楊稀瑞 王繼雪 袁星星 董霏雪 趙 輝

青光眼是世界范圍內(nèi)高致盲性眼病，其特征性表現(xiàn)主要為視野缺損及視神經(jīng)萎縮[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2013年世界范圍內(nèi)青光眼患病人數(shù)約為6400萬(wàn)人，至2020年全球青光眼患病率將升至2.86%，因此，青光眼的防治工作已成為全球亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題之一[3-4]。

目前認(rèn)為，青光眼的病理特征為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)進(jìn)行性丟失及視神經(jīng)變性，臨床表現(xiàn)為視盤病變、視力下降及視野缺損[5]。視神經(jīng)損傷作為青光眼最常出現(xiàn)的視神經(jīng)改變，特征性表現(xiàn)為RGC凋亡及視野喪失[6]。RGC可將視覺信號(hào)通過視路傳入大腦，其凋亡及程序性細(xì)胞死亡被認(rèn)為是青光眼致盲的首要誘因[7]。因此，青光眼的治療主要以阻斷RGC凋亡，提高RGC存活率為主。此外，阻斷青光眼中與RGC丟失相關(guān)的危險(xiǎn)因素，減少RGC變性，同樣是促進(jìn)視神經(jīng)存活的有效手段之一[8]。

基于此，本研究通過篩選GEO(gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)及運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段分析藥物有效成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行GO功能及KEGG富集通路分析，預(yù)測(cè)其治療原發(fā)性青光眼的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并以柴胡-葛根作為干預(yù)措施，通過觀察RGC形態(tài)及其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，以期進(jìn)一步明確柴胡-葛根治療原發(fā)性青光眼的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 柴胡-葛根活性成分篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以“柴胡”“葛根”作為檢索詞，選取2味中藥所含的化合成分。以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件，過濾獲取中藥的化合成分及對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)。

1.2 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化分析利用GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Primary Glaucoma”，收集與青光眼相關(guān)靶點(diǎn)。在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Primary Glaucoma”為關(guān)鍵詞，以“Homo sapiens”為限定物種，檢索與青光眼相關(guān)的差異蛋白，運(yùn)用Interactivenn平臺(tái)將藥物活性成分-疾病-差異蛋白進(jìn)行交集處理，得到Drug-Disease-Target。通過R語(yǔ)言及Cytoscape軟件對(duì)原發(fā)性青光眼進(jìn)行火山圖、熱圖及Drug-Disease-Target可視化網(wǎng)絡(luò)分析的繪制。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將Drug-Disease-Target結(jié)果上傳至String數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。設(shè)定最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.400。運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

1.4 GO功能及KEGG富集分析將Drug-Disease-Target結(jié)果上傳至David平臺(tái)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析，并通過OmicShare平臺(tái)和Cytoscape軟件對(duì)GO功能和KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞清潔級(jí)BALB/c小鼠(8～10周齡)16只，體重8～10 g，經(jīng)專科檢查確認(rèn)未出現(xiàn)眼部疾患。小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物合格證批號(hào)：SYXK(京)：2016-0011]。采用小鼠專用飼料，以專用籠喂養(yǎng)，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。小鼠RGC購(gòu)自武漢普賽諾生命科技有限公司，置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 主要藥品及試劑柴胡、葛根購(gòu)自北京同仁堂，于蒸餾水內(nèi)浸泡1 h，煎藥機(jī)文火煎煮2次，取汁備用，紗布濾過2次，80 ℃水浴中制備成每1 mL含生藥1 g的藥汁混懸液，4 ℃冰箱保存。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(貨號(hào)12183016)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司(貨號(hào)D7168S)。

1.7 分組、造模及給藥BALB/c小鼠16只隨機(jī)分為藥物組和對(duì)照組，每組8只。按照血清藥理學(xué)公式計(jì)算，藥物組小鼠每日灌胃1 mL·kg-1中藥混懸液，對(duì)照組每日灌胃1 mL·kg-1蒸餾水,每日灌胃1次，連續(xù)5 d。于第5天灌胃結(jié)束后予以禁食，次日晨再灌胃1次，1 h后采血，分別提取兩組小鼠的血清備用。將純化培養(yǎng)48 h的RGC隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組、空白+中藥組、模型+中藥組，其中，模型組、模型+中藥組RGC參照文獻(xiàn)[9]采用800 μmol·L-1過氧化氫(H2O2)處理12 h誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷模型，空白組和模型組RGC以稀釋10倍后的對(duì)照組小鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，空白+中藥組、模型+中藥組RGC以稀釋10倍后的藥物組小鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.8 細(xì)胞形態(tài)學(xué)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RGC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，取0.5 mL，PBS緩沖液漂洗2遍，加入1.0～1.5 mL消化液消化、離心后接種于培養(yǎng)皿，同1.7中分組處理，分別于培養(yǎng)12 h、24 h及48 h后，通過倒置相差顯微鏡觀察各組RGC形態(tài)。

1.9 RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)48 h后，使用TRlzol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，再將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin為內(nèi)參，檢測(cè)PI3K和AKT mRNA的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，73 ℃ 10 s，共50個(gè)循環(huán)。PI3K引物序列：正向?yàn)?’-TATTTGGACTTTGCGACAAGACT-3’，反向?yàn)?’-TCGAACGTACTGGTCTGGATAG-3’；AKT引物序列：正向?yàn)?’-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3’，反向?yàn)?’-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3’;β-actin引物序列：正向?yàn)?’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向?yàn)?’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-葛根活性成分篩選結(jié)果通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得柴胡、葛根相關(guān)成分367個(gè)，其中滿足OB≥30%的成分共有185個(gè)，滿足DL≥0.18的成分共有76個(gè)，同時(shí)滿足OB≥30%與DL≥0.18的活性成分為21個(gè)。

2.2 原發(fā)性青光眼的作用靶點(diǎn)通過檢索共篩選出2743個(gè)與原發(fā)性青光眼相關(guān)的靶點(diǎn)。通過二次挖掘GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，并以芯片GSE9944為數(shù)據(jù)原始文件進(jìn)行比較。以R語(yǔ)言進(jìn)行差異基因的分析，共獲得659個(gè)顯著改變與影響的基因，其中上調(diào)基因284個(gè)，下調(diào)基因375個(gè)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的青光眼靶點(diǎn)與R語(yǔ)言分析篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行交集，再與中藥有效活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集，最終獲得與原發(fā)性青光眼相關(guān)的差異蛋白靶點(diǎn)63個(gè)，主要包括IL-6、VEGFA等(圖1)。

2.3 GO功能及KEGG富集分析結(jié)果采用David平臺(tái)對(duì)藥物-疾病行GO功能及KEGG富集分析，并將P值較小的GO生物過程與KEGG通路行可視化分析。柴胡-葛根-青光眼GO功能分析見圖2，由圖可知，柴胡-葛根治療原發(fā)性青光眼的生物學(xué)過程與蛋白結(jié)合、催化、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合及有機(jī)物代謝過程等有關(guān)。柴胡-葛根-青光眼KEGG富集分析見圖3，由圖可知，柴胡-葛根主要通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT、TNF、MAPK、VEGF、JAK-STAT等信號(hào)通路發(fā)揮治療原發(fā)性青光眼的作用。通過Cytoscape軟件對(duì)藥物-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析結(jié)果見圖4。

圖2 柴胡-葛根-青光眼GO功能分析柱狀圖

圖3 柴胡-葛根-青光眼KEGG富集分析結(jié)果

圖4 柴胡-葛根-青光眼-通路分析圖

2.4 倒置相差顯微鏡下觀察各組RGC形態(tài)培養(yǎng)12 h后，空白組RGC逐漸貼壁，細(xì)胞體呈卵圓形，立體感強(qiáng)，折光率高；模型組RGC緩慢貼壁，細(xì)胞體出現(xiàn)變形，折光率低；模型+中藥組RGC緩慢貼壁，立體感較強(qiáng)；空白+中藥組RGC逐漸貼壁，細(xì)胞體呈卵圓形，立體感較強(qiáng)。培養(yǎng)24 h后，空白組RGC基本貼壁，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞體飽滿，周圍出現(xiàn)明顯光暈，呈單層排列，大部分RGC匯聚成團(tuán)，部分RGC可見其膜上突出的圓錐形隆起，呈現(xiàn)不規(guī)則狀；模型組RGC基本貼壁，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞體飽滿程度欠佳，周圍少見光暈，部分細(xì)胞出現(xiàn)聚集；模型+中藥組RGC基本貼壁，生長(zhǎng)速度正常，細(xì)胞體較為飽滿，周圍出現(xiàn)少許光暈，呈單層排列，可見部分細(xì)胞聚集；空白+中藥組RGC基本貼壁，細(xì)胞呈現(xiàn)快速生長(zhǎng)趨勢(shì)，細(xì)胞體飽滿，周圍可見光暈，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞膜伸出圓形或錐形突起。培養(yǎng)48 h后，空白組RGC完全貼壁，可見明顯聚集性生長(zhǎng)，呈團(tuán)狀或串珠樣排列，細(xì)胞體變大，突起增長(zhǎng)；模型組RGC完全貼壁，呈現(xiàn)分散性增長(zhǎng)，細(xì)胞體排列極不整齊，且細(xì)胞體較小，未見顯著突起；模型+中藥組RGC完全貼壁，可見少量聚集性生長(zhǎng)，出現(xiàn)串珠樣排列，細(xì)胞體緩慢增大；空白+中藥組RGC完全貼壁，細(xì)胞可見顯著聚集性生長(zhǎng)，呈現(xiàn)團(tuán)狀或串珠樣改變，排列較為整齊，細(xì)胞體增大(圖5)。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)各組RGC形態(tài) A：空白組；B：空白+中藥組；C：模型組；D：模型+中藥組。

2.5 柴胡-葛根對(duì)RGC各因子mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，空白+中藥組RGC中PI3K和AKT mRNA表達(dá)均下降，模型組、模型+中藥組RGC中PI3K和AKT mRNA表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與模型組相比，模型+中藥組RGC中PI3K和AKT mRNA 表達(dá)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組PI3K、AKT mRNA表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為青光眼屬“五風(fēng)內(nèi)障”范疇，診療歷史悠久，最早可追溯至《神農(nóng)本草經(jīng)》，經(jīng)歷代醫(yī)家不斷研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥對(duì)青光眼所造成的視神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，且呈多組分、多靶點(diǎn)、整體化趨勢(shì)，但尚缺乏對(duì)中藥復(fù)方的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范，且臨床評(píng)價(jià)不一，基礎(chǔ)研究不完善及機(jī)制不明確。因此，對(duì)于青光眼視神經(jīng)保護(hù)治療的中藥種類及療效存在局限性，仍需通過更高水平的基礎(chǔ)及臨床研究加以完善。

柴胡作為升散之品，善于疏肝解郁，通竅明目，引藥上行，通達(dá)于目；葛根升舉陽(yáng)氣，引藥入目，上達(dá)清竅，可助柴胡疏肝理氣，開竅醒神?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，柴胡能夠抗炎、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)RGC。此外，柴胡還能夠抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低血清內(nèi)TNF-β及IL-6表達(dá)[10]。葛根富含葛根素，能有效改善眼底微循環(huán)、調(diào)節(jié)眼底微血管的活力，提高眼底組織缺血缺氧的能力，葛根中的異黃醇甙能夠穩(wěn)定眼底缺血區(qū)活性，解除因缺血所致的眼底微血管痙攣，恢復(fù)眼底血管舒縮，促進(jìn)眼內(nèi)側(cè)支循環(huán)建立。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、VEGFA等在PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名靠前，由此推測(cè)上述蛋白可能是原發(fā)性青光眼治療的主要靶點(diǎn)。IL-6作為常見的促炎因子，貫穿炎癥反應(yīng)的全過程。主要由活化的T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等分泌，參與免疫調(diào)節(jié)，刺激造血細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化等[11]。IL-6受體可分為IL-6Rα及gp130兩種，可通過與gp130的結(jié)合，激活JAK酪氨酸酶及其轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制Bcl-2及Bcl-xL的凋亡[12-13]。GO功能分析結(jié)果顯示，治療原發(fā)性青光眼的生物學(xué)過程與蛋白結(jié)合、催化、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合及有機(jī)物代謝過程等有關(guān)。KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡-葛根治療原發(fā)性青光眼的作用機(jī)制可能與PI3K-AKT等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)相關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K-AKT信號(hào)通路能夠抑制RGC凋亡，PI3K的調(diào)控可以激活A(yù)KT，抑制Caspase-9表達(dá)，降低RGC凋亡；此外，在慢性高壓眼大鼠模型中，Caspase-9的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)RGC損傷，通過下調(diào)PI3K-AKT信號(hào)通路中p-FoxO1及IKK2的表達(dá)，同樣會(huì)抑制RGC的凋亡[14]。

本研究以柴胡-葛根干預(yù)治療H2O2所誘導(dǎo)的RGC，并在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的RGC形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，模型+中藥組RGC從緩慢貼壁到完全貼壁，并可見少量聚集性生長(zhǎng)及串珠樣排列，細(xì)胞體緩慢增大；空白+中藥組RGC完全貼壁，細(xì)胞可見顯著聚集性生長(zhǎng)，呈現(xiàn)團(tuán)狀或串珠樣改變，排列較為整齊，細(xì)胞體增大。繼續(xù)采用RT-PCR法檢測(cè)RGC中PI3K和AKT mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)柴胡-葛根能夠顯著抑制RGC中PI3K和AKT mRNA表達(dá)。

綜上所述，通過對(duì)“柴胡-葛根”治療原發(fā)性青光眼進(jìn)行GEO差異分析，可初步預(yù)測(cè)柴胡-葛根治療原發(fā)性青光眼的藥理機(jī)制；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，柴胡-葛根通過抑制PI3K-AKT信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，起到改善原發(fā)性青光眼的作用。