谷艷鵬，張澤人，孫 濤，韓慶軍，栗寧寧，魯儀增，竇德泉,①，鄭 健,①

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206；2.山東省林草種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102)

種間雜交可以將不同親本的優(yōu)良性狀集中到雜交子代[1]，是獲得具有豐富表型變異及高抗性優(yōu)良雜種的有效途徑[2,3]。大部分植物從人工授粉、雜交子代繁育、良種選育到產(chǎn)業(yè)化研究和應(yīng)用，均需經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的時(shí)間，制約了植物雜交育種和新品種選育的效率和進(jìn)程。雜交子代早期鑒定能夠縮短育種年限，加快育種進(jìn)程[4]，因而雜種鑒定是雜交育種進(jìn)程中十分重要的步驟[5,6]。傳統(tǒng)的雜種鑒定主要依賴于植株的外部形態(tài)特征，例如株高、葉片形狀和大小、花形和花色、果形和果色、生長(zhǎng)習(xí)性等，但是植株的發(fā)育狀況及外部環(huán)境因子均可能會(huì)影響雜種鑒定的準(zhǔn)確性[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物的雜種鑒定。SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記技術(shù)是雜種鑒定中最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，已應(yīng)用于梅樹(shù)(PrunusmumeSieb.et Zucc.)[8]、紫薇(LagerstroemiaindicaLinn.)[9]和青榨槭(AcerdavidiiFranch.)[10]等園林植物以及大豆〔Glycinemax(Linn.)Merr.〕[11]、落花生(ArachishypogaeaLinn.)[12]、糯玉米(Zeamaysvar.ceratinaKulesh)[13]和甘薯〔Ipomoeabatatas(Linn.)Lam.〕[14]等農(nóng)作物的雜種鑒定和遺傳多樣性分析工作。

花楸樹(shù)〔Sorbuspohuashanensis(Hance)Hedl.〕和少葉花楸〔S.hupehensisvar.paucijuga(D.K.Zang et P.C.Huang)L.T.Lu〕均為薔薇科(Rosaceae)花楸屬(SorbusLinn.)落葉喬木。花楸樹(shù)的葉、花和果觀賞價(jià)值均較高，其體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、可溶性糖、黃酮類和酚類等多種成分[15-17]，應(yīng)用前景廣闊。然而，由于野生花楸樹(shù)原分布于中國(guó)北方海拔900～2 500 m的區(qū)域，在低海拔區(qū)域栽培時(shí)易受到夏季高溫脅迫[18]，導(dǎo)致植株在越夏時(shí)葉片出現(xiàn)“日灼”現(xiàn)象，目前已從分子層面對(duì)花楸樹(shù)響應(yīng)高溫脅迫及葉片“日灼”機(jī)制開(kāi)展了系列研究[19-21]。少葉花楸為山東特有的瀕危樹(shù)種[22]，生于海拔300～1 000 m的山坡溝邊及林緣，在低海拔區(qū)域生長(zhǎng)良好，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性，目前針對(duì)少葉花楸的研究主要集中在地理分布[23]、形態(tài)特征[24]、光合特性[25]、染色體核型[26]等方面。通過(guò)雜交育種的方法，將少葉花楸的耐熱特性引入花楸樹(shù)，可提高花楸樹(shù)的耐熱性能，這對(duì)選育耐熱或適應(yīng)低海拔地區(qū)種植的花楸樹(shù)新品種有重要意義。

為此，作者采用實(shí)生苗雜交育種方法，對(duì)花楸樹(shù)和少葉花楸進(jìn)行種間雜交，并利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)雜交F1代群體進(jìn)行雜種鑒定及遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析，以期篩選出適宜于花楸樹(shù)和少葉花楸雜交后代早期雜種鑒定的分子標(biāo)記，進(jìn)而為花楸屬植物遺傳圖譜構(gòu)建以及耐熱品種中耐熱基因的QTL定位提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

以花楸樹(shù)為母本(SP)、少葉花楸(SH)為父本，于2020年4月采用常規(guī)人工控制授粉方法進(jìn)行雜交；同年10月采集果實(shí)，經(jīng)種實(shí)調(diào)制后獲得純凈、飽滿的雜交種子；同年11月將獲得的雜交種子經(jīng)低溫春化處理后，于2021年1月在溫室播種于裝有育苗基質(zhì)〔V(草炭)∶V(蛭石)=3∶1〕的營(yíng)養(yǎng)缽(直徑12 cm、高12 cm)中；2021年4月將幼苗移栽至花盆(直徑27.5 cm、高31 cm)中，統(tǒng)一水肥管理。有22株子代在育苗過(guò)程中死亡，最終獲得184株成活的雜交F1代植株(編號(hào)為PH1至PH184)，栽植于北京農(nóng)學(xué)院花楸種質(zhì)資源圃中。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 于2021年4月采集雜交親本及子代幼嫩葉片(每株約100 mg)，利用新型快速植物基因組DNA提取(離心柱型)試劑盒(型號(hào)DP3112，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取每個(gè)單株葉片基因組DNA；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 引物篩選 使用本課題組開(kāi)發(fā)的55對(duì)EST-SSR引物[27]，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司，在正向引物的5′端分別添加HEX、FAM、TAMRA和ROX熒光染料接頭，合成熒光引物。以2個(gè)親本及隨機(jī)選取的4株F1代單株的基因組DNA為模板進(jìn)行引物篩選。

使用S1000 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積25.0 μL，包含2×TaqPCR MasterMix(北京愛(ài)博森生物科技有限公司)12.5 μL、100.0 ng·μL-1基因組DNA 0.5 μL以及10.0 μmol·L-1正向和反向引物各1.0 μL，并用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s、72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸7 min。

用ABI 3730xl DNA分析儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。取1.0 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入8.5 μL去離子甲酰胺和0.5 μL Liz-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，依次于95 ℃變性5 min、4 ℃保溫10 min后，于4 ℃條件下3 000 r·min-1離心1 min后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析；毛細(xì)管電泳條件為13 kV預(yù)電泳3 min；1.5 kV進(jìn)樣10 s；10 kV電泳40 min。根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果篩選出9對(duì)在親本中具有多態(tài)性的特異性EST-SSR引物用于雜種鑒定。各引物的基本信息見(jiàn)表1。

表1 用于花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代群體EST-SSR標(biāo)記分析的9對(duì)多態(tài)性引物信息

1.2.3 雜種鑒定 以184株雜交F1代單株的基因組DNA為模板，按照前述擴(kuò)增體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，具有雙親特異位點(diǎn)的雜交后代為真雜種，而雙親位點(diǎn)缺失的雜交后代則需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GeneMarker 2.2.0軟件對(duì)毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將每個(gè)峰值的位置與泳道中的GeneScan500LIZ分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行比較，讀取擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，記錄等位基因。

使用POPGENE 32軟件計(jì)算雜交F1代群體的觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度和遺傳距離；使用CERVUS 3.0軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量；基于遺傳距離，使用MEGA 7.0軟件對(duì)雙親和雜交F1代群體進(jìn)行UPGMA聚類分析。

用a、b、c、d對(duì)不同等位基因進(jìn)行標(biāo)記，利用SPSS 26.0軟件中的卡方(χ2)擬合優(yōu)度檢驗(yàn)對(duì)雜交F1代群體的基因型分離情況進(jìn)行分析[28]，以確定基因型分離情況與孟德?tīng)柗蛛x定律的符合程度。

2 結(jié)果和分析

2.1 雜交F1代單株的雜種鑒定結(jié)果

根據(jù)9對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果獲得花楸樹(shù)和少葉花楸及其雜交F1代的基因型。在184株F1代單株中，有9株F1代單株分別在3～7個(gè)位點(diǎn)上出現(xiàn)異?；蛐?，占F1代單株總數(shù)的4.9%；有175株單株在9個(gè)EST-SSR位點(diǎn)上均擴(kuò)增出雙親條帶，這些單株均可認(rèn)為是真雜種后代，雜種率達(dá)95.1%。

由9對(duì)EST-SSR引物在親本和9株異常F1代單株中的擴(kuò)增結(jié)果(表2)可見(jiàn)：在出現(xiàn)異?；蛐偷腇1代單株中，PH1有6個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶的缺失，其中3個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH4有6個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中3個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH6有5個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51外，另4個(gè)位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH7有4個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中2個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH8有3個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本條帶缺失，其中2個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH9有4個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，其中2個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出新條帶；PH10有7個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51位點(diǎn)外，其他6個(gè)位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH19有6個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，這6個(gè)位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶；PH26有6個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)母本或父本條帶缺失，除sors51位點(diǎn)外，其他5個(gè)位點(diǎn)均擴(kuò)增出新條帶。

表2 9對(duì)EST-SSR引物在親本及9株異常F1代中的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 雜交F1代中真雜種單株的基因分離規(guī)律

依據(jù)9對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代175株真雜種的基因分離規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)：引物sorsd29在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為aa×bb型，即純合互補(bǔ)型；引物sorsd39、sors51和sors85在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為aa×bc型，即父本型；引物sors33和sors89在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為ab×cd型，即雙親互補(bǔ)型；引物sors60、sors71和sorsk10在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為ab×ac型，即雜合互補(bǔ)型[28]。

表3 基于9對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代中175株真雜種的基因分離規(guī)律

由表3還可見(jiàn)：由于引物sorsd29在親本中的擴(kuò)增結(jié)果為純合互補(bǔ)型，因而，其F1代175株真雜種均未出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，基因型均為ab型。另8對(duì)引物在這175株F1代真雜種中的擴(kuò)增結(jié)果均出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，其中，引物sorsd39、sors51和sors85在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)2種基因型，即ab和ac，分離比略有不同，但均接近1∶1，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，與期望分離比無(wú)顯著(P>0.05)差異；引物sors33和sors89在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)4種基因型，即ac、ad、bc和bd；引物sors60、sors71和sorsk10在F1代中的擴(kuò)增結(jié)果也呈現(xiàn)4種基因型，即aa、ac、ab和bc，這5對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)的4種基因型在F1代群體中的分離比存在一定差異，但經(jīng)χ2檢驗(yàn)，與期望分離比(1∶1∶1∶1)均無(wú)顯著差異，表明在花楸樹(shù)和少葉花楸的雜交F1代中，上述8對(duì)EST-SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的基因型均符合孟德?tīng)柗蛛x定律。

2.3 雜交F1代中真雜種的遺傳多樣性

依據(jù)9對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代中175株真雜種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)：9個(gè)EST-SSR位點(diǎn)共包含28個(gè)等位基因，均值為3.1；有效等位基因數(shù)為2.0～4.0，均值為2.9；多態(tài)性信息含量和Shannon’s信息指數(shù)分別為0.375～0.705和0.693～1.386，均值分別為0.566和1.076；觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.737～1.000和0.501～0.752，均值分別為0.920和0.640。總體上看，sors33和sors89 位點(diǎn)的各項(xiàng)遺傳多樣性指數(shù)均較大，sorsd29位點(diǎn)的各項(xiàng)遺傳多樣性指數(shù)均最小。

表4 基于9對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代175株真雜種的遺傳多樣性

2.4 親本與雜交F1代真雜種的聚類分析

依據(jù)花楸樹(shù)和少葉花楸及其雜交F1代175株真雜種的Nei’s遺傳距離，采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

SP: 花楸樹(shù)(母本)Sorbus pohuashanensis(Hance)Hedl.(female parent); SH: 少葉花楸(父本)S.hupehensis var.paucijuga(D.K.Zang et P.C.Huang)L.T.Lu(male parent); PH: 雜交F1代單株Hybrid individuals of F1 generation.

由圖1可見(jiàn)：在Nei’s遺傳距離0.28處，供試樣本分為2組，其中少葉花楸單獨(dú)為組Ⅰ，花楸樹(shù)和175株F1代單株聚為組Ⅱ。在Nei’s遺傳距離0.24處，組Ⅱ分為2個(gè)亞組，其中81株F1代單株聚為亞組Ⅱ1，占F1代真雜種總數(shù)的46.3%；另94株F1代單株與花楸樹(shù)聚為亞組Ⅱ2，占F1代真雜種總數(shù)的53.7%?？傮w上看，175株F1代單株與花楸樹(shù)有較近的遺傳關(guān)系。

3 討論和結(jié)論

在植物雜種鑒定方面，分子標(biāo)記可從基因組水平上揭示雜交種與親本之間的遺傳差異，且不受環(huán)境條件和生長(zhǎng)發(fā)育狀況的影響，能夠在幼苗早期進(jìn)行鑒定[29]。本研究使用9對(duì)EST-SSR引物對(duì)花楸樹(shù)和少葉花楸的184株雜交F1代進(jìn)行了雜種鑒定，其中175株被鑒定為真雜種，雜種率達(dá)95.1%，其余9株單株的擴(kuò)增結(jié)果中存在缺失雙親條帶或出現(xiàn)新條帶的現(xiàn)象，在F1代單株中出現(xiàn)新條帶的原因可能有2個(gè)：一是在減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生基因重組或突變[30]，二是在花粉采集和去雄或人工授粉過(guò)程中出現(xiàn)花粉污染的情況。

當(dāng)雜交群體受到選擇、突變、遺傳漂變等影響時(shí)，子代的基因型比例會(huì)偏離孟德?tīng)栠z傳定律，這種現(xiàn)象被稱為偏分離[31]；基因偏分離現(xiàn)象會(huì)影響標(biāo)記間的重組率，從而影響植物的遺傳作圖[32]。周寧寧等[33]對(duì)月季(RosachinensisJacq.)雜交F1代基因型的分離情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在20個(gè)SSR標(biāo)記中有9個(gè)標(biāo)記產(chǎn)生了偏分離；汪國(guó)云等[34]對(duì)楊梅(MyricarubraSieb.et Zucc.)雜交群體的研究結(jié)果表明，8個(gè)SSR標(biāo)記中有2個(gè)標(biāo)記產(chǎn)生了偏分離。本研究中，除9株F1代單株出現(xiàn)異?；蛐屯猓?75株雜交F1代真雜種中有8個(gè)位點(diǎn)的分離比符合孟德?tīng)柗蛛x定律，未發(fā)生顯著的雜種偏分離現(xiàn)象，說(shuō)明親本間的基因兼容性較高[35]，也進(jìn)一步支持了“在花楸屬種類中花楸樹(shù)與少葉花楸的遺傳距離相對(duì)較近”[36]的研究結(jié)果。然而，花楸樹(shù)與少葉花楸在分布區(qū)域、生長(zhǎng)習(xí)性、表型性狀(特別是小葉數(shù)量)及抗熱性上有較大差異，通過(guò)種間雜交可以選育綜合雙親優(yōu)良性狀的雜種后代。此外，本研究中所有的標(biāo)記均未發(fā)生偏分離，進(jìn)一步表明所選的9對(duì)EST-SSR引物均可用于構(gòu)建花楸樹(shù)與少葉花楸雜交F1群體的遺傳圖譜。

SSR標(biāo)記具有數(shù)量大、多態(tài)性高、共顯性、可靠性高和多等位基因檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[37]。本研究使用的9對(duì)EST-SSR引物在175株F1代真雜種中共擴(kuò)增出28個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)3.1個(gè)等位基因，平均有效等位基因數(shù)為2.9。多態(tài)性信息含量是評(píng)價(jià)引物的多態(tài)性的重要指標(biāo)，多態(tài)性信息含量大于0.50，說(shuō)明引物的多態(tài)性水平高；多態(tài)性信息含量小于0.25，則說(shuō)明引物的多態(tài)性水平低[38]。本研究中，9對(duì)EST-SSR引物的平均多態(tài)性信息含量為0.566，除引物sorsd29的多態(tài)性信息含量小于0.5外，其他8對(duì)EST-SSR引物的多態(tài)性信息含量均大于0.5，表明本研究篩選出來(lái)的EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性。

SSR標(biāo)記多用于植物天然群體遺傳多樣性分析[39,40]，但在人工雜交群體的遺傳多樣性研究中應(yīng)用尚不廣泛，目前已應(yīng)用于茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.)O.Ktze.〕[41]、牡丹(Paeonia×suffruticosaAndr.)[42]和紫薇[43]等栽培植物的雜交群體遺傳多樣性研究和遺傳變異分析。本研究采用EST-SSR標(biāo)記研究了花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果顯示該雜交F1代群體的Shannon’s信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度等遺傳多樣性參數(shù)均略高于茶樹(shù)、牡丹和紫薇等樹(shù)種的雜交F1代群體，表明花楸樹(shù)和少葉花楸的雜交F1代群體遺傳變異顯著、遺傳多樣性豐富，說(shuō)明EST-SSR標(biāo)記可應(yīng)用于花楸屬種類雜交后代群體的遺傳多樣性研究和雜種鑒定。

花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代真雜種群體具有豐富的遺傳變異，但聚類分析結(jié)果顯示F1代群體與母本聚為一組，而父本則獨(dú)立成組，說(shuō)明花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代真雜種群體與母本的遺傳關(guān)系較近，這一現(xiàn)象也存在于甘蔗(Saccharumspp.)和蔗茅(ErianthusfluvusNess)[44]、棗(ZiziphusjujubaMill.)和酸棗(Z.acidojujubaCheng et Liu)[45]以及菊花腦(ChrysanthemumnankingenseHand.-Mazt.)和甘菊〔C.lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino〕[46]的雜交F1代群體與親本的遺傳關(guān)系中。這一現(xiàn)象一方面可能與親本的遺傳物質(zhì)傳遞直接相關(guān)，另一方面也與所用引物數(shù)量及引物特征間接相關(guān)[45]。雖然本研究使用的9個(gè)EST-SSR標(biāo)記能鑒定出花楸樹(shù)和少葉花楸雜交F1代的真雜種，并分析其遺傳多樣性，但是總體來(lái)看，使用的EST-SSR標(biāo)記數(shù)量相對(duì)較少，且并未發(fā)現(xiàn)這9個(gè)標(biāo)記與葉片“日灼”現(xiàn)象有關(guān)，故本研究中所有F1代單株與母本聚為一類，并不能確定這些F1代單株是否與母本同樣表現(xiàn)出在越夏時(shí)葉片出現(xiàn)“日灼”現(xiàn)象，因此，后續(xù)需對(duì)這些雜交F1代群體的表型性狀變異進(jìn)行深入研究，特別是葉片“日灼”等與抗熱性有關(guān)的性狀，或者開(kāi)發(fā)與抗熱性狀相關(guān)聯(lián)的EST-SSR標(biāo)記。

總之，本研究以花楸樹(shù)為母本、少葉花楸為父本，成功進(jìn)行了種間雜交并獲得了175個(gè)雜種單株構(gòu)成的雜交F1代群體，且雜交群體具有豐富的遺傳多樣性。篩選出的9對(duì)EST-SSR引物多態(tài)性較高，且在雜交群體中未出現(xiàn)明顯偏分離，可用于后續(xù)遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位。