李 雷 楊名珠 周慶儒 邱瑞琪 雷 博

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是世界范圍內(nèi)50歲以上人群視力損害的主要原因，AMD的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。據(jù)估計(jì)，到2040年，全球AMD患者的數(shù)量將達(dá)到3億[1]。目前，臨床上認(rèn)為慢性炎癥、氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致AMD的主要原因[2]。脂質(zhì)，如膽固醇、三?；视秃偷兔芏戎鞍?LDL)，在視網(wǎng)膜變性中起著重要的作用，特別是在A(yíng)MD發(fā)展的早期和中期階段[3]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是LDL的氧化修飾產(chǎn)物，不能通過(guò)LDL受體途徑代謝[4]。ox-LDL改變了脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎癥以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，可能與AMD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5]。

在哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜中有三種膠質(zhì)細(xì)胞：Müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜的常駐巨噬細(xì)胞，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6]。像外周血中的單核細(xì)胞一樣，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可以極化為兩種主要亞型：“經(jīng)典激活”的M1型和“選擇性激活”的M2型，M1型主要起到促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用，M2型主要與抑制炎癥和修復(fù)有關(guān)。M1型和M2型細(xì)胞的數(shù)量變化可以引起不同的反應(yīng)，在A(yíng)MD患者中，最初以M2型細(xì)胞為主，起到炎癥修復(fù)的作用，隨著病情進(jìn)展，促炎因子增多使得M1型細(xì)胞增多，炎癥反應(yīng)擴(kuò)大[7]。

Toll樣受體-4(TLR-4)是Toll樣受體家族中的一員，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它可以激活下游MyD88和TRIF兩個(gè)不同的信號(hào)通路[8]。其中，MyD88可以增加核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的表達(dá)[9]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)和新生血管形成[5]?？寡軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)治療是目前臨床實(shí)踐中治療AMD的主要方法，但部分患者療效不佳[10]。因此，更好地了解AMD的早期發(fā)病機(jī)制是找到新的治療方法的必要條件。本研究的目的是探討ox-LDL誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜形態(tài)和功能損傷是否和TLR-4/MyD88通路激活以及小膠質(zhì)細(xì)胞極化相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑掃頻源光學(xué)相干斷層掃描儀(視微影像科技有限公司，河南)，視覺(jué)電生理儀(艾爾曦醫(yī)療設(shè)備有限公司，重慶)，雙光子激光共聚焦顯微鏡(蔡司公司，德國(guó))。人源ox-LDL(奕源生物技術(shù)公司，廣州)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara 生物技術(shù)有限公司，北京)，TUNEL檢測(cè)試劑盒、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(碧云天生物技術(shù)有限公司)，β-actin (CST 公司，美國(guó))，離子鈣結(jié)合適配器分子1(Iba-1)抗體(Abcam公司，美國(guó))，TLR-4抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，二抗(MILLIPORE 公司，美國(guó))，iNOS抗體、CD206抗體(賽維爾生物科技有限公司，武漢)，MyD88抗體、熒光二抗(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))，BCA蛋白試劑盒(Beyotime，上海)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組8周齡雄性C57BL/6小鼠(杰克森實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))40只，體重(19±1) g，維持12 h/12 h 的光-暗循環(huán)，并提供充足的食物和水。實(shí)驗(yàn)中盡量減少動(dòng)物的不安和不適。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，每組各20只，均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序都按照ARVO關(guān)于在眼科和視覺(jué)研究中使用動(dòng)物的聲明進(jìn)行。

1.2.2 視網(wǎng)膜下注射實(shí)驗(yàn)組小鼠右眼視網(wǎng)膜下注射1 μL ox-LDL，對(duì)照組小鼠右眼視網(wǎng)膜下注射1 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)。ox-LDL濃度根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置為100 mg·L-1[7]。小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)1.25%三溴乙醇麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。使用30號(hào)胰島素針的針頭在鞏膜的鋸齒緣下方穿刺造孔，將32號(hào)漢密爾頓注射器插入孔內(nèi)，注意避免損傷晶狀體，在解剖顯微鏡下將1 μL ox-LDL或PBS注射到視網(wǎng)膜下間隙，以注射區(qū)域看到視網(wǎng)膜下水泡樣脫離表明注射成功。所有動(dòng)物均使用左氧氟沙星眼膏涂眼預(yù)防感染，注射后每日觀(guān)察。

1.2.3 OCT檢測(cè)視網(wǎng)膜下注射 2周后，兩組各隨機(jī)取10只小鼠，同1.2.2方法麻醉、散瞳后行OCT檢查，記錄視神經(jīng)外1個(gè)視盤(pán)直徑距離的視網(wǎng)膜外核層(ONL)和內(nèi)核層(INL)厚度。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，使用視網(wǎng)膜ONL與INL的比值作為評(píng)價(jià)光感受器損傷情況的指標(biāo)。

1.2.4 ERG檢測(cè)視網(wǎng)膜下注射2周后，兩組各隨機(jī)取10只小鼠適應(yīng)黑暗環(huán)境過(guò)夜。第2天，同1.2.2方法麻醉、散瞳后行ERG檢測(cè)，所有操作均在暗紅光下進(jìn)行。暗適應(yīng)刺激強(qiáng)度為從-3～1 log cd·s·m-2，明適應(yīng)刺激強(qiáng)度為0 log cd·s·m-2和1 log cd·s·m-2，記錄a波和b波的振幅。

1.2.5 小鼠視網(wǎng)膜qPCR檢測(cè)視網(wǎng)膜下注射 2周后，兩組各隨機(jī)取10只小鼠頸椎脫位法處死，取右眼，分離出視網(wǎng)膜并勻漿。用Trizol試劑從視網(wǎng)膜中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用 SYBR Green Master Mix 對(duì)得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 為內(nèi)參。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 2 min，之后95 ℃ 2 min 40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用 2-ΔΔCt對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。引物序列： Iba-1上游引物為5’-GATTTGCAGGGAGGAAAAGCT-3’，下游引物為5’-AACCCCAAGTTTCTCCAGCAT-3’；TLR-4上游引物為5’-GCCGTTGGTGTATCTTTG-3’， 下游引物為5’-GCTGTTTGCTCAGGATTC-3’；MyD88：上游引物為5’-AACAGAAGCGACTGATTCC-3’，下游引物為5’-TCATTGAACACGGGTTGAG-3’；CD206 上游引物為5’-CTCTGTTCAGCTATTGGACGC-3’，下游引物為5’-CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC-3’；iNOS 上游引物為5’-CAAGCACCTTGGAAGAGGAG-3’，下游引物為5’-AAGGCCAAACACAGCATACC-3’；β-actin：上游引物為5’-ATCACTGCCACCCAGAAG-3’，下游引物為5’-TCCACGACGGACACATTG-3’。

1.2.6 小鼠視網(wǎng)膜Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜下注射 2周后，兩組各隨機(jī)取4只小鼠頸椎脫位法處死，取右眼，分離出視網(wǎng)膜并勻漿，用含有10 g·L-1蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，收集上清。BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。樣品用5×SDS上樣緩沖液稀釋?zhuān)?00 ℃煮沸5 min。等量的總蛋白在135 g·L-1的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉膜1.5 h，4 ℃下分別與Iba-1(1200)、TLR-4(1400)、MyD88(1100)一抗孵育過(guò)夜，二抗(110 000)在室溫下輕輕搖動(dòng)PVDF膜2 h。ECL試劑盒顯影曝光，使用ImageJ軟件分析，以β-actin為參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 小鼠視網(wǎng)膜免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜下注射2周后，兩組各取剩余的6只小鼠頸椎脫位法處死，摘出右眼，室溫下用40 g·L-1多聚甲醛固定 4 h，然后用不同濃度的蔗糖溶液在4 ℃下脫水。在冰凍切片機(jī)上通過(guò)角膜-視神經(jīng)軸線(xiàn)切厚6 μm的連續(xù)切片。阻斷液為以PBS為溶劑的50 g·L-1牛血清白蛋白和體積分?jǐn)?shù)0.3%的Triton X-100。洗滌液以體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween 20溶解在PBS中制備。將載玻片放置在暗盒中，室溫下加入阻斷液1 h。一抗Iba-1(1200)、iNOS(1200)、CD206(1200)4 ℃下過(guò)夜，室溫下加入熒光結(jié)合的二抗(15000)1 h。

1.2.8 小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色檢測(cè)TUNEL染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取1.2.7切片，在室溫下用4,6-二氨基-2-苯基吲哚對(duì)細(xì)胞核染色。在相同的曝光和增益條件下獲得圖片，用ImageJ軟件分析。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC,Manassas,VA,美國(guó))。使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機(jī)分為ox-LDL組(培養(yǎng)基中加入100 mg·L-1ox-LDL處理24 h)和PBS組(培養(yǎng)基中加入等體積的PBS處理24 h)。

1.3.2 ARPE-19細(xì)胞的qPCR檢測(cè)ox-LDL組和PBS組ARPE-19細(xì)胞分組處理24 h后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心，收集細(xì)胞后，行RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增，方法同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。引物序列：TLR-4上游引物為5’-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3’，下游引物為5’-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3’；MyD88上游引物為5’-CTAAGAAGGACCAGCAGAG-3’，下游引物為5’-GAAGCATCAGTAGGCATCA-3’；β-actin上游引物為5’-TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC-3’，下游引物為5’-CTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 ARPE-19細(xì)胞的Western blot檢測(cè)細(xì)胞分組處理24 h后，PBS洗滌2次，用含有1 g·L-1蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解30 min，余方法同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其中一抗為T(mén)LR-4(1400)、MyD88(1100)。使用ImageJ軟件分析，β-actin為參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 ARPE-19細(xì)胞的TUNEL染色ARPE-19細(xì)胞分組處理24 h后， PBS清洗，于40 g·L-1多聚甲醛中固定30 min。再次PBS清洗后，在黑暗條件下用含有體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100的冷PBS孵育細(xì)胞2 min。TUNEL反應(yīng)緩沖液在37 ℃加濕室中避光孵育細(xì)胞1 h，PBS洗3次。熒光顯微鏡下拍照，ImageJ軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ERG數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析和Bonferroni校正，其余結(jié)果用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL提高小鼠視網(wǎng)膜中TLR-4和MyD88表達(dá)小鼠視網(wǎng)膜下注射2周后，qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示， 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(均為P<0.01)(圖1)。

圖1 qPCR和Western blot檢測(cè)兩組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表達(dá) A：qPCR檢測(cè)結(jié)果(**P<0.01，***P<0.001)；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果。

2.2 ox-LDL激活小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞小鼠視網(wǎng)膜下注射2周后，qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.05)。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖2)。

圖2 qPCR、Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)兩組小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1的mRNA和蛋白表達(dá) A：免疫熒光染色結(jié)果；B：qPCR檢測(cè)結(jié)果(**P<0.01)；C：Western blot檢測(cè)結(jié)果。

2.3 ox-LDL誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化視網(wǎng)膜下注射2周后，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜中M1表型標(biāo)志物iNOS的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.001)，而M2表型標(biāo)志物CD206的mRNA表達(dá)水平變化不明顯(P>0.05)。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組iNOS陽(yáng)性細(xì)胞增加，而CD206陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(圖3)。

圖3 qPCR和免疫熒光染色檢測(cè)兩組小鼠視網(wǎng)膜中iNOS 和CD206的mRNA和蛋白表達(dá) A：免疫熒光染色結(jié)果；B：免疫熒光染色結(jié)果的平均光密度分析(***P<0.001)；C：qPCR檢測(cè)結(jié)果(***P<0.001)。

2.4 ox-LDL損傷小鼠視功能ERG檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜的a波和b波振幅均明顯下降(均為P<0.001)(圖4)。

圖4 ERG檢測(cè)兩組小鼠視網(wǎng)膜功能 A：ERG結(jié)果；B：暗適應(yīng)a波振幅統(tǒng)計(jì)結(jié)果(***P< 0.001)；C：明適應(yīng)b波振幅統(tǒng)計(jì)結(jié)果(***P< 0.001)；D：暗適應(yīng)b波振幅統(tǒng)計(jì)結(jié)果(***P<0.001)。

2.5 ox-LDL損傷小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)OCT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(4.0±0.2)相比，實(shí)驗(yàn)組(3.0±0.1)小鼠視網(wǎng)膜的ONL/INL比值下降(P<0.01)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，且細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在ONL(圖5)。

圖5 兩組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài) A：OCT檢測(cè)；B：TUNEL染色結(jié)果。

2.6 ox-LDL提高ARPE-19細(xì)胞TLR-4和MyD88表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS組相比，ox-LDL組ARPE-19細(xì)胞TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(均為P<0.01)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與PBS組相比，ox-LDL組ARPE-19細(xì)胞的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖6)。

圖6 兩組ARPE-19細(xì)胞凋亡及TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)情況 A：qPCR檢測(cè)結(jié)果(**P< 0.01，***P<0.001)；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果；C：TUNEL染色結(jié)果；D：TUNEL染色結(jié)果分析(***P<0.001)。

3 討論

ox-LDL引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與AMD的炎癥和發(fā)病機(jī)制有關(guān)[12-13]。本研究參考文獻(xiàn)[5]的報(bào)道，使用ox-LDL處理ARPE-19細(xì)胞和小鼠，以模擬AMD的病理過(guò)程，分析其中可能的機(jī)制，結(jié)果顯示，ox-LDL可活化小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)其向促進(jìn)炎癥發(fā)生的M1型極化，并引起光感受器細(xì)胞凋亡和視功能障礙；ox-LDL導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷可能與TLR4/MyD88通路的激活有關(guān)。

在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以通過(guò)激活P2X7R/NLRP3/caspase-1通路上調(diào)炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的表達(dá)，并增加NF-κB的表達(dá)，說(shuō)明ox-LDL可以引起視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)中，我們用ox-LDL處理ARPE-19細(xì)胞和C56BL/6小鼠進(jìn)一步證明了NF-κB的激活可能與上游TLR-4/MyD88通路相關(guān)，推測(cè)該通路可能參與了AMD的發(fā)病。

炎癥反應(yīng)是AMD的重要發(fā)病因素，而小膠質(zhì)細(xì)胞在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12,14]。在正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中的常駐免疫細(xì)胞位于叢狀層，而在炎癥狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并遷移至損傷部位。在急性炎癥期，小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的神經(jīng)炎癥可以促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)和再生過(guò)程，并促進(jìn)組織穩(wěn)態(tài)的快速恢復(fù)。炎癥持續(xù)的情況下，如視網(wǎng)膜退行性疾病，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被病理性激活并釋放大量的炎癥介質(zhì)，造成組織損傷和疾病惡化[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜遺傳性疾病、感染以及創(chuàng)傷時(shí)會(huì)引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的退化，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與視網(wǎng)膜炎癥和退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。我們?cè)谛∈笠暰W(wǎng)膜中檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)，在視網(wǎng)膜下注射ox-LDL后，Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量增加。

同外周循環(huán)的單核細(xì)胞相似，小膠質(zhì)細(xì)胞在活化后發(fā)生極化反應(yīng)，其極化后主要分為M1和M2兩種亞型，M1型主要起到促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用，M2型主要與抑制炎癥和修復(fù)有關(guān)。一些促炎細(xì)胞因子，如IL-1β，可以激活并極化小膠質(zhì)細(xì)胞為M1型[7]。既往研究表明，AMD小鼠模型和細(xì)胞模型中IL-1β的表達(dá)增加[5]。我們檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞的極化情況，結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜下注射ox-LDL 2周后，小鼠視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并極化為M1型，我們推測(cè)活化的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞是ox-LDL引起炎癥反應(yīng)的重要一環(huán)，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14,16]。

ERG檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)論是在暗適應(yīng)還是明適應(yīng)情況下，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜的a波和b波振幅均顯著下降。a波反映光感受器細(xì)胞的功能，b波反映雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的功能。OCT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜ONL/INL比值顯著下降。此外，TUNEL染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜中細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在ONL。結(jié)合ERG的結(jié)果， 我們推測(cè)ox-LDL主要損傷視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層。

RPE層是光感受器和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管之間的代謝屏障，在維持視網(wǎng)膜功能中起著關(guān)鍵作用。另外，RPE細(xì)胞也會(huì)向視網(wǎng)膜下間隙中分泌數(shù)種抑制性細(xì)胞因子，維持視網(wǎng)膜免疫抑制狀態(tài)[17]。RPE細(xì)胞損傷被認(rèn)為是AMD的觸發(fā)因素之一[18]。我們之前的研究表明，ox-LDL導(dǎo)致人RPE細(xì)胞中促炎因子和活性氧的增加[5]。因此，我們推測(cè)ox-LDL可能通過(guò)激活上游TLR-4/MyD88通路，進(jìn)而激活NF-κB引發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。NF-κB上調(diào)pro-IL-1β和NLRP3的轉(zhuǎn)錄，之后將NLRP3、pro-caspase-1和caspase招募域(ASC)組裝為多蛋白復(fù)合物。P2X7R激活引起的K+外排能夠激活這種多蛋白復(fù)合物，將pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為caspase-1。在caspase-1激活后，pro-IL-1β被裂解為IL-1β并分泌到細(xì)胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19-20]。RPE層的損傷和IL-1β等炎癥因子的增加可能是使小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并極化為M1型的重要原因。而M1型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)多種炎癥因子釋放，如IL-1β和腫瘤壞死因子-α，加重炎癥反應(yīng)[7]。此外，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)iNOS，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量一氧化氮，從而導(dǎo)致代謝性缺氧和活性氧的釋放[21]。這些結(jié)果也與本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致[5]。

本研究提供了ox-LDL可能激活視網(wǎng)膜中TLR4通路和活化小膠質(zhì)細(xì)胞的證據(jù)，但仍存在懸而未決的問(wèn)題。TLR-4是脂多糖的結(jié)合靶點(diǎn)，雖然有報(bào)道ox-LDL受體LOX-1與TLR-4的激活呈正相關(guān)[22]，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL引起的視網(wǎng)膜功能和形態(tài)的損傷可能與激活TLR-4/MyD88通路，并導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化和極化為M1表型有關(guān)。本研究加深了對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的了解，為深入認(rèn)識(shí)AMD的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。