張朝輝，王 勛，陳天航，梅會元，韓盼盼，

劉天翔1，王振河2，邱立友1 *

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

0 引言

【研究意義】平菇（Pleurotus ostreatus），又稱糙皮側(cè)耳，屬于食藥用真菌[1]，在我國具有較長的栽培歷史，種類繁多[2]，具有營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，目前已成為世界性的食用菌品種[3]。平菇屬于典型的異宗結(jié)合擔(dān)子菌，即單核菌株不能形成子實(shí)體，兩個具有親和作用的異性單核菌絲體結(jié)合后，才具備出菇能力[4]，但單核體與雙核體之間的差異尚不明確?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食用菌的遺傳多樣性分析中。DNA分子標(biāo)記包括限制性片段長度多態(tài)性（Restrction Fragment Lengh Polyorhism，RFLP）標(biāo)記[5]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標(biāo) 記[6]、RAPD標(biāo)記[7]、簡單重復(fù)序列區(qū)間（Inter-simple sequence repeats，ISSR）標(biāo)記[8]等，它是直接在DNA水平上反映遺傳變異的一種技術(shù)。其中RAPD標(biāo)記由于其具有檢測范圍廣[9]、檢測速度快、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的建立等方面[10]，并取得了顯著成效。詹才新等利用RAPD標(biāo)記對金針菇不同親本菌株及其雜交菌株進(jìn)行分析后，得出該技術(shù)可用于鑒別真?zhèn)坞s種的結(jié)論[11]。趙光輝等利用RAPD標(biāo)記對20株草菇進(jìn)行遺傳多樣性的分析，結(jié)果表明所有供試菌株間均存在遺傳差異[12]。RAPD標(biāo)記技術(shù)在食用菌遺傳多樣性分析中發(fā)揮了極大的作用[13]。【本研究切入點(diǎn)】雙核體是一種獨(dú)特的生物，它的菌絲每個隔間包含兩個單倍體核，每個單倍體核來自不同的親本[14]，兩個相容的單核菌絲體交配形成新的雙核菌絲體，僅發(fā)生質(zhì)配而沒有進(jìn)行核配[15]，這種有性繁殖方式與二倍體明顯不同。通過來自糙皮側(cè)耳或香菇（Lentinus edodes）的同一親本的交配親和性擔(dān)孢子自交，已選育出多個優(yōu)良菌種[16?19]，但其機(jī)理還不清楚。目前對于雙核體及其親本單核體之間的差異研究較少，通過比較單核體和雙核體的菌絲生長狀況、出菇產(chǎn)量和遺傳多樣性是研究兩者之間差異的有效方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從平菇TD300的擔(dān)孢子中分離得到MK13和MK3，二者交配得到DK300，通過對單雙核菌株及其親本進(jìn)行菌絲生長狀況和出菇產(chǎn)量的測定，利用RAPD法檢測單雙核菌株的遺傳差異，以期為食用菌自交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

TD300：平菇天達(dá)300，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；單核菌株MK13和MK3：TD300擔(dān)孢子分離獲得。選擇品質(zhì)優(yōu)良、大小合適、約八成熟的TD300子實(shí)體通過鉤懸法收集孢子并制成孢子液，稀釋涂布于PDA平板，25 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落接種至PDA平板培養(yǎng)基中央，繼續(xù)培養(yǎng)。選擇能夠配合為優(yōu)良雙核菌絲的MK13和MK3作為試驗(yàn)的單核菌株；雙核菌株DK300：MK13和MK3交配所得。

1.2 培養(yǎng)基的配制

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水 1000 mL，pH 自然，分裝后高壓滅菌；棉籽殼栽培料培養(yǎng)基：棉籽殼78%，麩皮20%，石灰1%，石膏1%，含水量65%，pH自然，裝袋后高壓滅菌。

1.3 菌絲生長狀況對比

將MK13、MK3、DK300和TD300分別接種在含有等體積PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行活化，3～5 d后，打孔接種到新的平板上培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間從菌落形態(tài)、菌絲顏色、長勢、滿板天數(shù)等方面觀察并記錄4個菌株的菌絲生長狀況。

1.4 出菇情況及產(chǎn)量對比

常規(guī)栽培試驗(yàn)：使用15 cm ×32 cm聚丙烯折角袋，每袋裝0.9 kg栽培料。高壓滅菌2.5 h，每處理數(shù)量為20袋。常規(guī)管理，在此期間分別記錄菌株性狀和出菇產(chǎn)量。

1.5 菌株 RAPD 分析

RAPD標(biāo)記技術(shù)是以基因組DNA為模板，隨機(jī)選擇一個長度通常為10個堿基對的寡聚核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用于檢測DNA序列的多樣性[20]。本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增所用的引物來自上海生工的十堿基隨機(jī)引物，如表1所示。

表1 供試隨機(jī)引物Table 1 Random primers applied

菌絲DNA提?。悍Q取新鮮的平板菌絲0.1～0.2 g，利用CTAB法[21]提取菌株DNA。隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增 ：PCR體系：HSTMMix（購自廣州東盛公司）12.5 μL，隨機(jī)引物（上海生工合成）1 μL，DNA模板 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃，1 min；36 ℃，1 min；72 ℃，2 min；72 ℃，10 min，進(jìn)行 30 Cycles。用 1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長狀況分析

將直徑為6 mm的TD300、DK300、MK13和MK3菌絲塊接種在PDA平板中培養(yǎng)，觀察記錄4個菌株菌絲的生長情況。如表2所示，從菌落形態(tài)來看，TD300與DK300為半氣生型，MK13和MK3為匍匐型。從菌絲長勢來看，TD300的菌絲比其他3個菌株菌絲纖細(xì)稀疏，MK13和MK3的菌絲長勢最好，均表現(xiàn)為粗壯濃密。而從菌絲顏色來看，DK300、MK13和MK3的菌絲均為白色，TD300的菌絲為淺白色。結(jié)果表明，4個菌株菌絲形態(tài)差異明顯。

表2 菌株的菌絲形態(tài)Table 2 Mycelium morphology of tested strains

通過觀察記錄，對4個菌株菌絲在不同培養(yǎng)基中的生長狀況進(jìn)行統(tǒng)計分析。如圖1所示，從菌絲滿板天數(shù)來看，TD300與DK300最快滿板，均為4 d，MK13和MK3長速較慢，其中MK13最慢，長滿整個平板需要近20 d。在栽培試驗(yàn)中，TD300菌絲最先滿袋，MK13最晚滿袋，TD300比MK13提前20 d滿袋，這與4個菌株菌絲在平板中的生長狀況一致。結(jié)果表明，在不同培養(yǎng)料中，TD300和DK300菌絲生長狀況較好，MK13和MK3菌絲生長狀況較差。

圖1 菌株在不同培養(yǎng)基中生長狀況Fig.1 Mycelial growth of strains in different culture media

2.2 出菇情況及產(chǎn)量分析

如表3所示，TD300和DK300均可以出菇，MK13和MK3均不出菇。從子實(shí)體形狀來看，TD300為貝殼狀，DK300為扇葉狀。而從子實(shí)體顏色來看，TD300為深褐色，DK300為淺褐色。結(jié)果表明，TD300與DK300子實(shí)體性狀差異明顯。

表3 菌株出菇情況及子實(shí)體性狀Table 3 Germination and fruiting body properties of mushrooms

如表4所示，從第一茬均產(chǎn)量來看，DK300平均每袋產(chǎn)量高于TD300，每袋高出4.40%，但不具有顯著性差異；從第二茬均產(chǎn)量來看，TD300平均每袋產(chǎn)量比DK300高出21.93%，且具有顯著性差異；而從平均每袋總產(chǎn)量來看，TD300的平均每袋總產(chǎn)量比DK300高出3.26%。

表4 菌株出菇產(chǎn)量Table 4 Yields of mushrooms

2.3 基于 RAPD 標(biāo)記的菌株間親緣關(guān)系分析

對提取的單、雙核菌絲DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示，DNA條帶清晰且明亮，無明顯彌散熒光區(qū)出現(xiàn)，適合用來做RAPD分析。本試驗(yàn)對提取的TD300、DK300、MK13和MK3的菌絲DNA進(jìn)行RAPD分析。

圖2 DNA電泳檢測結(jié)果Fig.2 DNA electrophoresis of 4 mushroom strains

對13條隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，12條引物能擴(kuò)增出清晰且重復(fù)性好并能用于RAPD分析的條帶。如圖3所示，共有86個條帶被擴(kuò)增，其中多態(tài)性片段69條，且特異性較高。如引物S36擴(kuò)增出多態(tài)性片段8條，4個菌株共同條帶2條，在DK300、MK13和MK3這3個菌株中也有兩條共同條帶，其中DK300擁有的條帶均能夠在MK13和MK3中找到，說明DK300與MK13和MK3的親緣關(guān)系最近。引物S62共擴(kuò)增出6條多態(tài)性片段，4個菌株中出現(xiàn)3條共同條帶，在DK300、MK13和MK3中有兩個共同條帶出現(xiàn)。所有條帶中，出現(xiàn)共同條帶17條，說明這四個菌株在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性和一定的遺傳均一性。

圖3 隨機(jī)引物擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 PCR electrophoresis using random primers

2.4 RAPD 結(jié)果聚類分析

為進(jìn)一步研究菌株間的親緣性關(guān)系，根據(jù)RAPD產(chǎn)生的條帶作出“0-1”矩陣圖并利用NTSYS軟件的Jaccard聚類分析法制作聚類圖譜（圖4）。可以看出，在遺傳相似系數(shù)為0.53時，4個菌株分為兩個類群，TD300為一類，MK13、DK300、MK3為一類。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.80時，4個菌株被分為3大類，其中MK13為第一類，DK300和MK3為第二類，TD300為第三類。這表明，DK300、MK13、MK3與TD300之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，MK13和MK3與DK300的親緣關(guān)系較近，其中MK3與DK300的親緣關(guān)系最近。而從遺傳差異性來看，遺傳相似系數(shù)越大說明二者之間的遺傳差異越小，由圖4可知，MK13、MK3和交配所得的DK300與親本TD300間具有較大的遺傳差異性，而MK13、MK3和DK300間遺傳差異性較小，尤其是MK3和DK300遺傳差異性最小。

圖4 RAPD聚類分析Fig.4 RAPD clustering on mushroom strains

3 討論

平菇屬于異宗結(jié)合食用菌，由擔(dān)孢子直接萌發(fā)形成的菌株是不孕的，只有雙核化的菌株才能形成子實(shí)體[4]。根據(jù)這一原理，本試驗(yàn)從TD300的擔(dān)孢子中分離得到MK13和MK3，二者交配得到DK300，通過比較4個菌株的菌絲生長狀況和出菇產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，TD300與其子代DK300的菌絲生長狀況和產(chǎn)量沒有顯著性差異[15]，這一結(jié)果也證實(shí)了由單核菌絲交配產(chǎn)生的子代雙核菌株遺傳了親本的優(yōu)良性狀，對雜交育種提供一定的借鑒。

RAPD技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定菌株的親緣關(guān)系[22]。這是由于PAPD技術(shù)利用隨機(jī)引物對不同物種或個體的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增[7]，而引物與序列結(jié)合位點(diǎn)存在的差異能導(dǎo)致擴(kuò)增的多態(tài)性DNA片段在DNA水平上反映出物種或者個體間的遺傳差異[23]。本試驗(yàn)通過RAPD技術(shù)檢測4個菌株間的遺傳差異性，結(jié)果表明兩個單核菌株MK13、MK3與親本TD300和單核菌株交配所得的雙核菌株DK300間具有遺傳差異性，而單核菌株MK13和MK3與其交配所得的雙核菌株DK300間遺傳差異較小，尤其是MK3與DK300間差異更小。表明經(jīng)過減數(shù)分裂形成擔(dān)孢子時可能發(fā)生有基因重組，而通過兩個單核菌株交配得到雙核菌株過程則較少發(fā)生基因重組。前期同工酶譜結(jié)果與之類似。NADH脫氫酶同工酶譜中雙核菌株DK300和單核菌株MK3有2條NADH脫氫酶同工酶譜帶，而單核菌株MK13有3條NADH脫氫酶同工酶譜帶；NADPH脫氫酶同工酶中雙核菌株DK300、單核菌株MK3只有1條同工酶譜帶，而單核菌株MK13的NADPH脫氫酶同工酶譜帶為4條[24]。

端粒酶發(fā)揮作用能夠維持端粒長度。由于體細(xì)胞中缺乏端粒酶活性，因此端粒長度會隨DNA復(fù)制逐漸縮短。在生殖細(xì)胞中則有端粒酶，能夠進(jìn)行端粒修復(fù)，端粒長度因端粒酶活性的存在保持不變，保護(hù)染色體遺傳物質(zhì)的完整性[25]。擔(dān)子菌食用菌保藏、制種和復(fù)壯時，往往通過菌絲和組織塊的無性繁殖進(jìn)行的，因此，染色體端粒將不斷縮短，進(jìn)而導(dǎo)致菌種活力下降，產(chǎn)量降低。通過有性繁殖形成擔(dān)孢子時，擔(dān)孢子中的染色體可能存在有端粒修復(fù)，由擔(dān)孢子萌發(fā)形成的單核菌絲交配形成的雙核菌絲其染色體端?？赡艿靡孕迯?fù)，菌種活力得到真正的復(fù)壯。這種機(jī)制可能是擔(dān)子菌食用菌自交育種的另一個機(jī)理，但還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究通過RAPD分析和聚類結(jié)果，并結(jié)合同工酶分析，可以快速檢測出4個菌株間的遺傳差異性，得出結(jié)論：MK13、MK3和交配所得的DK300與親本TD300間具有較大的遺傳差異性，而MK13、MK3和DK300間遺傳差異性較小，尤其是MK3和DK300遺傳差異性最小。這一結(jié)果是由于減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生的遺傳變異引起的，可能是擔(dān)子菌食用菌自交育種的重要機(jī)制之一。