郭甜馨，MuhammadMoaaz Ali，顏喜璽，李 雪，簡麗觀，彭金彬，陳歆妍，趙錦河，彭俊賢，陳發(fā)興 *

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.泉州市泉美生物科技有限公司，福建 泉州 362000；3.泉州市洛江區(qū)林業(yè)局技術(shù)推廣站，福建 泉州 362000；4.泉州市洛江區(qū)市政公用事業(yè)管理中心，福建 泉州 362000；5.安溪縣林業(yè)局，福建 泉州 362400；6.泉州市洛江區(qū)自然資源局，福建 泉州 362000）

0 引言

【研究意義】白鶴芋（Spathiphyllum kochiiEngl.& K.Krause）是天南星科(Araceae) 白鶴芋屬(Spathiphyllum) 的多年生草本植物，別名白掌，是從南美地區(qū)引進(jìn)的一種花葉俱美的陰生花卉[1]。自80年代以來，白鶴芋作為觀賞草本植物被大量引進(jìn)中國，并迅速在中國觀葉植物產(chǎn)業(yè)得到推廣[2]。白鶴芋對凈化室內(nèi)甲醛、苯系物等有害物質(zhì)具有積極作用，且作為優(yōu)良室內(nèi)觀葉植物，其佛焰苞最具觀賞價值[3?4]。白鶴芋種質(zhì)資源開發(fā)工作開展至今，已發(fā)現(xiàn)原生種41個，經(jīng)雜交育種、體細(xì)胞無性系變異等育種手段培育出的栽培品種也已上百，其中有60多個申請美國植物專利[5?7]。目前國內(nèi)白鶴芋市場進(jìn)口品種較多，但引進(jìn)時單位間缺乏溝通與協(xié)調(diào)，品種往往出現(xiàn)重復(fù)與交叉，加上組培技術(shù)應(yīng)用于其大規(guī)模生產(chǎn)，導(dǎo)致白鶴芋品種固化、優(yōu)良性狀單一，不利于白鶴芋的商業(yè)化發(fā)展。因此，開發(fā)適宜的技術(shù)對鑒定白鶴芋種質(zhì)資源、分析其遺傳多樣性尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】簡單重復(fù)序列區(qū)間（Intersimple sequence repeat，ISSR）在植物遺傳多樣性分析中應(yīng)用較為普遍，通過人工合成ISSR引物，在SSR 5′或3′端加錨2～4個核苷酸的重復(fù)序列，重復(fù)4～8次，使引物長度達(dá)20 bp左右[8]。ISSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性強(qiáng)、不受環(huán)境限制、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，與SSR相比，因其無需預(yù)知基因組序列，可極大提高操作效率，在遺傳多樣性分析中得到較廣泛的應(yīng)用[9]。目前對于白鶴芋的研究多集中于組培體系的構(gòu)建[10?11]、觀賞價值的開發(fā)及栽培管理技術(shù)的應(yīng)用[1?13]等，在國內(nèi)僅劉小飛等[14?15]采用 SSR 和 SRAP標(biāo)記對部分白鶴芋品種進(jìn)行親緣關(guān)系的鑒定[14?15]?！颈狙芯壳腥朦c】使用ISSR技術(shù)對白鶴芋進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對14份栽培品種和7份雜交品系共21份白鶴芋種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，同時使用NTsys、TBtools軟件進(jìn)行聚類分析、相關(guān)性分析和主成分分析，擬探討白鶴芋種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為其種質(zhì)資源的開發(fā)、利用與保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試白鶴芋 供試的白鶴芋材料共21份，均由泉州泉美生物技術(shù)有限公司提供，具體信息見表1，主要包括栽培種9份、雜交種5份、雜交品系7份，其佛焰苞性狀見圖1。采集時選取新鮮健康的嫩葉2～3片，用冰盒保存并立即帶回實驗室，用超純水清潔后，放入?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 供試白鶴芋的佛焰苞Fig.1 Spathes of the different cultivars of Spathiphyllum

表1 供試白鶴芋信息Table 1 Spathiphyllum information of participants in the trial

1.1.2 試驗試劑與儀器 試驗試劑：DNA緩沖液參考李金璐的研究結(jié)果提前配置[16]；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β-巰基乙醇（上海麥克林生化科技有限公司）；氯仿-異戊醇（北京索萊寶科技有限公司）；2 ×TaqMaster Mix 混合液、ddH2O（北京天根科技有限公司）；瓊脂糖（北京鑒聯(lián)科技有限）；ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia, Set No.9, No.801-900）提供的序列，并由上海生工生物工程有限公司合成。

試驗儀器：Retsch MM400冷凍混合研磨儀（上海弗爾德儀器設(shè)備有限公司），精宏DK-500S水浴鍋（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司），SCILOGEX MX-S渦旋振蕩器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），IMS-50全自動雪花制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司），Eppendorf 5804R冷凍臺式離心機(jī)（上海土森視覺科技有限公司），WIX-EP300基礎(chǔ)電泳儀（北京韋克斯科技有限公司），BIO-RAD PCR儀 T100（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），BIO-RAD Gel Doc XR 凝膠成像儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取及質(zhì)量檢測 按照李金璐等[16]的CTAB法進(jìn)行DNA的提取，并根據(jù)白鶴芋的特性略作改動，其中使用研磨儀替代傳統(tǒng)研缽研磨葉片，可獲得較細(xì)植物粉末，以用于提取高質(zhì)量DNA[17]。

制作1.5%的瓊脂糖凝膠，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，通過與DNA marker相比較以推斷DNA分子質(zhì)量；根據(jù)電泳結(jié)果的條帶表現(xiàn)推斷DNA的純度與濃度，若是一條集中條帶與DNA marker分子質(zhì)量大小相當(dāng)，則表明DNA完整可靠，質(zhì)量較高；若電泳條帶出現(xiàn)脫尾、彌散現(xiàn)象，則表明出現(xiàn)DNA降解。用微量分光光度計檢測DNA濃度與純度，根據(jù)OD值分析純度，以1.8左右為宜。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 采用正交設(shè)計優(yōu)化出適宜的白鶴芋ISSR-PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增程序參考張晨光等[18]的方法并略作改動。PCR反應(yīng)體系總體積20.0 μL， 其 中 含 20 ng·μL-1的 DNA 模 板 2.0 μL，2×TaqMaster Mix 添加量 10.0 uL，引物濃度為 0.8 μmol·L?1，剩余體積由 ddH2O 補(bǔ)充。PCR 反應(yīng)程序為 94 ℃ 變性 5 min，94 ℃ 預(yù)變性 30 s，不同引物最佳退火溫度下退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，循環(huán) 40次，最后 72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃ 保存。

1.2.3 ISSR-PCR 反應(yīng)引物篩選 利用選定的 PCR 反應(yīng)體系與程序，對100條ISSR引物進(jìn)行篩選，以條帶清晰明亮、多態(tài)性較好為選擇標(biāo)準(zhǔn)；并在所選引物Tm±5 ℃的范圍內(nèi)，篩選引物最佳的退火溫度。

1.2.4 ISSR-PCR 產(chǎn)物電泳檢測 制作 1.5% 的瓊脂糖凝膠，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測，設(shè)置100 V電泳40 min；電泳結(jié)束后，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 因ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物下PCR產(chǎn)物電泳遷移率一致的條帶具有同源性[9]。根據(jù)同一位點條帶的有無記錄電泳結(jié)果，有帶的為擴(kuò)增陽性，記為1，無帶的為擴(kuò)增陰性，記為0。將所得數(shù)據(jù)輸入Excel表格，構(gòu)建0-1數(shù)據(jù)矩陣。為反映各ISSR標(biāo)記的多態(tài)性，計算各引物的多態(tài)條帶百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB）。并根據(jù)以下公式，計算ISSR標(biāo)記位點的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）[19]：

式中Pi、Pj分別為群體中第i、j個等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

在此基礎(chǔ)上，利用NTsys 2.10進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算品種間遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）遺傳相似度聚類分析，繪制品種間親緣關(guān)系樹狀圖。并使用TBtools進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組 DNA 質(zhì)量檢測

使用CTAB法提取21份白鶴芋種質(zhì)基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的條帶清晰明亮、完整無污染，經(jīng)微量紫外分光光度計測得其濃度為 400～700 ng·μL?1，OD 值為 1.7～2.0，質(zhì)量完好。

2.2 ISSR 引物篩選

從100個ISSR引物中篩選適合白鶴芋ISSR-PCR反應(yīng)的候選引物。經(jīng)過初篩、次篩，最終篩選出穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性好的9個ISSR引物。并根據(jù)各引物熔解溫度（Tm值）優(yōu)化出適宜的退火溫度，以用于基因組DNA的擴(kuò)增。具體引物信息如表2所示。

表2 篩選出的9條引物信息Table 2 Information of nine selected primers

2.3 ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果分析

9個ISSR引物共擴(kuò)增出133個位點，多態(tài)性位點有120個，多態(tài)位點百分率為90.23%。其中，擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是引物UBC-900，擴(kuò)增位點20個，其中多態(tài)性位點20個，多態(tài)位點比率為100.00%；擴(kuò)增條帶數(shù)最少的是引物UBC-876，擴(kuò)增位點8個，其中多態(tài)性位點7個，多態(tài)位點比率為87.50%。

各引物的多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果如表3所示，引物UBC-895、UBC-899擴(kuò)增電泳圖譜如圖2所示。

圖2 引物UBC895、899對21份白鶴芋種質(zhì)的擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic patterns of 21 Spathiphyllum germplasm samples amplified with primer UBC895 and UBC899

表3 9條引物多態(tài)性信息Table 3 Polymorphism information of 9 primers

2.4 14 個栽培品種的遺傳多樣性分析

2.4.1 聚類分析 聚類分析結(jié)果如圖3所示，供試白鶴芋種質(zhì)中14個栽培品種的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.81，變動幅度為0.23。其中SPAT10與SPAT29的相似系數(shù)最大，為0.81，表明它們的親緣關(guān)系最近；SPAT01與SPAT24間的相似系數(shù)最小，為0.59，表明它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。相似系數(shù)為0.67處按照種質(zhì)來源將14份種質(zhì)分為3組，第Ⅰ組主要包含8種栽培品種：SPAT10、24、29、30、33、34、37、38；第Ⅱ組主要包含5種由栽培種雜交選育的品種：SPAT52、50、51、53、70；第Ⅲ組僅有1種SPAT01，未與其他白鶴芋資源聚在一起，這表明SPAT01與其他品種之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并且在形態(tài)上表現(xiàn)出株型緊湊、整體較矮，可在生產(chǎn)上用于雜交育種以開發(fā)性狀，進(jìn)一步豐富白鶴芋的種質(zhì)資源。第Ⅰ組的8個栽培品種，雖來源廣泛（美國、澳洲、中國等），但品種間遺傳相似系數(shù)變動幅度較窄、親緣關(guān)系較近，符合白鶴芋起源地集中于南美地區(qū)的客觀事實。在遺傳相似系數(shù)0.70處，按照植株株型及肉質(zhì)花序形態(tài)可對第I組、第Ⅱ組進(jìn)一步分組。在第Ⅰ組的栽培品種中，亞組1包含6個品種：SPAT10、29、30、33、34、37，表現(xiàn)中等株型、明顯的肉質(zhì)花序凸起；亞組2包含2個品種SPAT24、38，表現(xiàn)株型偏大、花序凸起較明顯等性狀。在第Ⅱ組利用栽培品種雜交選育出的5個雜交種中，亞組1包含3種：SPAT52、50、51，統(tǒng)一表現(xiàn)出株型緊湊茂密，但肉質(zhì)花序凸起不明顯；亞組2包含SPAT53、70，表現(xiàn)出株型較稀，肉質(zhì)花序凸起明顯、表面光滑。聚類分析結(jié)果表明，從種質(zhì)來源及株型、花序形態(tài)等方面將14份栽培品種有效區(qū)分。

圖3 14個白鶴芋栽培品種ISSR擴(kuò)增條帶的UPGMA聚類結(jié)果Fig.3 UPGMA clustering results of ISSR amplification bands of 14 cultivars of Spathiphyllum

2.4.2 主成分分析 利用 TBtools對 14 個栽培品種的ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析，檢測品種間的相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示。圖4-A表明相關(guān)性結(jié)果與基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析大體一致，其中SPAT10與SPAT29的相關(guān)性最高，為0.62；SPAT01與SPAT24之間的相關(guān)性最低，為0.17。圖4-B顯示所有品種均聚集在F1中，第一主成分的貢獻(xiàn)率43.037%（特征值為6.03），表明第一主成分足以說明14個栽培品種的相關(guān)性。14個栽培品種被分為兩大類，一為聚集在F1上象限的SPAT30、29、24、33、10、37、34，另一為SPAT52、50、38、51、58、70和01聚在同一因子的相反象限。可以看出PCA結(jié)果與聚類分析結(jié)果相同，但較之聚類分析結(jié)果，主成分分析更為直觀地展示出14個栽培品種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可作為聚類分析結(jié)果的印證與補(bǔ)充。

圖4 14個白鶴芋栽培品種ISSR擴(kuò)增條帶的相關(guān)性分析、主成分分析Fig.4 Correlation analysis and principal component analysis results of ISSR amplification bands of 14 cultivars

2.5 7 個雜交品系與親本間親緣關(guān)系分析

以SPAT33為母本、SPAT51為父本，共獲得7個雜交品系，分別記為Z1～Z7。聚類分析結(jié)果如圖5所示，親本與后代共9個個體的遺傳相似系數(shù)為0.60～0.81，變動幅度為0.21。以0.670為閾值，可分為2類，第Ⅰ類為偏母本類（包括SPAT33、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7），第Ⅱ類為偏父本類（包括SPAT51、Z1、Z2）。從外觀形態(tài)上，亦可印證聚類結(jié)果，主要表現(xiàn)為：偏母本類中雜交品系個體之間株型等與母本相近；偏父本類中雜交品系個體 之間肉質(zhì)花序短粗且呈白或綠的顏色，與父本性狀相近。偏母本類可在相似系數(shù)0.6992處又分為2組，一組與母本關(guān)系較近（包含Z3～Z5），另一組表現(xiàn)為與母本關(guān)系稍遠(yuǎn)，這反映了Z6、Z7的佛焰苞發(fā)生明顯變異，尤其是Z7出現(xiàn)一花序兩苞片的現(xiàn)象（圖6）。

圖5 7個雜交品系與親本間ISSR擴(kuò)增條帶的UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA clustering of ISSR amplification bands between 7 hybrid strains and their parents

圖6 Z7 雙苞片變異Fig.6 Z7 double bract variation

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)因其具有穩(wěn)定可靠、操作簡便、多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點在鑒定植物遺傳多樣性的研究中應(yīng)用廣泛。與其他的分子標(biāo)記技術(shù)相比，它結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，比SSR和RAPD能更多地揭示多態(tài)性，提供較多的植物基因組信息[20]。本試驗中，利用篩選的9個擴(kuò)增清晰、多態(tài)性較好ISSR引物分別對14份白鶴芋品種和7個雜交品系進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出133個位點，多態(tài)性位點有120個，多態(tài)位點百分率為90.23%，顯示在白鶴芋的基因組中微衛(wèi)星含量豐富，具有較強(qiáng)的多態(tài)性，也表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是適合白鶴芋品種鑒定的有效途徑。

基于14個栽培品種與7個雜交品系間可比性較低，本試驗分別對栽培品種之間以及雜交品系與其兩親本之間進(jìn)行聚類，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。14份栽培品種兩兩之間的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.81，變動幅度為0.23，從分子層面顯示出白鶴芋起源單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄。在遺傳相似系數(shù)為0.67處按照種質(zhì)來源將14份種質(zhì)分組，第Ⅰ組為栽培品種類，第Ⅱ組為由栽培品種雜交選育的品種類，第Ⅲ組僅有一種SPAT01。在進(jìn)一步對第Ⅰ、Ⅱ組分析時，則依據(jù)各品種的形態(tài)差異進(jìn)行分類，結(jié)果表明從株型、佛焰苞的形態(tài)可有效區(qū)分白鶴芋品種。這也印證了岑彩嫻[21]應(yīng)用層次分析法得出的結(jié)論，即決定白鶴芋品質(zhì)的性狀主要為株型緊湊性、葉片和葉色、佛焰苞形態(tài)，符合白鶴芋作為室內(nèi)觀葉植物的基本特性。2親本與其7個雜交品系共9份種質(zhì)的聚類分析結(jié)果顯示，兩兩之間的遺傳相似系數(shù)為0.60～0.81，變動幅度為0.21。以0.67為閾值，可分為2類，第Ⅰ類為偏母本類，第Ⅱ類為偏父本類，聚類結(jié)果同樣可從外觀表型的差異上加以解釋。總之在聚類分析時，從種質(zhì)來源、形態(tài)學(xué)差異上可以有效地將不同白鶴芋品種區(qū)分開來，符合聚類結(jié)果的分析規(guī)律，也表明不同來源及不同的植物學(xué)表現(xiàn)是白鶴芋品種間的主要差別。

使用TBtools針對14個栽培品種的親緣關(guān)系作相關(guān)性分析和主成分分析，分析所得與聚類結(jié)果相近，但從結(jié)果的呈現(xiàn)方式來看，主成分分析更能直觀地顯示各種質(zhì)之間的關(guān)系，可與聚類分析結(jié)果相互印證與補(bǔ)充。劉小飛等[14]結(jié)合使用聚類分析和主成分分析后發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)聚類分析可以對親緣關(guān)系較近的種質(zhì)進(jìn)行分析，但對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)分析效果不理想，而主坐標(biāo)分析方法可有效解決該問題。在本試驗中也證實了這個觀點，由于研究對象間遺傳相似系數(shù)變動幅度較小，品種間親緣關(guān)系較近，所以主成分分析的作用并不明顯。今后在物種遺傳多樣性分析中，應(yīng)掌握品種間遺傳距離或遺傳相似系數(shù)，判斷品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，在此基礎(chǔ)上再決定是否進(jìn)行主成分分析，提高分析效率。

一直以來，為適應(yīng)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，組培技術(shù)在白鶴芋生產(chǎn)上應(yīng)用較廣，但長期以來觀賞植物白鶴芋品種固化、優(yōu)良性狀單一，不利于白鶴芋的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。探索雜交育種、倍性育種、誘變育種、生物技術(shù)育種等育種方式，以產(chǎn)生優(yōu)良變異，培育新品種，豐富白鶴芋的遺傳多樣性。如劉小飛等[22]誘導(dǎo)無性系變異，經(jīng)多年研究，選育出性狀穩(wěn)定、植株分蘗多、植株小、株型緊湊的銀心梭品種；劉金梅等[23]探索了不同白鶴芋屬植物雜交授粉和結(jié)實特性，建立雜交選育群體，對13個白鶴芋種進(jìn)行組合授粉雜交試驗，得出品種內(nèi)易雜交，而種間雜交困難的結(jié)論，為雜交育種選育優(yōu)良株系提供理論依據(jù)；周輝明等[24]以品種美酒的組培愈傷組織為材料，采用秋水仙素浸泡處理的化學(xué)誘變方法，選育出葉片增厚、葉色加深、莖桿變粗、葉柄變粗、花梗變粗、肉質(zhì)花序變粗的四倍體白鶴芋新品種綠萌。由此可見，科學(xué)的育種手段有利于打破長久商業(yè)化模式下白鶴芋品種固化的危機(jī)局面，有利于豐富白鶴芋的種質(zhì)資源。

在本研究中，將優(yōu)良性狀互補(bǔ)的兩品種SPAT33和SPAT51的雜交品系也納入試驗，目的在于從分子層面鑒定雜交品系的優(yōu)良變異，以輔助選育表型優(yōu)良的新品種。ISSR對雜交品系的聚類中，Z7明顯與其他個體分開，且有較大的性狀變異，這表明分子層面的鑒定足以篩選出白鶴芋雜交中變異較大的個體，同時也證明ISSR分子標(biāo)記具有輔助白鶴芋育種、豐富白鶴芋遺傳多樣性的潛力。

本試驗研究對象主要集中于銷量較高、流通較廣的部分品種，并未大范圍覆蓋白鶴芋物種，因此仍需進(jìn)一步加強(qiáng)收集種質(zhì)、擴(kuò)大研究范圍，以更加科學(xué)地全盤分析鑒定白鶴芋的遺傳多樣性。當(dāng)下缺乏白鶴芋種質(zhì)的統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)，而且引種引苗現(xiàn)象混亂，因此從分子層面對當(dāng)前流通較廣的白鶴芋品種進(jìn)行分類具有重要意義。在掌握品種間的親緣關(guān)系后，科學(xué)地選擇雜交親本，開展雜交試驗，有利于發(fā)掘新的優(yōu)良變異，進(jìn)一步豐富白鶴芋的遺傳多樣性。