徐玲霞，柳 巧，王景儀，董蒙蒙，蔣繼宏, 曹小迎

(江蘇師范大學生命科學學院 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 徐州 221116)

紅豆杉屬(TaxusLinn.)植物為常綠喬木或灌木，全世界共有11種，中國有4種1變種1雜交種，即紅豆杉〔T.chinensis(Pilger)Rehd.〕、東北紅豆杉(T.cuspidataSieb.et Zucc.)、西藏紅豆杉(T.wallichianaZucc.)、云南紅豆杉(T.yunnanensisW.C.Cheng et L.K.Fu)、南方紅豆杉〔T.wallichianavar.mairei(Lemée et H.Lév.)L.K.Fu et N.Li〕和曼地亞紅豆杉(T.×mediaRehd.)[1]。紅豆杉(Taxussp.)是珍貴的用材樹種，不但具有較高的觀賞價值，還具有很高的藥用價值[2,3]。紅豆杉中的紫杉醇是一種抗癌活性成分，能夠有效抑制癌細胞的生長和繁殖[4]。然而，在自然條件下紅豆杉生長緩慢，體內(nèi)的紫杉醇和中間產(chǎn)物〔如巴卡亭Ⅲ和10-去乙?；涂ㄍあ?10-DAB)[5]〕的含量均極低，因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高紅豆杉體內(nèi)紫杉醇和中間產(chǎn)物含量具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)存在豐富的內(nèi)生菌資源[6-8]，這些內(nèi)生菌能夠促進宿主植物生長，與宿主植物和諧共生、協(xié)同進化[9,10]。部分內(nèi)生菌可產(chǎn)生一些特殊的生物活性成分[11]，這些生物活性成分可以成為內(nèi)生菌誘導(dǎo)子[12]。植物的細胞膜或細胞質(zhì)中含有可識別內(nèi)生菌誘導(dǎo)子的受體，當受體與內(nèi)生菌誘導(dǎo)子結(jié)合后，植物細胞中的受體激酶被激活，從而改變下游基因的表達，產(chǎn)生特定的次生代謝產(chǎn)物[13]，因此，內(nèi)生菌誘導(dǎo)子對宿主植物的生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物積累具有一定的促進作用[14-16]。例如：內(nèi)生真菌AL4的粗誘導(dǎo)子對茅蒼術(shù)〔Atractylodeslancea(Thunb.)DC.〕懸浮細胞中的揮發(fā)油成分蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的積累均有一定的促進作用[17]；Hemmati等[18]從長春花〔Catharanthusroseus(Linn.)G.Don〕品種‘冰粉’(‘Icy Pink’)中分離到2株內(nèi)生真菌，這2株內(nèi)生真菌既可以促進長春花愈傷組織的生長，還可以提高長春花愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物秋水仙堿和長春堿的含量。

南方紅豆杉為國家一級重點保護野生植物，主要分布于長江流域以南地區(qū)，在多數(shù)省份常生于海拔1 000～1 200 m以下的山林中。目前，關(guān)于南方紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)、促生能力及產(chǎn)紫杉醇能力等的研究報道較多[19-23]，而關(guān)于南方紅豆杉內(nèi)生真菌對南方紅豆杉體內(nèi)紫杉醇等藥效成分的合成和積累的影響尚不清楚。為此，本研究利用不同分離培養(yǎng)基從南方紅豆杉的根、枝和葉中分離內(nèi)生真菌，并對這些內(nèi)生真菌進行了分子鑒定；隨后，將這些內(nèi)生真菌制成誘導(dǎo)子并均勻噴灑到3年生南方紅豆杉植株上，采用HPLC技術(shù)分析不同內(nèi)生真菌處理組南方紅豆杉葉中紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-DAB的含量差異，以期為使用內(nèi)生真菌調(diào)控南方紅豆杉藥效成分的積累提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取湖北星斗山國家級自然保護區(qū)(東經(jīng)109°00′06″、北緯29°59′49″)內(nèi)5株健康的野生南方紅豆杉植株，利用樣株上的新鮮根、枝和葉分離內(nèi)生真菌。采集樣株周圍0～5 cm土層中的側(cè)根；在樣株冠層的高、中、低位置各隨機采1個枝條，并將枝和葉分開。將采摘的根、枝和葉分別蠟封于自封袋內(nèi)，放入液氮中帶回實驗室立即進行實驗。

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子處理的樣株為3年生南方紅豆杉植株，盆栽于江蘇師范大學生命科學學院重點實驗室溫室中。栽培基質(zhì)為原生態(tài)土壤(由江蘇省無錫市紅豆集團紅豆杉生物技術(shù)有限公司提供)和營養(yǎng)土(由棉籽殼、玉米芯、米糠、豆粕、麥麩、珍珠巖經(jīng)高溫發(fā)酵、消毒、殺蟲加工制作而成)等質(zhì)量比混合基質(zhì)，培養(yǎng)條件為溫度22 ℃、空氣相對濕度60%～80%、光照時間16 h·d-1、光照度6 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離、純化和保種 用流水將采集的南方紅豆杉根、枝和葉沖洗2 h，室溫條件下超聲(功率500 W)清洗3次，每次2～3 min；參照臧威等[21]的方法對根、枝和葉進行消毒。將最后一次沖洗根、枝和葉的無菌蒸餾水分別涂布在察氏培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Wickerham培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基5種分離培養(yǎng)基上，置于28 ℃條件下暗培養(yǎng)7 d。若無菌落長出，說明消毒效果較好，可認定分離的真菌均來自南方紅豆杉體內(nèi)。將消毒過的根、枝和葉置于無菌研缽中研磨，將磨好的粉末分別涂布在前述的5種分離培養(yǎng)基上，每個器官每種培養(yǎng)基10個平板，置于28 ℃條件下暗培養(yǎng)14 d。

待菌落長出后，將每個菌落分別接種到新的純化培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)中，置于28 ℃條件下暗培養(yǎng)。經(jīng)過反復(fù)純化，直至形成單個菌落，即純化的內(nèi)生真菌菌株。

根據(jù)菌落形態(tài)和顏色去除重復(fù)菌株，取面積約5 mm×5 mm的菌塊，接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，置于4 ℃冰箱中保種。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分子鑒定 取面積約5 mm×5 mm的內(nèi)生真菌保種菌塊，接種到PDA固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃條件下暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后記錄菌落的生長情況，如菌落的形狀、大小、顏色、菌絲致密程度和色素產(chǎn)生情況等。

將菌體收集到1.5 mL離心管中，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min；加入200 μL質(zhì)量體積分數(shù)2%的CTAB和適量石英砂，置于65 ℃水浴中保溫30 min；加入苯酚-三氯甲烷混合液〔V(苯酚)∶V(三氯甲烷)=2∶1〕200 μL，震蕩2 min后，室溫條件下10 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入等體積異丙醇后，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min；室溫條件下10 000 r·min-1離心10 min，去上清；加入體積分數(shù)70%乙醇200 μL并吹打數(shù)次；室溫條件下10 000 r·min-1離心10 min，棄乙醇，沉淀自然風干后加入30 μL無菌蒸餾水，即內(nèi)生真菌基因組DNA粗提液，置于-20 ℃冰箱中保存。

將內(nèi)生真菌基因組DNA粗提液渦旋震蕩30 min后，用無菌蒸餾水稀釋5～10倍；使用通用引物NL1(序列為5′-GCATATCAATAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(序列為5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積30.0 μL，包括PremixTaqTMVersion 2.0〔寶生物工程(大連)有限公司〕15.0 μL、引物NL1 0.5 μL、引物NL4 0.5 μL、基因組DNA粗提液1.0 μL，ddH2O補足剩余體積。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。使用質(zhì)量體積分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并將擴增產(chǎn)物交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的相關(guān)菌株序列進行比對，從而確定各內(nèi)生真菌菌株的種類。

1.2.3 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液的制備及處理方法 將純化的內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃條件下暗培養(yǎng)；菌株活化后，取面積約5 mm×5 mm菌塊，接種到裝有PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃黑暗條件下200 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d；用無菌濾紙過濾，濾液即內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液。

用小噴壺將內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液均勻噴灑在南方紅豆杉植株上，每株噴灑內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液40 mL。對照組僅噴灑等體積的無菌蒸餾水。每組3株南方紅豆杉植株。處理7 d后，剪取植株從上往下第4和第5個枝上的所有葉，置于-80 ℃冰箱中保存、待用。

1.2.4 紫杉醇和中間產(chǎn)物含量的測定

1.2.4.1 標準品溶液的制備 稱取購自美國Sigma公司的紫杉醇(純度在97%及以上)、巴卡亭Ⅲ(純度在99%及以上)、10-DAB(純度在99%及以上)標準品各1 mg，精密稱量后，分別使用甲醇(色譜純)配制成質(zhì)量濃度1 mg·mL-1的標準品溶液，置于4 ℃冰箱中保存、待用。

1.2.4.2 樣品溶液的制備 取南方紅豆杉的葉，使用RV8冷凍干燥機(英國EDWAROS)冷凍干燥后研磨成粉末；精密稱取1.0 g葉粉末，置于50 mL離心管中，按照料液比(m∶V)1∶20添加酸化甲醇溶液(含體積分數(shù)0.01%乙酸的甲醇溶液)，室溫條件下超聲(功率500 W)處理1 h；用雙層濾紙過濾，保留濾液，濾渣重復(fù)提取2次；合并濾液，用SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)在低于40 ℃的條件下進行減壓蒸干；用甲醇將析出物溶解并定容至1 mL，室溫條件下超聲(功率500 W)處理30 min；室溫條件下10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用孔徑0.45 μm的有機相濾膜過濾，濾液即樣品溶液。

1.2.4.3 HPLC分析條件 采用Aglient 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)進行HPLC分析。色譜柱為Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Thermo Fisher公司)。以乙腈(色譜純)為流動相A、體積分數(shù)0.1%甲酸溶液為流動相B進行線性梯度洗脫，洗脫程序為：0 min，5%A；25 min，100%A；30 min，100%A；35 min，5%A。流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長227 nm；進樣量10 μL。

每個處理組隨機選取1株植株的樣品溶液，按照上述分析條件進樣檢測。選取紫杉醇含量最高的內(nèi)生真菌處理組，利用該處理組和對照組各3個樣品溶液的檢測結(jié)果進行驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2007軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 南方紅豆杉不同器官內(nèi)生真菌多樣性分析

統(tǒng)計結(jié)果(表1)表明：本研究從南方紅豆杉的根、枝和葉中共分離到69株內(nèi)生真菌。其中，葉中內(nèi)生真菌菌株數(shù)量最多，有46株，占分離的內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的66.7%；枝中內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量次之，有14株，占分離的內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的20.3%；根中內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量最少，僅9株，占分離的內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的13.0%。

表1 南方紅豆杉根、枝和葉中內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量

鑒定結(jié)果表明：分離到的69株內(nèi)生真菌隸屬于26屬36種，在這些內(nèi)生真菌中，ConiothyriumCorda、MuyocopronSpeg.和PhyllostictaPers.3個屬的菌株數(shù)量較多。其中，Muyocopron屬的菌株數(shù)量最多，有15株，占分離的內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的21.7%，遠高于其他屬菌株數(shù)量，說明該屬為南方紅豆杉內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬。值得注意的是，不同種類內(nèi)生真菌在南方紅豆杉根、枝和葉中的分布存在明顯差異，許多內(nèi)生真菌僅局限于南方紅豆杉的特定器官中，如AlternariaNees和ColletotrichumCorda屬菌株僅分布在南方紅豆杉的葉中，AporosporaJ.C.Krug et Jeng 屬菌株僅分布在南方紅豆杉的枝中，而ClonostachysCorda屬菌株僅分布在南方紅豆杉的根中。Muyocopronatromaculans(Bills et Polishook)Hern.-Restr., J.D.P.Bezerra et Crous菌株在南方紅豆杉的枝和葉中分別有4和11株，為南方紅豆杉枝和葉中最常見的內(nèi)生真菌，而FusariumoxysporumSchltdl.和Talaromycesverruculosus(Peyronel)Samson, N.Yilmaz, Frisvad et Seifert菌株在南方紅豆杉的根中均有2株，為南方紅豆杉根中最常見的內(nèi)生真菌。

2.2 內(nèi)生真菌對南方紅豆杉葉中紫杉醇及中間產(chǎn)物含量的影響

經(jīng)HPLC檢測分析，在19種內(nèi)生真菌處理組的南方紅豆杉葉中可同時檢測到紫杉醇及中間產(chǎn)物巴卡亭Ⅲ和10-DAB。統(tǒng)計結(jié)果(表2)表明：在檢測到紫杉醇的19個內(nèi)生真菌處理組中，南方紅豆杉葉中巴卡亭Ⅲ和10-DAB的含量均低于對照組(未噴灑內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液)；Coniochaetahoffmannii(J.F.H.Beyma)Z.U.Khan, Gené et Guarro、GlomerellaacutataGuerber et J.C.Correll、Gymnopilusluteofolius(Peck)Singer、NeopestalotiopsisaotearoaMaharachch., K.D.Hyde et Crous、ParaconiothyriumarchidendriVerkley, G?ker et Stielow、Paraconiothyriumfuscomaculans(Sacc.)Verkley et Gruyter、Phyllostictafoliorum(Sacc.)Wikee et Crous、Phyllostictaphiloprina(Berk.et M.A.Curtis)Wikee et Crous、PseudodidymocyrtislobariellaeFlakus, Rodr.Flakus et Etayo和TrichodermacaribbaeumSamuels et Schroers處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量均高于對照組，其余9個內(nèi)生真菌處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量均低于對照組。在紫杉醇含量高于對照組的10個內(nèi)生真菌處理組中，P.lobariellae處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量較對照組升高幅度最大，升高了286.44%，但該組的巴卡亭Ⅲ和10-DAB含量卻較對照組明顯下降，分別降低了89.21%和70.64%；G.luteofolius和C.hoffmannii處理組南方紅豆杉葉中紫杉醇含量也明顯高于對照組，分別升高了205.08%和135.59%，這2組的巴卡亭Ⅲ和10-DAB含量也較對照組明顯下降。

表2 不同內(nèi)生真菌處理組南方紅豆杉葉中紫杉醇和中間產(chǎn)物的含量1)

為了驗證上述結(jié)果的可信度，對內(nèi)生真菌P.lobariellae處理組和對照組的南方紅豆杉葉中紫杉醇及中間產(chǎn)物巴卡亭Ⅲ和10-DAB的含量進行了3次重復(fù)檢測，結(jié)果見表3。由表3可見：經(jīng)內(nèi)生真菌P.lobariellae處理后，南方紅豆杉葉中巴卡亭Ⅲ和10-DAB的含量確實較對照組下降，而紫杉醇含量卻較對照組明顯升高。

表3 內(nèi)生真菌Pseudodidymocyrtis lobariellae Flakus, Rodr.Flakus et Etayo對南方紅豆杉葉中紫杉醇和中間產(chǎn)物含量的影響

3 討論和結(jié)論

內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物中，并且廣泛分布于植物的各個組織中，但研究者在不同植物種類中分離到的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量和菌種數(shù)量均存在較大差異，少則十幾種，多則近百種[8,21]。1993年，Stierle等[24]從短葉紅豆杉(TaxusbrevifoliaNutt.)韌皮部中分離到第1個產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌TaxomycesandreanaeStrobel, A.Stierle, D.Stierle et W.M.Hess；迄今為止，研究者已經(jīng)分離出大量的紅豆杉內(nèi)生真菌，并發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生真菌能產(chǎn)生紫杉醇[25-28]。本研究從南方紅豆杉中分離到的DiaporthediscoidisporaF.Huang, K.D.Hyde et Hong Y.Li、F.oxysporum、TrichodermatheobromicolaSamuels et H.C.Evans和Coniothyriumpyrinum(Sacc.)J.Sheld.會降低南方紅豆杉葉中紫杉醇含量，而Trichodermacaribbaeum會提高南方紅豆杉葉中紫杉醇含量。有研究者發(fā)現(xiàn)，紅豆杉內(nèi)生真菌可以促進植物體內(nèi)紫杉醇的積累，如ChaetomiumglobosumKunze和ParaconiothyriumbrasilienseVerkley可促進歐洲榛(CorylusavellanaLinn.)細胞中紫杉醇的積累[29]。本研究結(jié)果表明：在南方紅豆杉中分離到P.brasiliense的同屬種類P.archidendri，且經(jīng)該菌種處理后南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量高于對照組(未噴灑內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液)，據(jù)此推測P.archidendri可能具有促進紫杉醇積累的功能。紅豆杉內(nèi)生真菌還可促進紫杉醇合成過程中中間代謝物向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如從云南紅豆杉中分離到的Microsphaeropsisonychiuri(Punith.)Morgan-Jones、Mucorsp.和Alternariaalternata(Fr.)Keissl.可以羥基化和環(huán)化2個紫杉烷類中間產(chǎn)物，生成下游代謝物[30]。然而，本研究雖然分離到A.alternata的同屬種類A.doliconidiumJ.F.Li, Camporesi et K.D.Hyde，但是未在該菌種處理的南方紅豆杉葉中檢測到紫杉醇，推測該菌種可能抑制南方紅豆杉葉中紫杉醇的合成，致使紫杉醇含量低于檢測極限，從而無法檢出。

本研究中，P.lobariellae處理組南方紅豆杉葉中紫杉醇含量較對照組升高幅度最大，值得一提的是，該菌種是Flakus等[31]在地衣中首次分離并命名的一個新菌種，關(guān)于其生物功能尚未見研究報道，在后續(xù)研究中可對該菌種進行系統(tǒng)研究。G.luteofolius處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量較對照組升高幅度僅次于P.lobariellae，該菌種也是近年來發(fā)現(xiàn)的新菌種，具有藥品廢物的生物降解功能[32]。C.hoffmannii處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量較對照組升高幅度也較大，該菌種為絲狀子囊菌，是一種兼性植物病原菌，可用于生產(chǎn)生物柴油[33]。與對照組相比，上述3種內(nèi)生真菌處理組南方紅豆杉葉中的10-DAB和巴卡亭Ⅲ含量明顯降低，而紫杉醇含量卻明顯升高，說明這3種內(nèi)生真菌能促進紫杉醇的生物合成，推測可能是這3種內(nèi)生真菌的發(fā)酵液中含有某種活性因子，激發(fā)了紫杉醇生物合成過程中某些代謝酶的活性，催化巴卡亭Ⅲ和10-DAB轉(zhuǎn)化為紫杉醇。

作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，將內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液噴灑在南方紅豆杉植株上7 d后，南方紅豆杉的葉未出現(xiàn)明顯的微生物侵染癥狀，這可能是因為內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的處理時間較短，尚未發(fā)揮出明顯效應(yīng)。檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子溶液處理7 d后，在半數(shù)處理組南方紅豆杉的葉中未檢出紫杉醇，這可能是因為紫杉醇含量太低，超出了高效液相色譜儀的檢測極限。重復(fù)驗證結(jié)果顯示：P.lobariellae處理組南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量雖然存在較大波動，但該組的紫杉醇含量與對照組間差異顯著，再次證明P.lobariellae可提高南方紅豆杉葉中的紫杉醇含量。

綜合上述研究結(jié)果，南方紅豆杉的內(nèi)生真菌多樣性較高，在其根、枝和葉中共分離到69株內(nèi)生真菌，隸屬于26屬36種；其中10種內(nèi)生真菌能夠促進南方紅豆杉葉中紫杉醇的合成，以P.lobariellae的促進作用最顯著，G.luteofolius和C.hoffmannii的促進作用也較明顯，這3種內(nèi)生真菌可作為調(diào)控南方紅豆杉紫杉醇積累的候選菌。