá)唑的溶解性低、生物利用度低等缺點已經(jīng)嚴(yán)重制約其在獸醫(yī)臨床上的使用，因此開發(fā)新制劑技術(shù)提高其生物利用度非常必要。

納米晶體(Nanocrystals，NC)，是將水難溶性的藥物或藥物化合物在穩(wěn)定劑的作用下分散于介質(zhì)中(常以水為介質(zhì))，利用機械研磨、高壓均質(zhì)、控制析晶等納米化工藝，將藥物粒徑降低至 1 μm以下，使藥物形成納米膠體分散體系，可以明顯使難溶性藥物的溶解度及生物利用度得以改善。相比其他解決藥物難溶性問題的方法，此方法不需要加入任何載體，只需在制備過程中加入穩(wěn)定劑來穩(wěn)定制備的納米晶體，具有生產(chǎn)工藝簡單、納米混懸液制劑溶解性好、生物利用度高的優(yōu)點，因此利用此方法可有效解決難溶性藥物臨床應(yīng)用問題，有利于藥物在腸道內(nèi)吸收并延長藥物的體內(nèi)作用時間，從而提高難溶性藥物的生物利用度[3-4]。

通過改變傳統(tǒng)的混懸劑制備工藝，本研究利用反溶劑法-高壓勻質(zhì)法制備阿苯達(dá)唑納米混懸劑，并考察該制劑的藥劑學(xué)特征及穩(wěn)定性；同時進(jìn)行大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，考察其生物利用度，為提高阿苯達(dá)唑的臨床效果提供新的策略。

1 材 料

1.1 藥品與試劑 阿苯達(dá)唑?qū)φ掌?含量99.9%，批號100373-201103)，甲苯咪唑?qū)φ掌?含量99.8%，批號H1032011)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；阿苯達(dá)唑亞砜對照品(含量99.07%，批號G119446)，購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；阿苯達(dá)唑原料(含量99.2%，批號9011806059)，購自連云港亞暉醫(yī)藥有限公司；蘋果酸，購自西安天正藥用輔料有限公司；肝素鈉、吐溫80、苯甲酸鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚維酮K30(PVPK-30)(批號20180603)，購自湖州展望藥業(yè)有限公司。阿苯達(dá)唑伊維菌素粉(含量10%，規(guī)格250 g，批號2019040101)，沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司；阿苯達(dá)唑混懸液(含量10%，規(guī)格100 ml，批號2019101701)，佛山市正典生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈，色譜純；氫氧化鈉、乙酸乙酯、冰醋酸、95%乙醇，分析純；均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器 LC-1260高效液相色譜儀，美國AgiLent公司；分析天平MS105DU/A，梅特勒-托利多公司；PGC-01D型氮吹儀，天津艾維歐科技發(fā)展有限公司；UV-2501PC 紫外分光光度計，日本島津公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-18C高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；XH-C渦旋混合器，常州邁科諾儀器有限公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano-ZS90納米粒度電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；高壓勻質(zhì)機APV2000，德國APV公司。

1.3 試驗動物 清潔級 SD大鼠30只，雄性，體重200±20 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。試驗前正常飼養(yǎng)1周，自由飲水和采食；并于試驗前1 d檢查確認(rèn)試驗動物處于良好的健康狀態(tài)。

2 方 法

2.1 阿苯達(dá)唑納米混懸劑的處方篩選 根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017版)收載，阿苯達(dá)唑混懸液規(guī)格為100 mL：10 g。故本研究以阿苯達(dá)唑為主藥，按照混懸劑制備要求，通過單因素試驗進(jìn)行納米混懸劑中助溶劑、穩(wěn)定劑的篩選[5]。通過粒徑測定，最終確定L-蘋果酸為助溶劑，吐溫80 與PVPK-30為穩(wěn)定劑，苯甲酸鈉為防腐劑。

2.2 制備工藝 按照配方比例，先將助溶劑蘋果酸用少量蒸餾水溶解，加熱至80 ℃～90 ℃，將阿苯達(dá)唑原料加入其中，保持加熱溫度使其完全溶解于助溶劑溶液中；另稱取穩(wěn)定劑吐溫80和PVPK-30溶于適量蒸餾水中，使用高速分散器在剪切條件下將溶解的阿苯達(dá)唑溶液緩慢加入穩(wěn)定劑溶液中，使阿苯達(dá)唑重新結(jié)晶析出，通過剪切獲得較小的粒徑，得到制劑初混液。將制劑初混液置于高壓均質(zhì)機中，設(shè)定溫度、壓力及均質(zhì)次數(shù)進(jìn)行均質(zhì)，即獲得納米混懸液。向制得的納米晶體混懸液中加入適量已溶解的防腐劑，攪拌均勻并調(diào)節(jié)pH，最后加純化水至全量，混合均勻即得。

2.3 納米混懸劑的質(zhì)量評價

2.3.1 納米混懸劑的質(zhì)量檢測 參照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017版)中“阿苯達(dá)唑混懸液”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢查。檢測項包括制劑的外觀、色澤、pH值、沉降體積比及含量。重分散性檢測項參照《藥劑學(xué)》(第七版)中混懸劑“重新分散性”檢測方法進(jìn)行檢查。

2.3.2 納米顆粒形態(tài)及粒徑分布 將納米混懸液進(jìn)行掃描電鏡檢測，觀察藥物形態(tài)特征。并測定納米混懸液的粒徑大小及分布。

2.3.3 制劑穩(wěn)定性研究 參照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)中的“制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”，對該納米混懸劑進(jìn)行常溫、加速考察試驗，定期6個月，研究該制劑在高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性。

2.4 藥物動力學(xué)試驗

2.4.1 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計 將大鼠隨機分為三組，一組給藥阿苯達(dá)唑伊維菌素粉，一組給藥本研究制備的阿苯達(dá)唑納米混懸液，一組給藥佛山正典的阿苯達(dá)唑混懸液，給藥前12 h禁食，自由飲水，給藥后6 h恢復(fù)進(jìn)食。根據(jù)阿苯達(dá)唑在豬上的臨床使用劑量，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，進(jìn)行換算得出大鼠的使用劑量為45 mg/kg.bw，進(jìn)行灌胃給藥；三組藥物給藥前均用適量水稀釋制成儲備液備用，對每只大鼠進(jìn)行稱重標(biāo)記，按照 2 mL/0.2 kg 大鼠體重進(jìn)行灌胃。并于給藥前、給藥后0.5、1.5、3、4、5、6、7、8、12和24 h從尾靜脈取血約0.5 mL置于肝素抗凝的離心管中，4000 r·min-1離心10 min，分離血漿，保存于-20 ℃，待測定。

2.4.2 大鼠血中阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSX)的色譜條件 色譜柱：Ultimate?XB-C18，3 μm，4.6×250 mm；流動相(甲醇：乙腈 =1∶1)與水按照70∶30(V/V)的初始比例進(jìn)行梯度洗脫，在 0～34 min水相比例由 70%→30%；在 34～40 min其比例由 30% →70%；檢測波長 295 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫 35±1 ℃[2]。

2.4.3 血漿樣品處理 精確量取200 μL大鼠血漿，置于2 mL離心管中，依次加入 NaOH溶液50 μL(0.4 mol/L)，甲苯咪唑(MBZ)內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL(10 μg/mL)及1.0 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩 3 min，于12000 r·min-1離心10 min；吸取上清液置于另一離心管，并于第一管中再加入0.5 m L乙酸乙酯，重復(fù)前述操作進(jìn)行渦旋振蕩及離心，合并兩次上清液，40 ℃氮氣流吹干，殘留物用200 μL甲醇乙腈混合液(V/V=1∶1)溶解，12000 r·min-1離心 10 min，取上清即為待測樣品，進(jìn)樣量50 μL[2，7]。

2.4.4 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取空白血漿200 μL 9份，分別置 2 mL離心管中，留一支作為空白對照，其他分別加入等量的甲苯咪唑(MBZ)內(nèi)標(biāo)溶液，然后各加入不同量的阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSX)標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到藥液濃度依次為0.01、0.02、0.05、0.2、1、3.5、7、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。按照“血漿樣品處理”方法處理，進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖。以測得的ABZSX峰面積與內(nèi)標(biāo)MBZ峰面積的比值為橫坐標(biāo)(x)，ABZSX濃度(y)為縱坐標(biāo)，建立血漿中ABZSX標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程，求得相關(guān)系數(shù)(r)。

2.4.5 方法學(xué)驗證 取空白血漿200u L，分別加入經(jīng)稀釋的高、中、低三個濃度的ABZSX標(biāo)準(zhǔn)工作液，混合均勻，以制成含ABZSX濃度分別是0.2、3.5、10 μg/mL的血漿樣品，按照“血漿樣品處理”方法處理，進(jìn)行HPLC檢測，每個濃度一天內(nèi)制備5個平行樣品檢測，考察日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)重復(fù)檢測5 d，測定日間變異系數(shù)。并計算方法的回收率、準(zhǔn)確度及精密度。

2.4.6 大鼠血漿中藥物濃度的測定 同一只鼠的血漿樣品在同一分析批內(nèi)完成，按照“血漿樣品處理”方法處理檢測，將得到的ABZSX的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算各時間點血漿中ABZSX的濃度。

2.5 數(shù)據(jù)分析 利用ExceL軟件分析處理檢測方法學(xué)數(shù)據(jù)，繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及藥-時曲線圖；并利用藥動學(xué)分析軟件Winnonlin5.2以非房室模型處理血漿濃度-時間數(shù)據(jù)，獲得的藥動學(xué)參數(shù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 阿苯達(dá)唑納米混懸劑的制備工藝 以納米混懸液粒徑為評價指標(biāo)，根據(jù)配方篩選單因素試驗結(jié)果，選擇L9(34)表設(shè)計，進(jìn)行正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化勻質(zhì)壓力(A)、均質(zhì)次數(shù)(B)、勻質(zhì)溫度(C)的工藝條件。正交試驗各因素與水平、正交設(shè)計試驗結(jié)果見表1，表2。

表1 正交設(shè)計試驗的因素與水平

表2 正交設(shè)計表

納米晶體粒徑受各因素影響的主次關(guān)系為A>B>C，說明勻質(zhì)壓力對納米晶體制備影響最大。根據(jù)正交試驗結(jié)果，優(yōu)選的工藝參數(shù)為溫度30 ℃，100 MPa和50 MPa下各循環(huán)25次。同時為保證制備工藝的可行性，按照最佳工藝條件進(jìn)行3次不同批量的重復(fù)試驗，所得結(jié)果平均粒徑為(365.43±1.68)nm，說明優(yōu)選出的制備工藝穩(wěn)定可行。

3.2 阿苯達(dá)唑納米混懸液的質(zhì)量評價

3.2.1 質(zhì)量檢測結(jié)果 該納米混懸劑外觀為類白色，長時間靜置，性狀無明顯變化。pH值在5.0～7.0內(nèi),含量為99.6%，沉降體積比為0.99，符合規(guī)定。

室溫下，將該制劑置于100 mL 具塞量筒中，密塞放置，沉降7 d后，并以20 次/min 的速度翻轉(zhuǎn)量筒，底部沉降物隨即消失，說明制劑重分散性較好。

3.2.2 形態(tài)觀察與粒徑分布結(jié)果 納米混懸液在掃描電鏡下藥物形狀大小均一，且中位粒徑為358.1 nm。具體見圖1、表3。

表3 阿苯達(dá)唑納米混懸液的粒徑分布

圖1 阿苯達(dá)唑納米混懸液掃描電鏡圖片

3.2.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果 將納米混懸劑在溫度30±2 ℃，相對濕度65±5%的條件下進(jìn)行加速試驗，并分別于1個月、2個月、3個月、6個月考察樣品的各檢測項，與常溫放置樣品比較均無明顯差異。同時對放置6個月的樣品進(jìn)行粒徑檢測，結(jié)果顯示粒徑有所增加，但仍為納米級，具體結(jié)果見表4、表5。

表4 阿苯達(dá)唑納米混懸液加速試驗結(jié)果

表5 阿苯達(dá)唑納米混懸液的物理穩(wěn)定性

3.3 阿苯達(dá)唑納米混懸液在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)特征

3.3.1 方法專屬性 阿苯達(dá)唑亞砜ABZSX在本試驗所建立的色譜條件下，保留時間為9.7 min，基線平穩(wěn)，藥物峰形良好，均能與雜質(zhì)峰良好分離，檢測效率高。內(nèi)標(biāo)甲苯咪唑的保留時間為22 min，阿苯達(dá)唑保留時間為28 min?？瞻籽獫{色譜圖如圖2，空白血漿添加ABZSX(2ug/mL)、內(nèi)標(biāo)MBZ(10 μg/mL)、阿苯達(dá)唑ABZ(3 μg/mL)的色譜圖如圖3，樣品血漿色譜圖如圖4。

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 空白血漿中添加ABZSX、MBZ、ABZ色譜圖

圖4 給藥后血漿中ABZSX、MBZ、ABZ色譜圖

3.3.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSX)在 0.02～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，血漿藥物濃度與ABZSX峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積二者比值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.2501x+0.0147，相關(guān)系數(shù)r為0.9992。

3.3.3 方法學(xué)驗證結(jié)果 阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSX)在 0.02～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，該分析方法的回收率為83.39%～95.41%；日內(nèi)變異系數(shù)均在6.29%以內(nèi)，日間變異系數(shù)均在6.19%以內(nèi)，精密度良好；檢測限(LOD)、定量限(LOQ)分別為0.01、0.02 μg/mL。

3.3.4 藥物動力學(xué)數(shù)據(jù) 大鼠口服三種制劑的各時間點平均血藥濃度見表6，平均血藥濃度-時間曲線見圖5。采用非房室模型分析方法估算三種制劑的藥動學(xué)參數(shù)及相對生物利用度，具體藥物動力學(xué)參數(shù)見表7。

圖5 大鼠口服阿苯達(dá)唑伊維菌素粉及2種混懸液(45 mg/kg.bw)后ABZSX的血藥濃度-時間曲線

表6 大鼠口服阿苯達(dá)唑伊維菌素粉及2種混懸液(45 mg/kg.bw)后各時間點代謝產(chǎn)物ABZSX的血藥濃度(n=10)

表7 大鼠口服阿苯達(dá)唑伊維菌素粉及2種混懸液(45 mg/kg.bw)后ABZSX的主要藥動學(xué)參數(shù)(n=10)

研制的阿苯達(dá)唑納米混懸液與阿苯達(dá)唑伊維菌素粉、佛山正典阿苯達(dá)唑混懸液的血藥峰濃度Cmax分別為5.895、2.804、2.053 μg/mL，藥物達(dá)峰時間 Tmax分別為 4.0、4.667和4.40 h，表明研制的阿苯達(dá)唑納米混懸液藥物峰濃度顯著高于阿苯達(dá)唑伊維菌素粉及佛山正典阿苯達(dá)唑混懸液，吸收速率明顯高于其他兩種制劑；且其對阿苯達(dá)唑伊維菌素粉、佛山正典阿苯達(dá)唑混懸液的相對生物利用度分別為214.0% 和299.74%，表明研制的阿苯達(dá)唑納米混懸液能顯著提高阿苯達(dá)唑的生物利用度。

4 討論與結(jié)論

納米晶體是提高難溶性藥物溶解度的有效策略之一[8]，本研究納米混懸劑制備工藝主要是將“Bottom-up”技術(shù)中的沉淀技術(shù)與“Top-down”技術(shù)中的高壓均質(zhì)技術(shù)聯(lián)合起來使用，即反溶劑法-高壓勻質(zhì)法[9]。沉淀過程當(dāng)中藥物在析出時會產(chǎn)生結(jié)晶態(tài)顆粒的納米晶體，或者產(chǎn)生無定型態(tài)的納米晶體，在此兩種形態(tài)的納米晶體基礎(chǔ)上，再次進(jìn)行高壓均質(zhì)會較容易獲得分散指數(shù)及粒徑更小的納米晶體。同時在藥物沉淀過程中通過高速分散器剪切，使析出的納米晶體通過初步剪切獲得較小粒徑，得到初混液，在將初混液進(jìn)行高壓勻質(zhì)，避免需要更多的均質(zhì)化循環(huán)和更大的循環(huán)壓力使粒徑降低，可節(jié)約時間減低機器磨損。

納米混懸劑在配方上，改變了傳統(tǒng)沉淀法是將藥物溶解于有機溶劑中，穩(wěn)定劑溶解至反溶劑(通常是水)中進(jìn)行結(jié)晶析出的方法。傳統(tǒng)沉淀法的缺點是需要將藥物溶解在有機溶劑中，得到的納米混懸液會殘留有機溶劑，物理穩(wěn)定性較差，易產(chǎn)生沉降聚集使藥物負(fù)載量低[10]。本研究未采用有機溶劑，而是將藥物溶解在助溶劑蘋果酸溶液中，在保證藥物性質(zhì)穩(wěn)定的加熱條件下，進(jìn)行溶解后，加入穩(wěn)定劑水溶液中進(jìn)行結(jié)晶析出。該制劑中輔料蘋果酸可用于藥物制劑，有利于藥物在體內(nèi)吸收、擴散，對機體有益。

本研究納米混懸劑的質(zhì)量評價及制劑穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，其符合《中國獸藥典》2015版中對混懸液的質(zhì)量要求，并在規(guī)定條件下進(jìn)行加速試驗6個月，經(jīng)檢測均符合質(zhì)量要求，說明本研究阿苯達(dá)唑納米混懸液具有很高的物理穩(wěn)定性。

阿苯達(dá)唑口服后，被代謝為阿苯達(dá)唑亞砜ABZSX、阿苯達(dá)唑砜ABZSN及ABZSO2-NH2，其中最主要代謝產(chǎn)物為ABZSX，它也是抗棘球蚴病的活性成分[11]。大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)和相對生物利用度實驗結(jié)果表明，口服本研究的阿苯達(dá)唑納米混懸液與阿苯達(dá)唑伊維菌素粉、佛山正典阿苯達(dá)唑混懸液相比，體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù) Tmax、Cmax、AUC0-∞、Vz_F、Cl_F、t1/2均有顯著差異；本制劑的生物利用度顯著高于粉劑(相對生物利用度 F為214.0 %)、佛山正典產(chǎn)品(相對生物利用度 F為299.74 %)。阿苯達(dá)唑?qū)儆跐舛纫蕾囆运幬?，藥物濃度的提高將顯著提高其臨床治療效果。

本研究中，大鼠單劑量(45 mg/kg.bw)口服阿苯達(dá)唑納米混懸液后，納米混懸劑組Tmax為4.0 h，Cmax為5.895 μg/mL；粉劑組Tmax為4.667 h，Cmax為2.804 μg/mL；納米混懸劑相對粉劑組生物利用度為214.0%。與任潔如等[12]研究的大鼠單劑量(63 mg/kg.bw)口服阿苯達(dá)唑納米微粉的結(jié)果基本趨勢一致，即納米微粉組Tmax為3.15 h，Cmax為6.11 μg/mL；原料藥組Tmax為3.42 h，Cmax為3.20 μg/mL；納米微粉相對原料藥的生物利用度為157.0%；說明阿苯達(dá)唑納米制劑可提高藥物在體內(nèi)的吸收速度和吸收量，以提高藥物生物利用度，增強藥物療效。

綜上，將阿苯達(dá)唑采用反溶劑法-高壓勻質(zhì)法制備的納米混懸液，可獲得更小的藥物粒徑，與阿苯達(dá)唑伊維菌素粉、佛山正典阿苯達(dá)唑混懸液相比，藥物制劑粒徑的減小使其更易迅速均勻的分散于胃腸液中，在胃腸道內(nèi)吸收迅速且吸收量增加，提高藥物生物利用度，增強驅(qū)蟲效果。本研究將對阿苯達(dá)唑的新劑型研發(fā)和臨床使用提供重要參考。