羅麗丹 李達(dá)佑 鐘 華 曹玲英 劉婷婷

白內(nèi)障是由于老化作用而導(dǎo)致晶狀體混濁所引起的眼部疾病，常發(fā)生于65歲以上老年人，當(dāng)病情進(jìn)展到最后階段時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者失明[1]。手術(shù)為當(dāng)前治療白內(nèi)障的有效策略，由于患者多為老年人，手術(shù)治療出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，了解白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，有利于尋找藥物預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)展，減輕白內(nèi)障致盲的風(fēng)險(xiǎn)。晶狀上皮細(xì)胞氧化損傷是白內(nèi)障病情進(jìn)展的病理學(xué)基礎(chǔ)。以往的研究多聚焦于人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)中活性氧(ROS)引起的蛋白質(zhì)氧化、DNA損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及其引起的細(xì)胞凋亡[2]。研究顯示，ROS也可激活細(xì)胞焦亡信號(hào)參與白內(nèi)障的發(fā)生[3]。焦亡發(fā)生時(shí)，NOD樣受體蛋白3(NLRP3)與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和caspase-1前體組成炎癥小體復(fù)合物，響應(yīng)環(huán)境和細(xì)胞應(yīng)激，剪切并激活自身蛋白酶caspase-1，從而導(dǎo)致切割消皮素D(GSDMD)激發(fā)細(xì)胞膜穿孔，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。地黃為治療白內(nèi)障的中藥方劑所含的共有成分，如杞菊地黃丸[4]、六味地黃湯加減方[5]等，地黃多糖是地黃的重要活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[6]。然而，地黃多糖對(duì)HLEC氧化損傷的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)HLEC建立細(xì)胞氧化損傷模型，探討地黃多糖對(duì)HLEC氧化損傷及焦亡的調(diào)控作用，以期為白內(nèi)障的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料B-3細(xì)胞(HLEC)、EMEM培養(yǎng)基(美國(guó)ATCC公司)，地黃多糖(四川維克奇生物公司)，H2O2、青霉素、鏈霉素、羧甲基纖維素鈉(美國(guó)Sigma公司)，ROS試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18 ELISA試劑盒、丙二醛(MDA)比色試劑盒、CCK-8試劑盒、胎牛血清(上海生工生物工程有限公司)，NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、GSDMD、GAPDH抗體和HRP二抗(英國(guó)Abcam公司)，GSDMD-N抗體和熒光二抗(美國(guó)Affinity公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取B-3細(xì)胞接種于含青霉素(100 U·L-1)、鏈霉素(100 mg·L-1)的雙抗及體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 H2O2和地黃多糖作用濃度的篩選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B-3細(xì)胞接種于96孔板(每孔5×103個(gè)細(xì)胞)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：(1)分別使用含0 mol·L-1、12.5 mol·L-1、25.0 mol·L-1、50.0 mol·L-1、100.0 mol·L-1、200.0 mol·L-1、400.0 mol·L-1、800.0 mol·L-1H2O2的培養(yǎng)基處理B-3細(xì)胞24 h，加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h，測(cè)定450 nm下光密度(D450)，計(jì)算細(xì)胞活力，篩選細(xì)胞活力為50%左右時(shí)的H2O2濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)分別使用含0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1、160.0 mg·L-1地黃多糖的培養(yǎng)基處理B-3細(xì)胞24 h，CCK-8法同上，檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞活力，篩選無(wú)毒劑量。(3)分別使用含0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1地黃多糖的培養(yǎng)基預(yù)處理B-3細(xì)胞24 h，隨后換為含100 mol·L-1H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，CCK-8法同上，檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞活力，篩選地黃多糖抑制H2O2致B-3細(xì)胞損傷的最佳作用濃度。

1.2.3 細(xì)胞分組依據(jù)篩選的地黃多糖抑制H2O2致B-3細(xì)胞損傷的最佳作用濃度處理細(xì)胞，將B-3細(xì)胞分為：空白組、H2O2組和地黃多糖組?？瞻捉M：用10 g·L-1羧甲基纖維素鈉預(yù)處理細(xì)胞24 h后，換為EMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；H2O2組：用10 g·L-1羧甲基纖維素鈉預(yù)處理細(xì)胞24 h后，換為含100 mol·L-1H2O2的EMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；地黃多糖組：用含40 mg·L-1地黃多糖的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞24 h后，換為含100 mol·L-1H2O2的EMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.4 細(xì)胞焦亡情況觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B-3細(xì)胞接種在放有蓋玻片的24孔板中，分組處理后，培養(yǎng)至細(xì)胞爬片，取玻片先后經(jīng)PBS浸洗3次、40 g·L-1多聚甲醛固定20 min、山羊血清封閉25 min、一抗(GSDMD-N，1200)孵育過(guò)夜、Cy3標(biāo)記熒光二抗(1500)避光孵育45 min，最后封片，在熒光顯微鏡下采集圖像并分析。另外，將PBS浸洗后的玻片，依次經(jīng)10 g·L-1鋨酸固定1 h、乙醇逐步脫水、干燥、真空噴鍍金屬化處理后在掃描電鏡下采集圖像。

1.2.5 細(xì)胞ROS水平和MDA含量檢測(cè)將B-3細(xì)胞分組處理后，換用含10 mol·L-1DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)20 min，離心收集細(xì)胞，制備密度為1×106個(gè)·mL-1的單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。另外收集細(xì)胞裂解液，離心取上清，按照體積比12加入MDA檢測(cè)工作液，測(cè)定D530，計(jì)算MDA含量。

1.2.6 培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量檢測(cè)收集各組培養(yǎng)液，離心取上清，依次加入IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒中各試劑，測(cè)定D450，計(jì)算IL-1β、IL-18含量。

1.2.7 NLRP3/caspase-1途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Western blot檢測(cè)各組B-3細(xì)胞NLRP3/caspase-1通路蛋白表達(dá)水平。收集各組細(xì)胞(1×106個(gè))，提取總蛋白并測(cè)定濃度。取20 g蛋白樣品煮沸變性后上樣，電泳分離各蛋白并轉(zhuǎn)膜，隨后將PVDF膜與5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、pro-caspase-1、GSDMD、GAPDH，1500)孵膜過(guò)夜，HRP二抗(12000)孵膜1 h，最后用化學(xué)發(fā)光液顯影，采集圖像并分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0和GraphPad 8.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，并用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 篩選合適的H2O2和地黃多糖作用濃度

2.1.1 篩選合適的H2O2誘導(dǎo)濃度細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，B-3細(xì)胞存活率隨H2O2作用濃度增加逐漸降低，其中100 mol·L-1H2O2誘導(dǎo)24 h后，B-3細(xì)胞存活率為(50.48±8.05)%，接近半數(shù)抑制濃度(100.60 mol·L-1)，故采用100 mol·L-1H2O2誘導(dǎo)24 h建立B-3細(xì)胞氧化損傷模型(圖1)。

圖1 不同濃度H2O2誘導(dǎo)后B-3細(xì)胞存活率 與0 mol·L-1 H2O2相比，*P<0.05。

2.1.2 篩選地黃多糖最佳作用濃度經(jīng)計(jì)算，地黃多糖的半數(shù)抑制濃度為133.10 mg·L-1，與0 mg·L-1地黃多糖相比，2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1地黃多糖干預(yù)對(duì)B-3細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，即為無(wú)毒劑量(圖2)。

圖2 不同濃度地黃多糖干預(yù)后B-3細(xì)胞存活率 與0 mg·L-1 地黃多糖相比，*P<0.05。

2.1.3 篩選地黃多糖抑制H2O2致B-3細(xì)胞損傷的最佳作用濃度與100 mg·L-1H2O+0 mg·L-1地黃多糖相比，2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1地黃多糖干預(yù)后100 mol·L-1H2O2誘導(dǎo)損傷的B-3細(xì)胞存活率顯著增高(均為P<0.05)，后續(xù)采用40.0 mg·L-1地黃多糖干預(yù)24 h進(jìn)行研究(圖3)。

圖3 地黃多糖抑制H2O2致B-3細(xì)胞損傷的最佳作用濃度 與0 mol·L-1 H2O2 + 0 mg·L-1 地黃多糖相比，*P<0.05；與100 mol·L-1 H2O2 + 0 mg·L-1 地黃多糖相比，#P<0.05。

2.2 掃描電鏡及免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞焦亡情況掃描電鏡結(jié)果顯示：空白組細(xì)胞呈圓球形，邊界規(guī)則；H2O2組細(xì)胞腫脹變大，邊界不規(guī)則；地黃多糖組細(xì)胞腫脹程度減輕(圖4)。與空白組[每視野(1.20±0.13)個(gè)GSDMD-N陽(yáng)性(+)細(xì)胞]相比，H2O2組GSDMD-N+細(xì)胞數(shù)為每視野(15.33±1.25)個(gè)，GSDMD-N+細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；與H2O2組相比，地黃多糖組GSDMD-N+細(xì)胞數(shù)為每視野(5.33±0.46)個(gè)，GSDMD-N+細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)(圖4)。

圖4 掃描電鏡及免疫熒光染色觀察細(xì)胞焦亡情況 (掃描電鏡:×5000；GSDMD-N免疫熒光染色：×400)

2.3 各組B-3細(xì)胞ROS水平和MDA含量檢測(cè)結(jié)果與空白組相比，H2O2組B-3細(xì)胞ROS水平、MDA含量均顯著增加(q=53.049、26.537，均為P<0.05)；與H2O2組相比，地黃多糖組B-3細(xì)胞ROS水平、MDA含量均顯著降低(q=46.997、17.233，均為P<0.05)(表1)。

表1 各組B-3細(xì)胞ROS水平和MDA含量

2.4 各組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量與空白組相比，H2O2組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量均增加(q=35.136、28.992，均為P<0.05)；與H2O2組相比，地黃多糖組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量均降低(q=20.694、11.618，均為P<0.05)(表2)。

表2 各組培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量比較

2.5 各組B-3細(xì)胞NLRP3/caspase-1通路活化情況與空白組相比，H2O2組B-3細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平及caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N/GSDMD均升高(q=36.908、17.285、17.926，均為P<0.05)；與H2O2組相比，地黃多糖組B-3細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平及caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N/GSDMD均降低(q=28.963、11.907、11.951，均為P<0.05)(圖5和表3)。

圖5 Western blot檢測(cè)各組B-3細(xì)胞NLRP3/caspase-1通路蛋白表達(dá)水平

表3 各組B-3細(xì)胞NLRP3/caspase-1通路蛋白表達(dá)水平

3 討論

近些年，白內(nèi)障仍然是導(dǎo)致失明的主要眼病，其所造成的全球負(fù)擔(dān)逐年增加[7-8]。HLEC中氧自由基的過(guò)量生成可引起細(xì)胞焦亡，最主要的特征是炎癥因子釋放[9]。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)可明顯降低B-3細(xì)胞活性，增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平、NLRP3蛋白表達(dá)水平和培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量。而天然多糖類(lèi)化合物地黃多糖具有抗氧化作用，能夠減輕H2O2對(duì)B-3細(xì)胞造成的氧化損傷，同時(shí)下調(diào)NLRP3蛋白表達(dá)，并通過(guò)抑制pro-caspase-1的剪切活化，抑制GSDMD-N誘導(dǎo)的細(xì)胞穿孔和IL-1β等釋放，進(jìn)而抑制HLEC焦亡。這表明地黃多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的B-3細(xì)胞具有抗氧化和抗焦亡作用。

氧化應(yīng)激在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[10]。衰老機(jī)體內(nèi)抗氧化劑減少，ROS等氧化劑水平增多，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)氧化損傷、代謝紊亂、死亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在100 mol·L-1H2O2作用24 h后，B-3細(xì)胞ROS水平及MDA含量顯著上升，細(xì)胞增殖活性明顯降低。對(duì)中藥方劑中的有效活性成分進(jìn)行分析是提高中藥認(rèn)知度的重要策略，作為地黃的主要活性成分，地黃多糖的抗氧化作用被廣泛關(guān)注。OU等[12]研究表明，地黃多糖可以增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕氧化損傷，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。彭輝等[13]研究顯示，地黃多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧下心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡有明顯保護(hù)作用，可以增強(qiáng)抗氧化酶活性并抑制凋亡蛋白表達(dá)。本研究證實(shí)，地黃多糖干預(yù)后，B-3細(xì)胞中ROS水平及MDA含量降低，表明地黃多糖可以減輕HLEC因ROS水平升高而導(dǎo)致的氧化損傷，這可能與地黃多糖的保護(hù)作用有關(guān)。

細(xì)胞焦亡為一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，已證實(shí)人體內(nèi)存在經(jīng)典和非經(jīng)典焦亡途徑，雖然啟動(dòng)信號(hào)不一致，但兩種途徑最終都通過(guò)形成NLRP3炎癥小體活化caspase-1，進(jìn)一步剪切、激活GSDMD，由其活性形式GSDMD-N與細(xì)胞膜中脂類(lèi)結(jié)合，破壞膜的完整性，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[14-16]。研究表明，NLRP3炎癥小體是在細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激等做出反應(yīng)時(shí)所形成的，在白內(nèi)障患者晶狀體中會(huì)積累一定程度的caspase-1和IL-1β[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，LEC中caspase-1、caspase-11和GSDMD表達(dá)水平增加與晶狀體透明度變差同步發(fā)生，且caspase-1抑制劑可減輕細(xì)胞焦亡[18]。本研究觀察到，地黃多糖下調(diào)了NLRP3蛋白的表達(dá)，減少了細(xì)胞焦亡的發(fā)生，抑制了GSDMD和pro-caspase-1的剪切活化，同時(shí)減少了培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量，說(shuō)明地黃多糖可作用于炎癥小體，抑制caspase-1和GSDMD的激活，抑制細(xì)胞焦亡，這可能是地黃多糖保護(hù)H2O2作用下HLEC免受損傷的作用機(jī)制之一。

綜上所述，地黃多糖可以減輕H2O2作用下B-3細(xì)胞的氧化損傷，推測(cè)其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)，這為臨床治療白內(nèi)障提供了新的研究方向，但其詳細(xì)作用機(jī)制仍需深入探究。