萬(wàn)光明 余 川

視網(wǎng)膜退行性疾病以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞進(jìn)行性減少為特征，目前尚不可治愈，如老年性黃斑變性(AMD)、視網(wǎng)膜色素變性(RP)和Stargardt病等[1]。臨床上視網(wǎng)膜退行性疾病的治療多以抗炎和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等方法為主，目的是阻止或減緩疾病進(jìn)展，保存剩余視力[2]，但作用有限，不能有效恢復(fù)受損視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能。視網(wǎng)膜退行性疾病存在相關(guān)致病基因或易感基因，且基因療法已被證實(shí)可改善遺傳性視網(wǎng)膜疾病患者的視覺(jué)功能，但這種治療對(duì)晚期患者效果較差[3-4]。近年來(lái)，視網(wǎng)膜疾病再生治療被廣泛研究。細(xì)胞替代治療已成為視網(wǎng)膜退行性疾病的一種潛在治療方法[1-2,5-6]。目前，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的療法替代丟失的視網(wǎng)膜細(xì)胞已成為一個(gè)快速發(fā)展的轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域。通過(guò)細(xì)胞移植將具有特定功能的細(xì)胞整合于受損視網(wǎng)膜，可改善視網(wǎng)膜微環(huán)境以及替代和修復(fù)丟失或受損的細(xì)胞，從而恢復(fù)組織喪失的功能。移植治療所采用的細(xì)胞通常包括自體或異體細(xì)胞、干細(xì)胞以及干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞或成熟細(xì)胞。視網(wǎng)膜退行性疾病中細(xì)胞替代治療的作用越來(lái)越受到重視。不同類型的移植細(xì)胞有不同優(yōu)缺點(diǎn)，本文從不同來(lái)源移植細(xì)胞的角度闡述視網(wǎng)膜退行性疾病的替代治療現(xiàn)狀，并對(duì)未來(lái)細(xì)胞替代治療的前景進(jìn)行展望。

1 干細(xì)胞

1.1 胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(ESC)常見(jiàn)于發(fā)育胚胎中，可定向分化，形成機(jī)體各種組織。體外獲得高質(zhì)量的人ESC(hESC)取決于胚胎質(zhì)量、分離程序和培養(yǎng)條件，目前已經(jīng)成功建立了臨床級(jí)hESC細(xì)胞系。但hESC只能從人類胚胎中獲得，存在倫理問(wèn)題。異種或同種異體間的免疫排斥反應(yīng)也阻礙著ESC療法的應(yīng)用，通常在移植后聯(lián)合免疫抑制治療。通過(guò)基因修飾的ESC可降低免疫排斥反應(yīng)，減弱固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的殺傷作用，例如，修飾編碼和控制MHC I類和II類分子表達(dá)的相關(guān)基因，但在移植治療時(shí)，由于缺乏誘導(dǎo)器官生成的信號(hào)，ESC在體內(nèi)形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)較大，尚無(wú)有效方法解決致瘤性問(wèn)題[7]。目前，使用ESC治療視網(wǎng)膜退行性疾病的研究多以ESC來(lái)源的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞或成熟細(xì)胞為主。由于細(xì)胞替代治療的關(guān)鍵在于移植細(xì)胞的可用性，因此，成功將ESC分化為特定細(xì)胞表型后，需在體內(nèi)外對(duì)所分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行鑒定。

1.2 成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞是機(jī)體組織特有的干細(xì)胞，具有自我更新、增殖和細(xì)胞譜系分化的潛能，并長(zhǎng)期駐留于特定的生態(tài)位中，主要存在于骨髓、脂肪、臍帶、視網(wǎng)膜和神經(jīng)等組織中，可分化為功能成熟的組織細(xì)胞，但其定向分化為靶向移植細(xì)胞能力有限[8-10]。

1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有免疫原性低，不受倫理限制等特點(diǎn)，因MSC分化為特定靶細(xì)胞的能力有限，其移植治療主要通過(guò)免疫調(diào)節(jié)并提供營(yíng)養(yǎng)支持來(lái)修復(fù)受損組織，延緩視網(wǎng)膜退行性病變進(jìn)展。目前，MSC移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的臨床研究已有報(bào)道。骨髓MSC注射于RP患者玻璃體內(nèi)，可改善視功能，但會(huì)導(dǎo)致纖維性增殖膜、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、虹膜新生血管等并發(fā)癥[11-12]。玻璃體內(nèi)注射的MSC難以遷移并整合到視網(wǎng)膜病變區(qū)，無(wú)法發(fā)揮更有效的治療效果。而視網(wǎng)膜下腔注射可解決此問(wèn)題，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致新的并發(fā)癥。將脂肪MSC移植于11例晚期RP患者視網(wǎng)膜下腔后，隨訪發(fā)現(xiàn)，僅有4例患者視力改善，并出現(xiàn)5例視網(wǎng)膜前膜和1例脈絡(luò)膜新生血管[13]。人臍帶組織來(lái)源的MSC能夠持續(xù)穩(wěn)定擴(kuò)增，無(wú)核型變化，可挽救大鼠光感受器功能，有效減緩視網(wǎng)膜退行性疾病進(jìn)展[14]。臨床中，給予晚期RP患者靜脈輸注臍帶MSC可維持或部分改善患者視功能，隨訪過(guò)程中沒(méi)有明顯不良反應(yīng)發(fā)生[15]。

MSC玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜下腔移植存在增殖、視網(wǎng)膜脫離、新生血管形成等嚴(yán)重并發(fā)癥，并存在存活率低的特點(diǎn)，單純MSC移植治療的臨床應(yīng)用受到限制。截至目前，國(guó)內(nèi)獲批的26項(xiàng)干細(xì)胞藥物臨床試驗(yàn)中，有19項(xiàng)為MSC注射液，適應(yīng)證中均不包括視網(wǎng)膜退行性疾病。靜脈輸注合適劑量MSC可能成為一種安全的細(xì)胞治療途徑，但此種方法的效果因機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的免疫殺傷作用而明顯降低，無(wú)法進(jìn)行有效的細(xì)胞替代治療。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MSC培養(yǎng)基中加入硫酸葡聚糖可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和活性細(xì)胞因子的分子自組裝，制備出一種濃縮MSC分泌促血管生成因子的干細(xì)胞膠原納米顆粒，并成功應(yīng)用于傷口的血管再生[16]。這為視網(wǎng)膜退行性疾病的MSC移植治療提供了新的研究方向。通過(guò)與材料相關(guān)學(xué)科結(jié)合，不僅充分利用MSC外分泌因子或外泌體的功能，還可減少移植治療的并發(fā)癥，進(jìn)一步提高干細(xì)胞精準(zhǔn)化治療效果。

1.2.2 視網(wǎng)膜干/祖細(xì)胞視網(wǎng)膜干/祖細(xì)胞(RSC/RPC)是視網(wǎng)膜組織特有的成體干細(xì)胞，可分化形成視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。不同物種RSC的再生能力和機(jī)制存在差異，以往認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜缺乏再生能力，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，成人睫狀上皮的纖毛邊緣存在RSC以及視杯細(xì)胞內(nèi)層存在RPC，但增殖能力均有限[17-18]。外源性因素可在體外激活具有干細(xì)胞特性的RSC/RPC，這些細(xì)胞存在于成人眼組織內(nèi)，包括睫狀緣細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞、虹膜色素上皮(IPE)細(xì)胞，Müller細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞等[19]。在體內(nèi)，成年小鼠Müller細(xì)胞能夠被激活至RPC狀態(tài)，并刺激功能性神經(jīng)元再生[20-21]。干細(xì)胞的再生能力需要自身與其生態(tài)位之間高度協(xié)調(diào)活動(dòng)的參與[22]。對(duì)RSC/RPC特定分化所需微環(huán)境的研究，并明確調(diào)節(jié)RSC/RPC向臨床所需的細(xì)胞或組織類型進(jìn)行定向分化的信號(hào)通路是其替代治療成功與否的關(guān)鍵。

RSC/RPC替代治療視網(wǎng)膜退行性疾病已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期臨床試驗(yàn)中取得一定效果[20-21,23]，但其安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，移植后RPC分化能力往往有限，其整合和分化取決于宿主組織微環(huán)境，如免疫反應(yīng)、視網(wǎng)膜分泌的抑制因子等[19]。因此，不斷加深對(duì)RSC/RPC生態(tài)位和組織病變區(qū)微環(huán)境的認(rèn)識(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)外信號(hào)途徑，解除抑制因素，將有助于視網(wǎng)膜細(xì)胞的再生性研究。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)來(lái)源于神經(jīng)組織，常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，而視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。NSC移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病過(guò)程中，神經(jīng)視網(wǎng)膜功能的改善是細(xì)胞替代作用，還是對(duì)存活細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持，目前尚不清楚。流產(chǎn)胎兒中樞的NSC移植到大鼠視網(wǎng)膜下腔，可維持光感受器與二級(jí)神經(jīng)元間特殊的突觸連接以及吞噬光感受器外節(jié)的能力，能夠保護(hù)光感受器細(xì)胞，促進(jìn)視網(wǎng)膜退行性疾病的修復(fù)[24]，但NSC整合到視網(wǎng)膜外核層后并未分化為成熟的光感受器細(xì)胞[25]。這說(shuō)明視網(wǎng)膜下腔移植的NSC可能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)支持保護(hù)而非替代受損的光感受器細(xì)胞。

1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)是從重編程的體細(xì)胞中獲得，具有與ESC類似的細(xì)胞分化潛能，兩者常經(jīng)誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞前體細(xì)胞或成熟細(xì)胞，進(jìn)行視網(wǎng)膜退行性疾病的替代治療研究。相較于hESC，iPSC的來(lái)源更加廣泛，避免了種屬或異體間的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)解決了因使用人類胚胎組織帶來(lái)的倫理學(xué)問(wèn)題。iPSC用于細(xì)胞治療的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是移植細(xì)胞可以來(lái)源于自體細(xì)胞，但iPSC存在表觀遺傳學(xué)異常、基因組不穩(wěn)定等情況[26-27]。因患者體細(xì)胞可能攜帶致病基因，與自體iPSC相比，細(xì)胞治療中利用健康體細(xì)胞去分化獲得的同種異體iPSC將更為安全[28]。2022年4月國(guó)內(nèi)首個(gè)iPSC來(lái)源的干細(xì)胞藥物——異體內(nèi)皮祖細(xì)胞注射液(ALF201)——獲得臨床試驗(yàn)?zāi)驹S可(CXSL2200090)，其適應(yīng)證為大動(dòng)脈粥樣硬化型急性缺血性卒中。iPSC生產(chǎn)過(guò)程是費(fèi)時(shí)、昂貴的，這增加了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的負(fù)擔(dān)。因此，在確保安全有效地獲得iPSC基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一套更快、更經(jīng)濟(jì)的重編程系統(tǒng)是必要而迫切的。

2 RPE細(xì)胞

由于RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜退行性疾病中受累較早，而且對(duì)光感受器細(xì)胞有保護(hù)和支持作用，RPE細(xì)胞移植已成為目前治療視網(wǎng)膜退行性疾病的重要臨床方法之一，目的是替代支持光感受器的RPE細(xì)胞并為周圍組織提供營(yíng)養(yǎng)和支持作用。移植的RPE細(xì)胞主要來(lái)源于自體、異體和不同類型干細(xì)胞。

2.1 自體或異體來(lái)源的RPE細(xì)胞自體RPE細(xì)胞免疫原性低，移植治療時(shí)，常進(jìn)行RPE和脈絡(luò)膜聯(lián)合移植。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，單純自體RPE細(xì)胞移植可顯著減少因RPE細(xì)胞丟失引起的兔光感受器變性和脈絡(luò)膜血管萎縮[29]。自體RPE細(xì)胞和部分脈絡(luò)膜聯(lián)合移植治療光感受器退行性病變的模型兔，其退化的光感受器細(xì)胞的存活時(shí)間延長(zhǎng)，并且外節(jié)再生出現(xiàn)的更早[30]。最新的研究證實(shí)，RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜聯(lián)合移植可快速重建移植區(qū)血管組織，進(jìn)而維持RPE細(xì)胞的正常生理功能和光感受器細(xì)胞的功能狀態(tài)[31]。這為自體RPE細(xì)胞臨床替代治療提供了研究基礎(chǔ)。臨床試驗(yàn)中，通過(guò)自體RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜聯(lián)合移植治療濕性和干性AMD患者，可觀察到補(bǔ)片貼附良好，且出現(xiàn)血管化(圖1和圖2)，患者視力較術(shù)前改善，但也出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜脫離、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變和新生血管復(fù)發(fā)等并發(fā)癥[32-33]。自體RPE細(xì)胞取材較為困難，對(duì)手術(shù)者要求較高，且易出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，使其研究和應(yīng)用受限。

圖1 AMD患者自體RPE-脈絡(luò)膜補(bǔ)片移植術(shù)后的眼底彩色照像 白色細(xì)箭頭：補(bǔ)片；白色粗箭頭：補(bǔ)片采集部位。圖片來(lái)源：Parolini等,Retina,2020。

圖2 AMD患者自體RPE-脈絡(luò)膜補(bǔ)片移植術(shù)后2年的熒光素眼底血管造影(FFA)和吲哚菁綠血管造影(ICGA) 白色細(xì)箭頭：補(bǔ)片；白色粗箭頭：補(bǔ)片采集部位；三角形箭頭：纖維性瘢痕。圖片來(lái)源：Parolini等,Retina,2020。

異體RPE細(xì)胞，包括成人RPE細(xì)胞和胎兒RPE細(xì)胞，其中成人型細(xì)胞移植后易出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，胎兒型細(xì)胞因視網(wǎng)膜發(fā)育程度低，免疫原性相應(yīng)減弱，可在體外大量擴(kuò)增，但存在倫理學(xué)問(wèn)題。AMD患者進(jìn)行同種異體成人或胎兒RPE細(xì)胞移植后，視力在隨訪期間并未得到有效改善[34-35]。與自體RPE細(xì)胞移植相比，同種異體RPE細(xì)胞常進(jìn)行單純細(xì)胞膜片或懸液移植，因治療效果欠佳、取材困難、排斥反應(yīng)和術(shù)后并發(fā)癥的存在，相關(guān)報(bào)道較少。

2.2 ESC來(lái)源的RPE細(xì)胞ESC經(jīng)誘導(dǎo)分化形成的RPE細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)和功能上具有RPE細(xì)胞的典型特征。通過(guò)對(duì)ESC來(lái)源的RPE(ESC-RPE)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，該類RPE細(xì)胞可穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，不發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并形成成熟的RPE細(xì)胞群[36]。ESC-RPE細(xì)胞的體外成熟度對(duì)維持其關(guān)鍵功能基因的高水平表達(dá)具有重要作用[37]，且有成熟晚期的RPE細(xì)胞群對(duì)氧化應(yīng)激有更好的耐受性[38]。

hESC-RPE細(xì)胞懸液移植治療Stargardt病時(shí)，移植部位色素沉積于RPE層，范圍逐漸擴(kuò)大(圖3)，患者視力較治療前提高，隨訪期間未發(fā)現(xiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)、致瘤性等并發(fā)癥[39]。同樣，經(jīng)該類細(xì)胞懸液移植治療AMD的長(zhǎng)期安全性和耐受性評(píng)估試驗(yàn)也得到相似結(jié)果[40]。除進(jìn)行細(xì)胞懸液移植治療外，hESC-RPE細(xì)胞單層膜片植入嚴(yán)重濕性AMD患者視網(wǎng)膜下腔后，可在體內(nèi)正常存活，其周圍色素沉積呈離心性擴(kuò)大，移植24周后趨于穩(wěn)定(圖4)，植入超過(guò)1年的患者視力均獲得改善[41]。極化RPE細(xì)胞膜片能夠更好地拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[42]。將由ESC來(lái)源的視網(wǎng)膜類器官和極化RPE細(xì)胞膜片使用生物黏合劑制成的視網(wǎng)膜補(bǔ)片共移植于免疫缺陷視網(wǎng)膜退化晚期大鼠體內(nèi)后，可觀察到移植補(bǔ)片生長(zhǎng)，新光感受器細(xì)胞和神經(jīng)元形成以及宿主視網(wǎng)膜細(xì)胞整合，使得受損的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)重建[43]。目前，臨床中ESC-RPE細(xì)胞聯(lián)合移植相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)于ESC-RPE細(xì)胞單純或聯(lián)合移植，需提高細(xì)胞純度，控制分化程度，分析致瘤特性，并明確生物分布和移植細(xì)胞與宿主間的相互作用等，進(jìn)行臨床前安全性和有效性研究也必不可少。ESC-RPE細(xì)胞屬于同種異體移植，在替代治療中還需考慮免疫原性以及全身或局部免疫抑制劑的使用情況。因免疫抑制劑存在副作用，如何降低移植細(xì)胞的免疫原性是亟需解決的問(wèn)題。通過(guò)將生物材料與細(xì)胞替代治療相結(jié)合，多層納米涂層自組裝技術(shù)制備ESC-RPE細(xì)胞移植物的免疫原性顯著降低，移植治療中未使用免疫抑制劑，仍可保持移植細(xì)胞的生存活力[44]。這體現(xiàn)了醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究與材料科學(xué)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，為解決細(xì)胞替代治療的潛在問(wèn)題提供了有效方法。

圖3 Stargardt病患者h(yuǎn)ESC-RPE細(xì)胞懸液移植前后的眼底彩色照像和光學(xué)相干斷層掃描(OCT) 箭頭：色素沉著增加，且位于RPE層。圖片來(lái)源：Schwartz等,Lancet,2012。

圖4 濕性AMD患者1和患者2中hESC-RPE細(xì)胞膜片移植后的眼底彩色照像 綠色虛線：移植片的原始邊界。圖片來(lái)源：da Cruz等,Nat Biotechnol,2018。

2.3 iPSC來(lái)源的RPE細(xì)胞iPSC來(lái)源的RPE(iPSC-RPE)細(xì)胞表現(xiàn)出正常RPE細(xì)胞的特性和功能，可表達(dá)RPE相關(guān)標(biāo)記蛋白并發(fā)揮吞噬活性，能夠?yàn)楣飧惺芷骷?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持和短暫的拯救作用[45]。但iPSC-RPE細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感[46]。這提示iPSC-RPE細(xì)胞懸液移植到體內(nèi)有存活率低的可能。自體iPSC-RPE細(xì)胞膜片首次應(yīng)用于濕性AMD患者，術(shù)后1年，可在患者中觀察到完整移植片和黃斑囊樣水腫[47]，移植4年后，移植片仍然存活，色素沉積范圍稍增加，周圍的外核層和鄰近的脈絡(luò)膜血管持續(xù)存在，視力沒(méi)有明顯變化[48](圖5)。這說(shuō)明自體iPSC-RPE細(xì)胞移植片可能有支持光感受器和脈絡(luò)膜血管以及延緩病情進(jìn)展的作用。

圖5 濕性AMD患者iPSC-RPE細(xì)胞膜片移植前后的眼底彩色照像、OCT和FFA 眼底彩色照像中，黑色星號(hào)和白色三角形箭頭：纖維性新生血管膜及其邊界；白色星號(hào)：新生血管膜切除術(shù)后下方脈絡(luò)膜血管；黃色細(xì)箭頭：視網(wǎng)膜出血處；白色細(xì)箭頭：移植片；紅線內(nèi)區(qū)域：主要移植片；綠線內(nèi)區(qū)域：移植物碎片。OCT圖片中，黃色虛線內(nèi)區(qū)域：黃斑區(qū)呈高反射性的新生血管膜；白色星號(hào)：光感受器細(xì)胞層；黃色細(xì)箭頭：移植片中RPE樣細(xì)胞系延伸至光感受器細(xì)胞層和脈絡(luò)膜間隙；橙色三角箭頭(術(shù)后1年OCT圖)：黃斑囊狀水腫；黃線：移植片；黃色三角箭頭：外核層與移植片連接處；橙色粗箭頭：主干血管；橙色三角箭頭(術(shù)后4年OCT圖)：網(wǎng)狀血管。FFA圖中，白色星號(hào)：移植區(qū)持續(xù)存在的脈絡(luò)膜血管。圖片來(lái)源：Mandai等,N Engl J Med,2017； Takagi等,Ophthalmol Retina,2019。

由于iPSC-RPE細(xì)胞存在攜帶致病基因、突變等風(fēng)險(xiǎn)，使得相關(guān)臨床試驗(yàn)受到諸多限制。通過(guò)從AMD患者中獲得無(wú)癌性突變的臨床級(jí)iPSC，經(jīng)再分化制備成臨床級(jí)iPSC-RPE細(xì)胞膜片，移植于大鼠和豬激光誘導(dǎo)的RPE損傷模型后，有效改善了細(xì)胞膜片在移植區(qū)的整合和功能[49]。人iPSC-RPE和光感受器細(xì)胞聯(lián)合移植于RP模型大鼠的視網(wǎng)膜下腔，10個(gè)月后，未見(jiàn)異常的增殖細(xì)胞，移植后的細(xì)胞分別具有人RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞特征，對(duì)視力有明顯的維持作用[50]。此外，在涂有膠原蛋白的可降解生物膜兩側(cè)共培養(yǎng)iPSC-RPE細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)制備人造血-視網(wǎng)膜屏障模型，有效地維持了移植細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞間接觸[51]。上述細(xì)胞膜片移植、聯(lián)合移植和視網(wǎng)膜類器官移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了iPSC-RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜退行性疾病動(dòng)物模型中的安全性和有效性，為在患者體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞替代治療研究提供了可靠的依據(jù)，但仍需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)以有效提高iPSC-RPE細(xì)胞的臨床適用性。目前，iPSC-RPE細(xì)胞移植面臨的挑戰(zhàn)包括手術(shù)技術(shù)、病理性微環(huán)境、免疫排斥和免疫抑制等。隨著移植物的基因校正、生物材料仿生支架、視網(wǎng)膜組織工程等技術(shù)的不斷完善，有望解決iPSC-RPE細(xì)胞移植存在的問(wèn)題，使植入體內(nèi)的細(xì)胞能夠復(fù)制原生RPE細(xì)胞的功能，進(jìn)一步增強(qiáng)病變視網(wǎng)膜的再生能力。

2.4 MSC來(lái)源的RPE細(xì)胞MSC可進(jìn)行跨胚層分化，臍帶、脂肪和骨髓MSC在特定條件下進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化為RPE細(xì)胞，但僅具備部分功能，如相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)、吞噬和分泌功能等。共培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基和小分子物質(zhì)等在體外MSC來(lái)源的RPE(MSC-RPE)細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用[52-54]。體內(nèi)誘導(dǎo)條件下，不同移植途徑的MSC分化方向以及所形成RPE細(xì)胞的功能存在差異。大鼠視網(wǎng)膜下腔注射的骨髓MSC可表達(dá)泛細(xì)胞角蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和視紫紅質(zhì)，不僅能夠分化為RPE細(xì)胞，還具有向光感受器和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力[55]，但經(jīng)小鼠尾靜脈注射的骨髓MSC卻無(wú)法遷移至損傷視網(wǎng)膜，主要通過(guò)抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，減少炎癥反應(yīng)，發(fā)揮視網(wǎng)膜損傷修復(fù)作用[56]。目前，MSC存在體內(nèi)誘導(dǎo)率低，移植后存活率低等缺點(diǎn)。

此外，IPE細(xì)胞與RPE細(xì)胞起源于同一胚胎細(xì)胞系，結(jié)構(gòu)和功能上有諸多相似。人虹膜組織分離出的IPE細(xì)胞具有有限的視網(wǎng)膜干細(xì)胞特性[57]。自體IPE細(xì)胞移植于切除脈絡(luò)膜新生血管的濕性AMD患者視網(wǎng)膜下腔后，可作為RPE細(xì)胞的替代物，但功能較低，隨訪期間大部分患者視力穩(wěn)定，未見(jiàn)黃斑水腫或脈絡(luò)膜新生血管復(fù)發(fā)[58]。移植的替代細(xì)胞能否存活主要取決于宿主免疫排斥反應(yīng)的強(qiáng)弱和病變區(qū)微環(huán)境的適宜程度。因IPE細(xì)胞具有自體來(lái)源、取材相對(duì)容易等優(yōu)點(diǎn)，移植后很少發(fā)生排斥反應(yīng)，適合于臨床移植，但移植效率低。通過(guò)基因修飾提高細(xì)胞活性或傳遞靶向分子，可進(jìn)一步提高IPE細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的效率，但基因修飾、細(xì)胞體外培養(yǎng)和視網(wǎng)膜微環(huán)境等可能降低移植安全性。

3 光感受器細(xì)胞

不可逆性的光感受器細(xì)胞功能障礙或死亡常發(fā)生于視網(wǎng)膜退行性疾病晚期。多能干細(xì)胞(PSC)分化的光感受器細(xì)胞及其前體細(xì)胞的替代治療是目前重要的研究方向之一[59]。經(jīng)過(guò)鼠源性、人源性、干細(xì)胞源性以及體外二維培養(yǎng)和三維視網(wǎng)膜分化等的不斷探索和改良，已獲得具有纖毛結(jié)構(gòu)、成熟外節(jié)結(jié)構(gòu)和整合能力的光感受器細(xì)胞及其前體細(xì)胞，為光感受器退行性疾病的替代治療提供了細(xì)胞移植來(lái)源。

hESC來(lái)源的視錐細(xì)胞前體移植于晚期光感受器退化模型小鼠的視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)其與雙極細(xì)胞形成突觸連接，約1/3小鼠出現(xiàn)對(duì)光反應(yīng)敏感，但大部分小鼠出現(xiàn)異常光反應(yīng)，如光誘導(dǎo)抑制[60]，這表明，體內(nèi)移植的視錐細(xì)胞前體可進(jìn)行細(xì)胞整合，進(jìn)而修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜，但這種組織重塑效率低且不穩(wěn)定。對(duì)于iPSC來(lái)源的未成熟視桿細(xì)胞，進(jìn)行野生型或視網(wǎng)膜變性小鼠的視網(wǎng)膜下腔移植后，不僅出現(xiàn)視紫紅質(zhì)陽(yáng)性的外節(jié)樣結(jié)構(gòu)，還表現(xiàn)出與原生發(fā)育的視桿細(xì)胞相似的膜電流以及表達(dá)特異性光轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的能力[61]。除hESC/iPSC分化的光感受器前體細(xì)胞外，體外擴(kuò)增的RPE細(xì)胞也可分化為具有多種光感受器特性的神經(jīng)細(xì)胞，并表達(dá)光感受器標(biāo)記物[62]。正常情況下，MSC不能向光感受器細(xì)胞轉(zhuǎn)化。通過(guò)基因修飾，過(guò)表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的臍帶MSC，經(jīng)體外選擇性培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其向光感受器細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)[63]。然而，將MSC和RPE細(xì)胞聯(lián)合移植于小鼠視網(wǎng)膜下腔，在提高移植細(xì)胞存活率的基礎(chǔ)上，僅能發(fā)揮免疫抑制和促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的作用[64]，不能在體內(nèi)定向分化為具有替代光感受器的功能性細(xì)胞，但hESC來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞與RPE細(xì)胞體外共培養(yǎng)，可獲得具有光敏感受體特異性的細(xì)胞[65]，這提示在體移植細(xì)胞的分化可能受病變區(qū)微環(huán)境、細(xì)胞類型和移植方式等因素的影響。因此，直接進(jìn)行體外分化或分離的光感受器細(xì)胞及其前體細(xì)胞移植治療將更為有效。

人 PSC 來(lái)源的層狀結(jié)構(gòu)視網(wǎng)膜類器官和替代治療的相關(guān)研究已相繼開(kāi)展(圖6)。三維視網(wǎng)膜組織和生物可降解三維支架的應(yīng)用拓展了光感受器細(xì)胞替代治療的研究領(lǐng)域[66-67]。目前，移植性光感受器細(xì)胞的形態(tài)和功能存在諸多不足，其替代治療面臨著很多未解決的技術(shù)難題，相關(guān)研究仍處于臨床前研究階段。光感受器細(xì)胞移植效果受疾病類型、外界膜完整性、反應(yīng)性膠質(zhì)增生和免疫反應(yīng)影響，如何選取合適的細(xì)胞來(lái)源、分化狀態(tài)、植入時(shí)機(jī)和純化移植細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)化移植效果在當(dāng)前研究中備受關(guān)注。由于視網(wǎng)膜退行性疾病中，RPE細(xì)胞先發(fā)生病變，使其對(duì)光感受器細(xì)胞的支持和保護(hù)作用降低，單一光感受器細(xì)胞移植不能滿足病情改善或恢復(fù)的需要。聯(lián)合移植時(shí)，RPE細(xì)胞能夠維持光感受器的結(jié)構(gòu)和功能，使替代治療效果優(yōu)于單一細(xì)胞移植。對(duì)于特殊類型視網(wǎng)膜退行性疾病，如視網(wǎng)膜色素變性、視錐細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良等，相應(yīng)細(xì)胞呈特異性喪失，視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的個(gè)性化移植為此類退行性疾病提供了更為合適的治療方法。

4 小結(jié)和展望

對(duì)于視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞替代治療，安全、高效的移植細(xì)胞至關(guān)重要。移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的存活是移植成功的首要因素。理想的移植細(xì)胞需具有較高存活率、穩(wěn)定分化程度、特定移植方式以及與宿主視網(wǎng)膜高效地整合等特點(diǎn)。但因移植細(xì)胞存在倫理、免疫排斥、致瘤性、攜帶致病基因等不足和病變區(qū)微環(huán)境改變的特點(diǎn)，使得細(xì)胞替代治療效果受到很大程度上的限制。隨著誘導(dǎo)純化方法的完善和移植技術(shù)的不斷更新，部分移植細(xì)胞在治療視網(wǎng)膜退行性疾病方面成為現(xiàn)實(shí)，但其在臨床上的遠(yuǎn)期療效和安全性仍需進(jìn)一步評(píng)估。

不同來(lái)源移植細(xì)胞將成為未來(lái)細(xì)胞替代治療的研究焦點(diǎn)，重視其在視網(wǎng)膜退行性疾病中的替代治療作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，不斷優(yōu)化移植細(xì)胞的治療效果，建立視網(wǎng)膜退行性疾病替代治療細(xì)胞的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，可有效篩選出最佳的移植細(xì)胞類型。細(xì)胞替代治療效果的提高，不僅需要充分利用不同來(lái)源細(xì)胞各自的移植優(yōu)勢(shì)，還應(yīng)采取有效措施避免其制備及治療過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)因素，更重要的是重視移植細(xì)胞作用機(jī)制及其自身功能調(diào)控機(jī)制的研究。通過(guò)不同形式的干預(yù)措施，如重編程、基因修飾、三維培養(yǎng)和聯(lián)合生物材料等，促進(jìn)移植細(xì)胞體外分化，增強(qiáng)其在體的生物學(xué)功能，將有助于改善視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞替代治療效果。相信通過(guò)遺傳學(xué)、材料科學(xué)、生物技術(shù)和臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的密切合作，不同來(lái)源移植細(xì)胞或視網(wǎng)膜類器官的潛在問(wèn)題能夠得到解決，且在移植治療及其個(gè)性化移植和聯(lián)合移植方面取得顯著的進(jìn)展。通過(guò)不斷增強(qiáng)移植細(xì)胞的臨床適用性，基于不同來(lái)源移植細(xì)胞的替代治療將在視網(wǎng)膜退行性疾病中得到廣泛的應(yīng)用。