林君峰，王成云，白 爽，李成發(fā)，李麗霞，謝堂堂

（1.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳 518010；2.深圳海關(guān)工業(yè)品檢測技術(shù)中心，廣東深圳 518067）

在紡織工業(yè)中，為了提高紡織品的抗菌性能，常使用抗菌劑進(jìn)行抗菌整理。異噻唑啉酮是一類常用的抗菌整理劑，經(jīng)其整理后，紡織品的抗菌性能得到極大提升［1-6］。例如，絲綢經(jīng)異噻唑啉酮類抗菌劑整理后，抗菌性能得到極大改善。但是，部分異噻唑啉酮具有接觸致敏性，與皮膚接觸后會引發(fā)接觸性皮炎［7-16］；部分異噻唑啉酮具有細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，會損害人體和魚類的生殖系統(tǒng)［17-19］；職業(yè)性接觸異噻唑啉酮還可能導(dǎo)致中毒性肝病死亡［20］。因此各國紛紛立法限制其使用［21-23］，且限制使用的該類抗菌劑種類不斷增加。目前共有7 種異噻唑啉酮被列入管制目錄：2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、2-丁基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BBIT）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OI）、2-甲基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（MBIT）、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT）、4,5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOI）。紡織品、皮革、化妝品、涂料等樣品中的異噻唑啉酮類抗菌劑檢測已有大量文獻(xiàn)報道［24-34］，但測定對象均未完全涵蓋全部7 種限用異噻唑啉酮，建立的方法不能直接用于同時測定全部7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑。本實驗采用超聲萃取技術(shù)提取紡織品中的異噻唑啉酮，提取產(chǎn)物經(jīng)處理后進(jìn)行UPLC/MS-MS 分析，從而建立氣質(zhì)聯(lián)用分析方法，能同時測定7 種異噻唑啉酮類抗菌劑。采用該方法對256 個市售紡織品進(jìn)行測試，結(jié)果在6 個樣品中檢出OI，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為336～10 169 mg/kg。

1 實驗

1.1 材料與儀器

織物：1#梭織真絲連衣裙、2#針織真絲女式長袖套頭衫、3#純棉女式短袖襯衫、4#平紋機織染色女式棉上衣、5#梭織亞麻女式長袖襯衫、6#梭織亞麻男式襯衫（6個陽性樣品中均被檢出含有OI［6］，市售）。

試劑：4,5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOI，99.8%，日本東京化成株式會社），2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OI，99.9%）、1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT，99.2%）、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI，99.5%）（美國Sigma-Aldrich 公司），2-甲基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（MBIT，98.0%）、2-丁基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮（BBIT，95.0%）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI，99.0%）（德國Dr.Enrenstorfer GmbH公司），甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）。

儀器：QYB-3 自動制樣機（中山市啟元機械科技有限公司），AS3120 超聲波清洗器（美國Auto Science公司），RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），EVA50 氮吹儀（北京普力泰科儀器有限公司），0.45 μm 濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司），6495 Triple Quad UPLC/MS-MS 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用甲醇配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（各組分質(zhì)量濃度均為200 μg/L），用甲醇逐級稀釋至各組分質(zhì)量濃度為100.0、40.0、20.0、10.0、4.0、2.0、1.0、0.4、0.2 μg/L，得到系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

樣品前處理參照文獻(xiàn)［6，34］進(jìn)行：將待測樣品切割成5 mm×5 mm 的小塊，混勻，稱取約1 g 樣品放入35 mL 玻璃反應(yīng)瓶中，加入20 mL 甲醇，在45 ℃下超聲萃取20min，過濾，濾液收集到200 mL 雞心瓶中；殘渣用20 mL 甲醇再次進(jìn)行超聲萃取，合并萃取液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將萃取液于真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再轉(zhuǎn)移至氮吹儀中用干燥氮氣緩慢吹干［6，35-38］。用1 mL 甲醇溶解殘留物，所得溶液用0.45 μm 濾膜過濾，濾液供測試用。

1.4 測試

UPLC/MS-MS：采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲萃取條件的優(yōu)化

影響超聲萃取效率的因素主要有萃取溶劑種類及體積、萃取方式、萃取時間、萃取溫度［6，36-39］。首先以甲醇作為萃取溶劑，單獨考察萃取時間、萃取溶劑體積、萃取溫度對萃取量的影響（對6 個陽性樣品各超聲萃取1 次，觀察每個樣品的萃取量和總萃取量變化）。由表1～表3 可知，萃取量和總萃取量均隨著萃取時間的延長、萃取溶劑體積的增加、萃取溫度的升高而提升并達(dá)到最大值；達(dá)到最大值后，繼續(xù)延長萃取時間、增加萃取溶劑體積和升高萃取溫度，萃取量反而下降。萃取時間、萃取溶劑體積、萃取溫度同時影響萃取量和總萃取量，可通過正交實驗來考察其綜合影響。表4 為3 因素3 水平正交實驗的9 個實驗條件，在給定的萃取條件下，選擇甲醇作為萃取溶劑進(jìn)行1 次超聲萃取，6 個陽性樣品的萃取量和總萃取量也列于其中。針對6 個陽性樣品，根據(jù)表4 中的萃取量數(shù)據(jù)分別計算萃取時間A、萃取溶劑體積B、萃取溫度C的k值、R值，以確定優(yōu)化方案。5#、6#樣品的優(yōu)化方案分別為A2B2C1、A3B2C3，其余4 個樣品和總萃取量的優(yōu)化方案均為A2B2C3。綜合考慮，最終確定的優(yōu)化方案為A2B2C3。在此條件下，以甲醇作為萃取溶劑，對6 個陽性樣品進(jìn)行連續(xù)3 次超聲萃取，計算總萃取量和每次萃取量占總萃取量的百分比。實驗結(jié)果表明，對于1#、2#、3#、4#、5#、6#樣品，第1 次萃取量分別占總萃取量的91.86%、93.17%、94.57%、92.68%、95.83%、93.42%，第2 次萃取量分別占總萃取量的8.14%、6.83%、5.43%、7.32%、4.17%、6.58%，第3 次萃取時均未檢出OI。因此采用連續(xù)2次超聲萃取的方式提取紡織品中的異噻唑啉酮類抗菌劑。

表1 萃取量隨萃取時間的變化

表2 萃取量隨萃取溶劑體積的變化

表3 萃取量隨萃取溫度的變化

表4 超聲萃取正交實驗表

在上述萃取條件下，分別以表5 中所列出的11種常見溶劑作為萃取溶劑［37］，超聲萃取6 個陽性樣品中的OI。實驗結(jié)果表明，對于6個陽性樣品，甲醇的萃取量均最大。因此，超聲萃取條件最終確定以甲醇作為萃取溶劑，進(jìn)行連續(xù)2 次超聲萃取，萃取溫度45 ℃，萃取時間20 min，萃取溶劑體積20 mL。

表5 不同溶劑的萃取效果

2.2 分析條件的優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件

進(jìn)行質(zhì)譜分析時，毛細(xì)管電壓為+3 500 V，碰撞氣為高純氮氣（純度大于99.999%），鞘氣和吹掃氣均為氮氣，流速均為11 L/min，鞘氣和吹掃氣溫度分別為350、250 ℃。在此條件下，對各組分質(zhì)量濃度均為200 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析。根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)可知，異噻唑啉酮類抗菌劑在正離子模式下有比較好的響應(yīng)，而且經(jīng)過ESI 電離生成的特征分子離子峰均為［M+H］+，將其選為母離子峰，確定MI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 和DCOI 的準(zhǔn)分子離子（母離子）分別為m/z=116.02、149.98、152.02、166.03、208.08、214.13、282.05。在碰撞電壓分別為10、30、50、70 V 條件下，用高純氮氣對上述母離子進(jìn)行碰撞產(chǎn)生碎片離子。母離子與其產(chǎn)生的1 個子離子可以組成1個離子對。對于每個母離子，均選擇豐度較高的4個離子對，利用Optimizer 優(yōu)化軟件進(jìn)一步細(xì)致優(yōu)化碰撞能量。細(xì)致優(yōu)化時，碰撞能量從1 V 逐漸增大至79 V，增長步長為2 V。觀察不同碰撞能量下各離子對的豐度變化，豐度最大時的電壓就是優(yōu)化后的碰撞能量。各離子對的駐留時間由儀器根據(jù)保留時間（tR）以及保留時間變化范圍（ΔtR）自動計算，池加速電壓均為2 V，優(yōu)化后的參數(shù)見表6。

表6 7 種異噻唑啉酮類抗菌劑的動態(tài)MRM 條件

2.2.2 色譜條件

異噻唑啉酮類化合物都屬于極性比較強的化合物，因此本實驗采用C18類型的色譜柱對其進(jìn)行分離，比較不同型號的C18色譜柱的分離效果，最終采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）進(jìn)行色譜分離。在確定色譜柱后，分別考察甲醇/水溶液流動相和乙腈/水溶液流動相的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈/水溶液作為流動相時基線平穩(wěn)，譜峰峰形較好，峰面積和保留時間的重復(fù)性較好。為進(jìn)一步改善質(zhì)譜信號響應(yīng)，分別在水相中添加0.1%甲酸、0.01 mol/L 乙酸銨。結(jié)果表明，當(dāng)添加0.1%甲酸時，色譜峰之間能夠完全分離，而且響應(yīng)也比較高。因此，最終選擇的流動相為乙腈/水溶液（含0.1%甲酸）。在此流動相下，改變流速、柱溫、洗脫梯度，觀察不同色譜條件下各組分的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫較高時，柱壓明顯下降，但分離度也下降；流速較大時，各目標(biāo)分析物的保留時間變短，譜峰峰形變窄，柱壓上升，分離度下降［40］。色譜分離條件最終優(yōu)化為：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相A 為水（含0.1%甲酸），B為乙腈；當(dāng)洗脫梯度為0 min 時，流動相為90%A/10%B，8.00 min 時線性遞變?yōu)?0%A/90%B 并保持至9.00 min，9.01 min 時流動相變?yōu)?0%A/10%B 并保持至12.00 min；流速為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃。

在2.2 的條件下對7 種異噻唑啉酮類抗菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到的UPLC/MS-MS 圖如圖1 所示。圖1 中，各組分的譜峰之間完全分離，譜峰峰形尖銳，對稱性好。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的UPLC/MS-MS 圖

2.3 方法的回收率與精密度

回收率和精密度實驗見表7。

表7 回收率和精密度實驗

以不含目標(biāo)分析物的襯布作為空白樣品，采用空白樣品加標(biāo)回收的方法來確定方法的回收率和精密度［41］，所用襯布分別為白棉襯布、亞麻襯布、真絲襯布以及滌綸襯布。在空白樣品中分別添加3 個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0、4.0、20.0 μg/kg），制備添加回收實驗測試樣［36-41］，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平各制備6 份平行樣，按本實驗建立的方法進(jìn)行測試，再計算方法的加標(biāo)平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）［37］。由表7 可以看出，7 種目標(biāo)分析物的加標(biāo)平均回收率為80.25%～96.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.25%～14.59%。

2.4 方法的線性關(guān)系和檢出限

應(yīng)用本實驗建立的方法對系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，確定各混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的峰面積，用峰面積對質(zhì)量濃度作圖［36］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與其質(zhì)量濃度線性相關(guān)。表8給出了7 種異噻唑啉酮類抗菌劑的線性關(guān)系。按10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量下限（LOQs），7種異噻唑啉酮類抗菌劑的定量下限均為0.1 μg/kg。

表8 線性關(guān)系和定量下限

2.5 實際樣品測試

利用本實驗建立的方法對256 個市售紡織品進(jìn)行測試，結(jié)果在6 個樣品中檢測到了OI，這6 個樣品分別是梭織真絲連衣裙、針織真絲女式長袖套頭衫、純棉女式短袖襯衫、平紋機織染色女式棉上衣、梭織亞麻女式長袖襯衫以及梭織亞麻男式襯衫［6］，其中OI 的檢出量分別為6 694、718、829、10 169、336、8 796 mg/kg。歐盟法規(guī)要求紡織品中OI 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過10 mg/kg，這6 個樣品的OI 檢出量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過歐盟法規(guī)允許的限量水平，應(yīng)引起重視。圖2 是純棉女式短袖襯衫的UPLC/MS-MS 圖，在tR=6.830 min處有1 個尖銳譜峰，該保留時間與OI 標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間（tR=6.830 min）一致。

圖2 純棉女式短袖襯衫的UPLC/MS-MS 圖

3 結(jié)論

建立了UPLC/MS-MS 分析方法，能同時測定紡織品中的7 種異噻唑啉酮類抗菌劑，該方法簡便快捷，靈敏度高，定量下限低至0.1 μg/kg，遠(yuǎn)低于歐盟法規(guī)的限量水平，完全可以滿足紡織品中異噻唑啉酮類抗菌劑的日常檢測工作要求。應(yīng)用該方法對市售紡織品進(jìn)行測試，結(jié)果在部分樣品中檢出了OI，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為336～10 169 mg/kg，遠(yuǎn)高于歐盟允許限量水平（10 mg/kg），應(yīng)引起高度重視。