黃小鳳，韋陽連，袁 葉，余金昌，袁志永，王偉山

(東莞植物園，廣東 東莞 523086)

荔枝(LitchichinensisSonn.)起源于中國，屬于特色農(nóng)產(chǎn)品之一。目前，國內(nèi)荔枝栽培面積約5.3×105hm2，形成了海南特早熟、粵桂西南早熟、粵桂中部中熟、粵東閩南晚熟、瀘州特晚熟等特色優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)[1，2]。荔枝品種眾多，表型多樣性豐富。1982年，傅玲娟等[3]在海南島調查發(fā)現(xiàn)，野生荔枝的葉片、果實表型多樣，根據(jù)果皮特征可分為3種類型；1986年，吳仁山以果皮特征為一級分類標準，果形為二級分類標準，其他性狀為三級和四級分類標準，將廣西的荔枝品種分為7大類[4]；吳淑嫻[5]在前人研究基礎上，以成熟果實中部果皮上龜裂片和裂片峰的主要特征作為分類標準，將全國200余份荔枝品種分為果皮龜裂片尖突型、隆起型、平坦型3大類型，每個類型均包含多種形態(tài)的裂片峰。荔枝豐富的表型多樣性是其遺傳多樣性在形態(tài)上的體現(xiàn)。

荔枝遺傳多樣性研究對其資源保護和開發(fā)利用具有重要意義。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術已成為遺傳多樣性研究的有效方法。目前，研究者已利用RAPD、AFLP、ISSR、EST-SSR、SNP、SRAP等分子標記[6-12]對荔枝品種資源進行了親緣關系及遺傳多樣性研究，說明將分子標記方法用于荔枝種質資源研究具有較高的可行性和有效性。

栽培植物的核心種質庫能以最小的品種數(shù)量和遺傳重復，最大程度地代表整個物種資源的遺傳多樣性，核心種質庫的構建能夠提高種質資源的管理和利用效率，已成為國內(nèi)外植物種質資源研究的重點[13]。目前，已經(jīng)利用分子標記構建了水稻(OryzasativaLinn.)、核桃(JuglansregiaLinn.)、杏(ArmeniacavulgarisLinn.)、木荷(SchimasuperbaGardn.et Champ.)、杉木〔Cunninghamialanceolata(Lamb.)Hook.〕和建蘭〔Cymbidiumensifolium(Linn.)Sw.〕等植物的核心種質庫[14-19]。荔枝樹體高、占地面積大，其活植物保存需要占用大量土地。為了能夠在有限的土地上盡可能多地保存荔枝品種資源，維持其遺傳多樣性，宜利用分子標記構建荔枝核心種質庫。

作者所在課題組現(xiàn)收集到荔枝品種(品系)221份，且大多數(shù)品種(品系)的遺傳多樣性和親緣關系未知。為客觀評價荔枝品種資源的遺傳多樣性，弄清品種間的遺傳關系，作者利用SNP分子標記對收集的荔枝品種(品系)進行遺傳多樣性和遺傳關系分析，并在此基礎上構建荔枝核心種質庫，以期高效保存荔枝種質資源的遺傳多樣性，有效提高其管理水平，為荔枝種質資源的管理與利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試樣本為從廣東、廣西、福建、海南和四川收集的221份荔枝品種(品系)，包括154份晚熟品種(品系)(編號1～154)、50份中熟品種(品系)(編號155～204)、11份早熟品種(品系)(編號205～215)、6份特早熟品種(品系)(編號216～221)，各品種(品系)的名稱和來源地見附錄Ⅰ。

供試品種(品系)均種植于東莞植物園荔枝種質資源圃內(nèi)。該種質圃地處南亞熱帶季風氣候區(qū)，光照充足、熱量豐富、雨量充沛，圃內(nèi)土壤為赤壤土。

每份樣本選擇3株單株，株齡為4～14 a，在每株樣株中上部的健康老熟枝條上各采集1枚老熟葉片，于-70 ℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用CTAB小樣法[20]提取葉片DNA并進行純度檢測，于-20 ℃保存、備用。

1.2.2 SNP分型 從Liu等[11]開發(fā)的155對SNP引物中篩選出分型穩(wěn)定、多態(tài)性高的19對SNP引物進行PCR擴增反應，供試引物基本信息見表1。PCR擴增體系總體積10.0 μL，包括10 ng·μL-1基因組DNA 2.0 μL、5 U·μL-1rTaqDNA聚合酶〔寶生物工程(大連)有限公司〕0.6 μL、10×Buffer(含Mg2+)1.0 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.2 μL、10 mmol·L-1正向和反向引物各0.3 μL，滅菌超純水補足剩余體積。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性45 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共50個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。SNP基因分型及數(shù)據(jù)分析參考孫清明等[21]。

表1 供試19對SNP引物的基本信息

1.2.3 遺傳多樣性和遺傳結構分析 利用GenAlEx 6.5軟件計算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、遺傳分化系數(shù)和遺傳距離，并進行分子方差變異分析(AMOVA)。參照文獻[22]劃分群體遺傳分化程度。

采用PowerMarker V3.25軟件計算多態(tài)性信息含量；采用STRUCTURE 2.3.4軟件對供試樣本進行分組和群體遺傳結構分析，根據(jù)ΔK值最大原則確定最佳分組數(shù)；最后，利用MEGA 5.2軟件，基于遺傳距離采用UPGMA法構建系統(tǒng)樹。

1.2.4 核心種質庫的構建與評價 按照供試荔枝品種(品系)的果實成熟期進行分組，參照文獻[18]的方法篩選并構建核心種質庫。運用PowerMarker V3.25 軟件設置取樣比例為10%、15%、20%、25%和30%，根據(jù)模擬退火算法(simulated annealing algorithm)以等位基因最大化(maximizing allelic richness)為標準構建核心種質庫；利用GenAlEx 6.5軟件計算核心品種(品系)、原有品種(品系)和保留品種(品系)的遺傳多樣性參數(shù)，并通過計算遺傳多樣性參數(shù)的保留率〔核心品種(品系)某一指標占原有品種(品系)同一指標的百分率〕以及t檢驗評價核心品種(品系)、保留品種(品系)和原有品種(品系)的遺傳多樣性，同時運用主坐標分析法(PCoA)對構建的核心種質庫進行確認。

2 結果和分析

2.1 SNP引物和荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性分析

2.1.1 SNP引物的遺傳多樣性參數(shù)分析 利用19對SNP引物對供試的221份荔枝樣本進行擴增，各引物的遺傳多樣性參數(shù)見表2。

由表2可見：每對SNP引物的觀測等位基因數(shù)均為2，有效等位基因數(shù)為1.1～2.0，均值為1.5；Shannon’s信息指數(shù)為0.236～0.692，均值為0.482；觀測雜合度為0.081～0.561，均值為0.282；期望雜合度為0.119～0.499，均值為0.314；多態(tài)性信息含量為0.112～0.374，均值為0.256。其中，引物SNP7的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、期望雜合度和多態(tài)性信息含量均最高。

表2 用于221份荔枝樣本SNP分子標記分析的19對引物的遺傳多樣性參數(shù)

2.1.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性分析 基于SNP分子標記分析結果，對不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)進行分析，結果見表3。

由表3可見：供試荔枝品種(品系)群體的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度的均值分別為1.9、1.6、0.487、0.372和0.327。在4個荔枝品種(品系)群體中，荔枝晚熟品種(品系)群體的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀察雜合度和期望雜合度均最小，早熟品種(品系)群體的上述遺傳多樣性指標均最大，表明荔枝早熟品種(品系)群體的遺傳多樣性最高，荔枝晚熟品種(品系)群體的遺傳多樣性最低。

表3 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳分化和遺傳結構

基于SNP分子標記分析結果，對不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的遺傳分化和遺傳結構進行分析，結果分別見表4、表5和圖1。

2.2.1 荔枝品種(品系)群體的遺傳分化 分子方差分析(AMOVA)結果(表4)顯示：供試荔枝品種(品系)樣本個體間的遺傳變異貢獻率為85%，群體間和群體內(nèi)的遺傳變異貢獻率分別為10%和5%，表明供試荔枝品種(品系)群體的遺傳變異主要發(fā)生在個體間，群體間遺傳變異不明顯。

表4 荔枝品種(品系)群體的AMOVA分析結果

由表5可見：中熟品種(品系)群體與早熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度很低，遺傳分化系數(shù)分別為0.046和0.021；早熟品種(品系)群體與特早熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度較低，遺傳分化系數(shù)分別為0.081和0.096；特早熟品種(品系)群體與中熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳分化程度中等，遺傳分化系數(shù)分別為0.166和0.246。晚熟品種(品系)群體與中熟、早熟和特早熟品種(品系)群體間的遺傳距離依次增大，遺傳距離分別為0.014、0.091和0.352；特早熟品種(品系)群體與早熟、中熟和晚熟品種(品系)群體間的遺傳距離也依次增大，遺傳距離分別為0.109、0.240和0.352。表明供試荔枝品種(品系)群體的果實成熟時間相差越大，其遺傳距離越大。

表5 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)1)

總體上看，供試荔枝品種(品系)群體間的遺傳分化系數(shù)和遺傳距離均與果實成熟期相關，果實成熟期相距越遠，遺傳分化系數(shù)和遺傳距離越大。

2.2.2 荔枝品種(品系)群體的遺傳結構 基于SNP分子標記的不同果實成熟期荔枝品種(品系)群體的分組結果(圖1-A)表明：在K=2時，ΔK達到最大值，說明供試荔枝品種(品系)群體在分成2組時遺傳結構最明顯。

遺傳結構分析結果(圖1-B)表明：供試的221份荔枝品種(品系)適合劃分為2組。其中，a組Q值為0.501～0.995，包含181份荔枝品種(品系)，主要為中熟和晚熟品種(品系)，分別為32和145份品種(品系)，另包含4份早熟品種(品系)；b組的Q值為0.550～0.997，包含40份荔枝品種(品系)，包括所有特早熟品種(品系)(6份)、大部分早熟品種(品系)(7份)、少部分中熟品種(品系)(18份)及極少部分晚熟品種(品系)(9份)。

K: 分組數(shù)Cluster number.: a組Group a; : b組Group b.P1: 晚熟品種(品系)Late-maturing cultivar(strain); P2: 中熟品種(品系)Mid-maturing cultivar(strain); P3: 早熟品種(品系)Early-maturing cultivar(strain); P4: 特早熟品種(品系)Extremely early-maturing cultivar(strain).

2.3 荔枝品種(品系)群體的聚類分析

根據(jù)SNP分子標記分析結果、基于遺傳距離對221份荔枝品種(品系)進行UPGMA聚類分析，結果見圖2。

由圖2可見：在遺傳距離0.18處，可將供試荔枝品種(品系)分為3組。特早熟品種(品系)‘荷包荔’(‘Hebaoli’)(編號216)和‘三月紅’(‘Sanyuehong’)(編號219)與絕大多數(shù)品種(品系)的遺傳距離較遠，二者聚為Ⅰ組；另219份品種(品系)可劃分為2組(Ⅱ組和Ⅲ組)。其中，Ⅱ組包含39份品種(品系)，包括4份特早熟品種(品系)、10份晚熟品種(品系)、18份中熟品種(品系)和7份早熟品種(品系)；Ⅲ組包含180份品種(品系)，包括144份晚熟品種(品系)、32份中熟品種(品系)和4份早熟品種(品系)。

將圖2中Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組包含的品種(品系)分別與圖1中基于遺傳結構的分組結果進行比對，結果顯示：Ⅰ組和Ⅱ組包含的41份品種(品系)中，有36份品種(品系)出現(xiàn)在圖1的b組中；Ⅲ組包含的180份品種(品系)中，有177份品種(品系)出現(xiàn)在圖1的a組中。表明聚類分析和遺傳結構分析結果基本一致。

: 晚熟品種(品系)Late-maturing cultivars(strains); : 中熟品種(品系)Mid-maturing cultivars(strains); : 早熟品種(品系)Early-maturing cultivars(strains); : 特早熟品種(品系)Extremely early-maturing cultivars(strains).1-221：品種(品系)編號Nos.of cultivars(strains).

2.4 荔枝核心種質庫的構建和評價

2.4.1 荔枝核心種質庫構建 用PowerMarker V3.25軟件設置不同的取樣比例并構建核心種質庫，其遺傳多樣性參數(shù)見表6。

表6 按照不同取樣比例構建的荔枝核心種質庫的遺傳多樣性參數(shù)1)

結果表明：取樣比例為20%構建的核心品種(品系)群體能最大程度地保留原有品種(品系)群體的遺傳多樣性，其觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度的保留率分別為100%、100%、106%、103%和107%，表明該取樣比例篩選出來的荔枝核心品種(品系)群體能充分體現(xiàn)原有品種(品系)群體的遺傳多樣性，可確作為荔枝核心種質庫。

核心種質庫包含44份品種(品系)(詳見附錄Ⅰ)，其中晚熟品種(品系)有31份，占晚熟品種(品系)總數(shù)的20.1%；主要為來源于海南的品種(品系)(18份)，來源于福建和四川的品種(品系)分別有5和2份，來源于廣東和廣西的品種(品系)均有3份。中熟品種(品系)有8份，占中熟品種(品系)總數(shù)的16.0%；來源于廣東、廣西、福建和四川的品種(品系)各有2、3、1和2份。早熟品種(品系)有2份，分別來源于廣東和福建，占早熟品種(品系)總數(shù)的18.2%；特早熟品種(品系)有3份，分別來源于廣東、福建和四川，占特早熟品種(品系)總數(shù)的50.0%。總體上看，核心種質庫包含的品種(品系)全面涵蓋原有品種(品系)群體的果實成熟期和來源地，說明該核心種質庫較全面地保留了供試荔枝品種(品系)的相關信息。

2.4.2 荔枝核心種質庫評價 將荔枝核心種質庫中包含的核心品種(品系)群體與原有品種(品系)群體和保留品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)進行對比，結果見表7；對荔枝核心品種(品系)群體與原有品種(品系)群體進行主坐標分析(PCoA)，結果見圖3。

表7 荔枝核心品種(品系)群體與其他品種(品系)群體的遺傳多樣性參數(shù)對比

: 核心品種(品系)Core cultivar(strain); : 原有品種(品系)Initial cultivar(strain).

由表7可見：核心品種(品系)群體的Shannon’s信息指數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度均高于原有品種(品系)群體和保留品種(品系)群體，表明核心品種(品系)群體的遺傳多樣性相對較高。t檢驗結果顯示：3個供試群體的遺傳多樣性參數(shù)均無顯著差異，表明核心品種(品系)群體可以代表原有品種(品系)群體，且保留品種(品系)群體可作為核心種質庫的備用資源。

由圖3可見：核心品種(品系)均勻分布在整個供試群體中，且核心品種(品系)還包含特早熟品種(品系)‘荷包荔’和‘三月紅’，表明該荔枝核心種質庫的代表性較強。

3 討論和結論

3.1 荔枝品種(品系)的遺傳多樣性及變異來源

遺傳多樣性研究對植物種質資源的利用、保護和進化具有重要意義。本研究利用19對SNP引物對221份荔枝品種(品系)進行了遺傳多樣性研究，Shannon’s信息指數(shù)為0.236～0.692，觀測雜合度為0.081～0.561，表明供試的荔枝品種(品系)樣本具有較高的遺傳多樣性。荔枝群體遺傳多樣性豐富可能與其品種(品系)間的自然雜交有關。荔枝起源于云南，后沿著西江傳播至海南，并在云南和海南分別馴化為特早熟和晚熟品種(品系)，這2類品種(品系)進一步雜交形成早熟和中熟品種(品系)[23]；荔枝為異花授粉植物，遺傳基礎十分復雜，基因型為雜合型，荔枝品種(品系)間的自然雜交使其品種(品系)間的遺傳物質交流頻繁，引起遺傳變異和遺傳多樣性的增加[24]。

在基于SNP分子標記數(shù)據(jù)構建的UPGMA聚類圖中，供試的221份荔枝樣本可分為3組，Ⅰ組的2份樣本均屬于特早熟品種(品系)，Ⅲ組的絕大多數(shù)樣本屬于晚熟品種(品系)；Ⅱ組中，靠近Ⅰ組的樣本多屬于特早熟或早熟品種(品系)，靠近Ⅲ組的樣本多屬于中熟品種(品系)。在聚類圖上，供試品種(品系)的分布整體呈現(xiàn)兩端分別為特早熟和晚熟品種(品系)、中間為早熟和中熟品種(品系)的特點，基本符合“荔枝先獨立馴化為特早熟和晚熟品種，這2類品種再進一步雜交形成早熟與中熟品種”[23]的研究結論。但在聚類圖中也出現(xiàn)少數(shù)不同果實成熟期的品種(品系)聚在同組的現(xiàn)象，這可能與不同區(qū)域之間的相互引種以及品種(品系)間的自然雜交有關。引種和自然雜交過程均可促進品種(品系)間的基因交流，進而產(chǎn)生具有多種遺傳特性的后代，但若品種(品系)之間具有親緣關系，則無論其果實成熟期是否一致，都有可能聚在一起。

3.2 荔枝品種(品系)的分類標準

目前，多根據(jù)果皮特征將荔枝品種(品系)分為尖突型、隆起型和平坦型3大類型，但這一分類體系并不能準確反映品種(品系)間的親緣關系。隨著分子生物技術的廣泛應用，有研究者發(fā)現(xiàn)依據(jù)分子標記獲得的荔枝樣本的分組結果同時表現(xiàn)出依果實成熟期分組的特點，因而提出將果實成熟期作為荔枝品種資源分類的首要標準[25]。Liu等[26]基于RAPD分子標記技術，將60份荔枝樣本按果實成熟期分為極早熟、早中熟和晚熟至極晚熟3組；基于SSR分子標記技術，傅嘉欣[27]發(fā)現(xiàn)供試47份荔枝樣本可分為3大組，分組結果與果實成熟期具有較好的一致性[25]；Liu等[11]基于SNP技術，將96份荔枝樣本按照果實成熟期聚為特早熟、早熟、中熟和晚熟4組。本研究中，供試221份荔枝品種(品系)的果實成熟期相差明顯，且果實成熟期相差越大的荔枝群體，其遺傳分化系數(shù)和遺傳距離也越大，但在UPGMA聚類圖中供試221份荔枝樣本并未完全按照果實成熟期聚類，其中，Ⅲ組主要為晚熟和中熟品種(品系)并包含少量早熟品種(品系)，而Ⅱ組中4個果實成熟期的品種(品系)均有。造成這一現(xiàn)象的原因可能與供試樣本的數(shù)量有關，供試樣本越多，攜帶的遺傳信息越多，產(chǎn)生遺傳變異的可能性越大，不確定的影響因子也更多。本研究中供試荔枝樣本的期望雜合度(0.314)高于Liu等[11]的研究結果(0.305)，可見研究對象的有效樣本量越大，產(chǎn)生遺傳變異的可能性越大，其期望雜合度越高。

2021年，國家荔枝種質資源圃在茂名建成，收集了國內(nèi)外700多份荔枝種源，今后應以盡可能多的種質資源為供試材料，開展多個分子標記和多個表型性狀的相關性研究，從整體上對荔枝種質的遺傳背景和表型進行綜合分析，以探討將成熟期或其他性狀作為荔枝種質分類新標準的科學性。

3.3 荔枝核心種質庫的構建及其意義

保存大量的種質資源可為荔枝遺傳改良和品種選育提供豐富的遺傳基礎，但荔枝為多年生喬木，樹體高、占地面積大，這給荔枝種質資源的保存帶來了一定的困難。構建荔枝核心種質庫，可在有限的土地上保存更多的種質資源，實現(xiàn)遺傳多樣性保藏目標。

確定合理的取樣比例是核心種質庫構建面臨的首要問題。目前，國內(nèi)外不同植物核心種質庫的取樣比例為5%～30%，沒有統(tǒng)一的標準。李自超等[28]認為，構建核心種質庫時的取樣比例要根據(jù)原有樣本的數(shù)量而定，原有樣本數(shù)量大時核心種質庫的取樣比例可相對較小，反之，取樣比例應相應增大。李冬波等[29]對廣西原產(chǎn)和引種的88份荔枝品種資源進行分析，構建了包含22份品種(品系)的核心種質庫，占原有品種(品系)數(shù)的25%；Sun等[30]分析了不同果實成熟期的96份荔枝樣本，并篩選出22份核心樣本，占原有樣本數(shù)的23%；而本研究在供試的221份荔枝品種(品系)中篩選出44份樣本構建了核心種質庫，占原有品種(品系)數(shù)的20%。由此可見，隨原有種質庫中荔枝品種(品系)數(shù)的逐漸增多，核心種質庫的取樣比例逐漸減小，這在一定程度上佐證了李自超等[28]的研究結論。

經(jīng)PCoA主坐標分析和t檢驗，采用本研究方法構建的荔枝核心種質庫包含的品種(品系)的遺傳多樣性參數(shù)與原有種質庫無顯著差異，且該核心種質庫涵蓋了原有種質庫的所有品種(品系)的果實成熟期和來源地，說明構建的核心種質庫具有很好的代表性，在實際育種工作中可優(yōu)先考慮使用核心種質庫的品種(品系)作為育種材料。當土地資源減少，無法保存所有供試品種(品系)的活植物時，應優(yōu)先保存核心種質庫的品種(品系)，以維持其遺傳多樣性。

目前，早熟品種不優(yōu)質是荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的主要問題之一，選育早熟優(yōu)質荔枝品種(品系)是荔枝重要的育種目標。本研究結果顯示：特早熟品種(品系)‘荷包荔’和‘三月紅’與絕大多數(shù)品種(品系)的遺傳距離較遠，且為核心品種(品系)，在早熟品種(品系)育種工作中可考慮選擇‘荷包荔’和‘三月紅’與優(yōu)質荔枝品種(品系)進行雜交，以選育早熟優(yōu)質荔枝品種(品系)。