孫小紅，王國(guó)夫，夏 何，余曉偉，朱琰麟，吳邵晗，王凌峰

（紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江 紹興 312000）

0 引言

【研究意義】 茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)易受外界環(huán)境的影響，如強(qiáng)光照和高溫干旱天氣制約茶區(qū)的茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前市場(chǎng)上多以春茶為主，夏茶較少。其主要原因是夏秋季節(jié)氣溫較高，光照強(qiáng)度大，茶樹碳代謝增強(qiáng)，氮代謝被抑制，使鮮葉中氨基酸含量減少，茶多酚含量增多，從而使酚氨比值增大，導(dǎo)致夏茶苦澀味重；同時(shí)由于葉綠素合成減少，茶葉顏色干枯，品質(zhì)較差，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益低。因此，探索提升夏季茶葉品質(zhì)研究尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來國(guó)內(nèi)外很多茶園通過種植遮陰樹、設(shè)置遮陰網(wǎng)、茶果間作等措施，對(duì)茶樹生長(zhǎng)、茶園環(huán)境與茶葉品質(zhì)等的影響進(jìn)行了研究[2?4]，取得了一定成果。在夏季進(jìn)行遮陰處理能有效降低茶園光照強(qiáng)度，提高土壤含水量，降低土壤溫度，茶葉生長(zhǎng)良好，從而提高茶葉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益[5]。但是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)大量施用含氮化學(xué)肥料，導(dǎo)致茶園土壤中Ca、Mg等離子以及微量元素相對(duì)缺少，而鋁、氟和多酚類物質(zhì)逐漸富集和累積，使茶園土壤微生物總量和多樣性減少，導(dǎo)致茶園土壤肥力退化和養(yǎng)分失衡，直接制約茶園的可持續(xù)發(fā)展[6?7]。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）在土壤中廣泛存在，能與大部分植物結(jié)成共生體。研究表明，茶樹根際土壤中存在多種AM真菌[8]，豐富的AM真菌種群能夠改善土壤的理化性質(zhì)，促進(jìn)植物吸收利用礦質(zhì)養(yǎng)分和水分，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)環(huán)境耐受力[9]。AM 真菌受耕作方法和施肥方法的影響，在人為影響較少的土壤中能表現(xiàn)出更高的多樣性[10]。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)于夏季茶園遮陰后對(duì)茶園土壤養(yǎng)分、茶園AM真菌以及茶葉品質(zhì)影響研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過研究遮陰條件下土壤養(yǎng)分、AM真菌多樣性以及茶葉品質(zhì)，進(jìn)一步探索茶園夏季遮陰對(duì)茶樹土壤養(yǎng)分、土壤叢枝菌根和茶葉品質(zhì)的變化特征，以期為茶葉生產(chǎn)和茶園土壤的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試茶園

本試驗(yàn)在浙江省紹興市富盛鎮(zhèn)茶園（120°69′E,29°90′N）進(jìn)行。茶樹品種為藪北，樹齡 12～15 a，實(shí)驗(yàn)區(qū)為長(zhǎng)方形地塊，試驗(yàn)設(shè)置遮陰和不遮陰（對(duì)照）2個(gè)處理。采用搭棚遮陰方式，在茶園里搭建棚架，支柱為水泥柱，棚頂離地面1.8 m高。遮陰棚高 1.8 m、寬 5 m、長(zhǎng) 20 m；對(duì)照處理寬 5 m、長(zhǎng) 20 m，均設(shè)置3次重復(fù)。每年5月10日左右開始使用黑色遮陰網(wǎng)（遮光率70%），覆蓋在棚面上，遮陰網(wǎng)在秋季（10月10日左右）去掉。試驗(yàn)于2016年5月開始，連續(xù)處理4年。茶園每年施一次有機(jī)肥，商品有機(jī)肥用量一般為 3 000 kg·hm?2，每年春秋各施復(fù)合肥一次，用量為 1 500 kg·hm?2。

1.2 采樣方法

在遮陰處理第4年即2020年7月20日采集土壤樣品。根據(jù)采樣位點(diǎn)的地形條件，在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)采用5點(diǎn)混合取樣法，以茶樹主莖為中心，在半徑20～30 cm的范圍內(nèi)取土，去掉茶樹根部表面土層，采集 0～20 cm土壤[11]，采集好的樣品分別裝入無菌封口聚乙烯袋，放入冰盒。在超凈工作臺(tái)上撿去土壤中石塊、植物根系等可見雜質(zhì)。然后將每個(gè)樣品分成3份，1份置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?份置于超低溫冰箱用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，1份放室內(nèi)自然陰干后過篩，用于測(cè)定該區(qū)域土壤理化特性。

同時(shí)采摘1芽2葉，按照殺青、理?xiàng)l、干燥的工藝，加工成夏茶，置于冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 茶園土壤養(yǎng)分測(cè)定 采用電位法測(cè)定土壤的pH值；采用灼燒法測(cè)定土壤的有機(jī)質(zhì)；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷；采用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷；采用凱氏定氮法測(cè)定法測(cè)定土壤全氮；采用堿解-擴(kuò)散法測(cè)定土壤水解氮[12]。

1.3.2 土壤 AM 真菌多樣性測(cè)定 土壤 AM 真菌的DNA 提取采用 ZR Fecal DNA MiniPrep? Kit試劑盒（Zymo Research；貨號(hào)：D6010），按照說明書步驟進(jìn)行提取將其用于擴(kuò)增。提取土壤總 DNA 用于nested-PCR，經(jīng)過3次PCR擴(kuò)增，引物見表1[13]。

表1 nested-PCR 引物Table 1 Primers used in nested-PCR

取第 3 次 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過 QIAquick Gel Extraction Kit進(jìn)行純化并進(jìn)行電泳分離，快速銀染后，進(jìn)行DGGE凝膠圖片的拍照。切膠回收采用 QIAEX II Gel Extraction Kit。切膠回收、連接pBlue-T載體（北京艾德萊生物科技有限公司）、轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5α，PCR 篩選后拿去 TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)基因庫(kù)，找出與目的片段相似度高的菌種。

1.3.3 茶葉質(zhì)量測(cè)定方法 葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法，測(cè)定試液在645 nm和663 nm處的吸光度并計(jì)算[14]。茶多酚含量測(cè)定參照 GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》；氨基酸含量測(cè)定參照 GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》，咖啡堿測(cè)定參照GB/T 8312—2013《茶咖啡堿測(cè)定》。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析采用 Excel 2010 和 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素多重比較檢驗(yàn)(α= 0.05)處理間的差異顯著性，使用Quantity One軟件進(jìn)行DGGE條帶數(shù)字分析以計(jì)算樣品中可檢測(cè)到的DGGE條帶數(shù)量。采用biodap軟件公式計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)。具體計(jì)算公式如下：

Hshannon代表香農(nóng)多樣性指數(shù)，Dsimpson代表辛普森多樣性指數(shù)，ni為 DGGE 圖譜中條帶的軌跡定量值，N為所有條帶的軌跡定量值ni之和，Sobs代表DGGE所有檢測(cè)出來的條帶總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶園遮陰對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

如表1所示，遮陰與未遮陰茶園土壤pH分別為4.5和3.9，均小于等于4.5，都有酸化傾向，未遮陰處理的茶園土壤pH值低于遮陰的茶園土壤，但差異不顯著。從表2中可以看出，遮陰后茶園有機(jī)質(zhì)增加17.8 %，反映出夏季遮陰為茶樹提供了較高的土壤肥力環(huán)境。經(jīng)過遮陰處理的茶園土壤平均堿解氮含量、全氮含量、全磷含量和有效磷含量均顯著高于未經(jīng)遮陰處理的茶園土壤，分別增加了為77.86 %、163.6 %、45.45 %、27.80 %。試驗(yàn)表明，茶園夏季遮陰對(duì)增加土壤養(yǎng)分及增加土壤有機(jī)質(zhì)均具有顯著作用。

表2 茶園土壤養(yǎng)分含量Table 2 Contents of nutrients in plantation soil

2.2 茶園遮陰對(duì)土壤AM真菌多樣性的影響

由圖1可知，未遮陰處理的茶園土壤DGGE指紋圖譜的顏色深度以及條帶數(shù)目要明顯高于遮陰處理組，代表該樣品中AM真菌種類較多。各處理土壤AM真菌多樣性指數(shù)如表3所示。其中，未遮陰處理組的土壤環(huán)境中AM真菌多樣性和豐富度均顯著高于遮陰處理組，表明未遮陰處理的茶園土壤環(huán)境中 AM真菌菌群的數(shù)量遠(yuǎn)多于遮陰處理的土壤組。遮陰處理的土壤樣品DGGE優(yōu)勢(shì)條帶與未遮陰處理的土壤樣品中出現(xiàn)的相應(yīng)條帶不在同一水平，同時(shí)顏色深度各異。

表3 茶園土壤AM真菌DGGE條帶香農(nóng)指數(shù)、均勻度及豐度Table 3 Shannon index, richness, and evenness of plantation soils based on DGGE bands

圖1 茶園AM真菌DGGE圖譜Fig.1 DGGE banding patterns of arbuscular mycorrhizal fungi in plantation soils

為了更準(zhǔn)確地了解遮陰對(duì)茶園土壤環(huán)境中AM真菌菌群的影響，將DGGE圖譜中的部分條帶進(jìn)行回收，結(jié)果見表4。茶園土壤DGGE條帶比對(duì)顯示：大部分條帶所代表的菌群屬于未培養(yǎng)的球囊霉屬AM真菌。條帶2-16代表的AM真菌菌群均屬于球囊霉屬（Glomus），條帶14所代表的菌群與球囊霉屬相似性高達(dá)98.29%。其中，條帶3、4和11所代表的菌種歸屬于同一菌種。同時(shí)遮陰和不遮陰處理的土壤樣品檢測(cè)顯示它們之間有共同的條帶，如條帶21和22都不是AM真菌。同時(shí)在遮陰處理組檢測(cè)到了水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）、淡紅叢枝瑚菌（Ramaria rubella）和未培養(yǎng)近微孢蟲菌屬（Uncultured Paramicrosporidium）。水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）是依賴于水環(huán)境的真菌[15]。

表4 茶園土壤AM真菌DGGE 條帶序列對(duì)比Table 4 Sequences of arbuscular mycorrhizal fungi DGGE bands in plantation soil

2.3 夏季遮陰處理對(duì)茶葉生化成分的影響

茶葉中，由于葉綠素含量不一樣，所以茶葉的外觀色澤和湯色都有著不同。茶葉中的葉綠素，其合成的客觀因素是太陽(yáng)光線。采取遮陰的方法，可以阻擋一部分的光線照射，使茶葉較小受到太陽(yáng)光線的作用，可以促使茶葉中葉綠素含量的增加。從表5可知，經(jīng)過遮陰處理的茶葉和不遮陰處理的茶葉中葉綠素a和葉綠素b以及葉綠素總量均有顯著增加。同時(shí)遮陰后茶葉中的氨基酸含量增加顯著，超過不遮陰處理組33.16%，可見夏季短暫遮陰有利于氨基酸的積累。

茶湯的滋味濃度直接影響著茶葉品質(zhì)的優(yōu)次，通常認(rèn)為決定茶湯滋味的主體成分是茶多酚，而這種影響是由于茶多酚和氨基酸的總量及組成比例的關(guān)系所決定的。由表5可知，未經(jīng)過遮陰處理的茶葉中茶多酚類物質(zhì)含量較經(jīng)過遮陰處理的茶葉含量高，對(duì)酚氨比計(jì)算結(jié)果表明遮陰茶園中茶葉酚氨比顯著小于非遮陰茶園模式，說明遮陰茶園的茶葉較對(duì)照處理茶葉味更濃而鮮爽。另外未遮陰茶葉中咖啡堿含量低于經(jīng)過遮陰處理的茶葉。

表5 不同遮陰處理下茶葉主要內(nèi)含物質(zhì)含量Table 5 Effect of shading on chemical composition of tea

3 討論與結(jié)論

土壤有機(jī)質(zhì)是土壤肥力的重要特征，是影響土壤理化、供肥保肥能力和養(yǎng)分有效性等的關(guān)鍵因子[16]。遮陰茶園土壤有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)高于未遮陰的土壤，且遮陰處理后土壤水解氮、全氮、全磷、有效磷等主要礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量均顯著高于未遮陰的土壤。以往研究也發(fā)現(xiàn)遮陰有利于有機(jī)物的積累，同時(shí)土壤有效態(tài)氮、磷、鉀含量增加[17]，與本研究結(jié)果類似。在夏季高溫對(duì)茶園進(jìn)行遮陰處理，不光改善茶園空氣溫濕度，同時(shí)還明顯影響茶園不同土層土壤溫濕度，較低的溫度緩解了土壤有機(jī)質(zhì)的分解和茶樹的呼吸消耗，有利于物質(zhì)的積累[18]。

土壤 pH 值與土壤肥力、微生物活性以及植物生長(zhǎng)等密切相關(guān)。土壤有機(jī)質(zhì)是緩解酸性土壤 pH 主要的影響因子之一[19]，研究表明土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，可以有效緩解土壤酸化趨勢(shì)[20]。

本研究表明，夏季遮陰使土壤pH值升高，這可能與遮陰后土壤有機(jī)質(zhì)含量升高有關(guān)。茶園最佳pH應(yīng)當(dāng)在4.5～5.5 的范圍，土壤酸化易造成土壤肥力下降，重金屬含量增加，從而影響茶樹生長(zhǎng)發(fā)育[21?22]。本試驗(yàn)中茶園遮陰處理時(shí)間為每年最熱的5個(gè)月，在此時(shí)間內(nèi)，遮陰處理使土壤pH上升到4.5，有助于緩解茶園土壤酸化問題。

茶園根際土壤AM真菌是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體。遮陰茶園土壤AM真菌指數(shù)和豐富度都低于未遮陰茶園，這些結(jié)果表明夏季遮陰處理反而降低茶園土壤樣品的AM真菌豐富度及多樣性，說明人為長(zhǎng)期遮陰可能反而影響茶園土壤AM真菌多樣性，目前有關(guān)人為遮陰對(duì)土壤AM真菌多樣性影響研究資料較少。在對(duì)高寒草甸退化指示物種黃帚橐吾的菌根生態(tài)學(xué)研究中以及其他植物群落研究發(fā)現(xiàn)[23]，長(zhǎng)期遮陰降低了根內(nèi)AM真菌的物種豐富度，遮陰可弱化黃帚橐吾與AM真菌的共生關(guān)系，從而影響AM真菌的豐富和好多樣性等。另外研究發(fā)現(xiàn)遮陰情況下接種 AMF可以改變茶樹的生長(zhǎng)環(huán)境并提高茶葉品質(zhì)[24]，但目前尚不清楚單純遮陰對(duì)茶園叢枝菌根多樣性的影響機(jī)制。同時(shí)本試驗(yàn)中出現(xiàn)了水生子囊菌（Distoseptispora aquatica strain）等依賴于水環(huán)境的真菌，可能與遮陰處理后茶園土壤環(huán)境濕度增加有關(guān)，另外也可能與本試驗(yàn)中AMF引物的特異性不強(qiáng)有關(guān)。進(jìn)一步試驗(yàn)需要選擇特有性更強(qiáng)的引物。

綠茶最主要的品質(zhì)要素是色澤和滋味。經(jīng)過遮陰處理的茶葉葉綠素總量顯著增加。由此可見茶園遮陰有利于茶葉中葉綠素的合成，有利于綠茶“三綠”（外形色澤綠、湯色綠、葉底綠）品質(zhì)的形成[6]，提高茶葉的質(zhì)量。形成茶湯鮮爽滋味的主要成分是氨基酸，該成分對(duì)組成綠茶滋味具有重要作用，同時(shí)能緩解綠茶的苦澀味，增強(qiáng)其甜味，對(duì)茶葉天然香氣的形成也起重要作用[25]。茶園中適度的遮陰可以使茶葉中的咖啡堿含量上升，茶多酚含量下降[4]，本研究中存在同樣的變化趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)夏季適度遮陰，可以改變茶園中光、溫、濕等環(huán)境條件，會(huì)使氮代謝加強(qiáng)，有利于茶樹新梢中氨基酸的積累[6]；另一方面使茶樹呼吸代謝和酶系統(tǒng)活性減弱，抑制茶多酚合成，使茶多酚含量下降。由此茶葉中多酚類化合物含量下降，氨基酸總量增加，從而使酚氨比變小，綠茶苦澀味減少，使茶湯鮮爽，并具有較高香氣[26]。本試驗(yàn)中遮陰茶園中茶葉氨基酸含量較對(duì)照高，酚氨比較對(duì)照低，茶葉品質(zhì)比對(duì)照優(yōu)良，與文獻(xiàn)報(bào)道類似[27]。

在長(zhǎng)期發(fā)展中，茶樹形成了喜溫、喜濕、喜陰和喜漫射光的特性。夏暑季節(jié)實(shí)施遮陰，縮短了溫濕度日較差，從而改善茶園環(huán)境條件，避免連續(xù)的高溫干熱天氣對(duì)茶樹造成的熱害和旱害。適度遮陰可以促進(jìn)茶樹生光合作用的進(jìn)行，有利于積累有機(jī)物；通過遮陰，可以增加茶葉中葉綠素和氨基酸的含量，減少茶多酚含量，從而提高茶葉的品質(zhì)。在實(shí)際生產(chǎn)中，遮陰技術(shù)這一農(nóng)藝措施簡(jiǎn)便易行，特別對(duì)夏秋茶園土壤性質(zhì)以及夏茶的品質(zhì)有明顯的改善作用，可以進(jìn)一步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。但茶園土壤AM真菌多樣性有下降趨勢(shì)，有關(guān)遮陰對(duì)茶園AM真菌影響趨勢(shì)值得進(jìn)一步研究。