姚瑋宸, 徐繼偉, 徐 鹿, 朱秀云, 張亞楠,*

(1. 淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省特色資源植物利用工程實驗室，安徽淮北 235000;2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室， 南京 210014)

通常，環(huán)境中的氣味分子會通過昆蟲嗅覺感器表皮上的小孔進(jìn)入其內(nèi)，并與氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding protein, OBP)/化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)結(jié)合成復(fù)合物，擴(kuò)散到嗅覺感器的淋巴液中，隨后與樹突膜上的氣味受體(odorant receptor, OR)結(jié)合，OR對氣味分子進(jìn)行識別和編碼，這使得神經(jīng)元細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，導(dǎo)致產(chǎn)生動作電位，然后投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)昆蟲相關(guān)的行為反應(yīng)。當(dāng)傳遞完成后，有氣味降解酶(odorant-degrading enzyme, ODE)降解掉多余的氣味分子，從而恢復(fù)嗅覺神經(jīng)元的敏感性，以接受新的信號刺激(Leal, 2013; 杜立嘯等, 2016)。CSP是一類分子量小、水溶性大，能夠結(jié)合運輸脂溶性信息化合物的可溶性蛋白(Wanneretal., 2004)，廣泛分布于昆蟲各種嗅覺感受器，感受傳導(dǎo)外界化學(xué)因子刺激。CSP通常編碼110～115個氨基酸，比OBP編碼的長度要短。CSP編碼氨基酸序列中有4個保守的半胱氨酸(cysteine, Cys)，這4個Cys形成兩個不互相連鎖的二硫橋。在進(jìn)化上，CSP比OBP更加保守，不同昆蟲的CSP的同源性在40%～60%之間(Wanneretal., 2004)。CSP不僅在觸角中表達(dá)，同時也在昆蟲身體的其他部位表達(dá)，如在喙、足、下唇須及性腺中表達(dá)(劉孝賀等, 2020)。與CSP分布廣泛相對應(yīng)的是其具有功能多樣性，已得到證實的功能為：(1)結(jié)合并且運輸脂溶性的氣味分子(Pelosietal., 2018)；(2)結(jié)合并運輸性信息素氣味分子(Zhangetal., 2014)；(3)調(diào)節(jié)昆蟲生長發(fā)育，免疫作用(Gongetal., 2012)；(4)參與化學(xué)農(nóng)藥的抗性形成(Inghametal., 2020)。

目前對梨木虱的研究主要停留在表觀生理生態(tài)水平及對若蟲分泌物的研究，有關(guān)其取食的嗅覺分子機制研究匱乏。本課題組前期成功構(gòu)建了梨木虱頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并從中鑒定到11個CSP基因，其中CchiCSP8在若蟲頭部的表達(dá)顯著高于成蟲頭部的(Xuetal., 2019)。本研究克隆了CchiCSP8全長開放ORF序列，并對其序列和進(jìn)化特征進(jìn)行了分析，隨后借助大腸桿菌Escherichiacoli進(jìn)行原核表達(dá)和純化，采用熒光競爭結(jié)合實驗分析了體外重組CchiCSP8蛋白與41種梨樹揮發(fā)物的結(jié)合特征，并使用同源建模和分子對接預(yù)測了CchiCSP8與氣味分子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。研究CchiCSP8與梨樹揮發(fā)物的結(jié)合特性，可為明晰梨木虱在定位梨樹過程中的嗅覺機制提供理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)基于擾亂嗅覺行為的新型梨木虱行為調(diào)控技術(shù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

梨木虱采集于安徽省宿州市碭山縣(34°27′42.62″N, 116°31′40.72″E)梨園，若蟲飼養(yǎng)于一次性無菌透明飯盒中。飼養(yǎng)條件為溫度26±1℃，相對濕度40%～60%，光周期14L∶10D。用新鮮采摘且未接觸殺蟲劑的碭山酥梨PyrusbretschneideriRehd. cv. Dangshansuli葉片進(jìn)行飼喂。在體式顯微鏡下用無菌手術(shù)刀切取若蟲頭部后迅速放到液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將收集后的100頭梨木虱若蟲頭部于液氮中速凍并迅速研磨，按照MiniBEST Universal RNA Extraction(TaKaRa，日本)提供的說明書提取總RNA，用超微量分光光度計(MD2000D，Biofuture，英國)測定RNA的濃度及質(zhì)量，再采用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因的克隆和序列分析

根據(jù)本課題組前期所獲得的序列信息(Xuetal., 2019)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計CchiCSP8的特異性擴(kuò)增引物，并在引物前端加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(下劃線表示)，上游引物：5′-GGATCCGCATCAGTTACACCCAAACCAA-3′；下游引物：5′-CTCGAGCTAGTTTCCTGTAAACTGTTGAATGA TTT-3′。 使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa，日本)進(jìn)行PCR。擴(kuò)增程序: 98℃ 2 min; 98℃ 10 s, 59℃ 10 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán)；72℃ 2 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，按照普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen，美國)說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。利用在線網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測CchiCSP8的分子量和等電點，利用SignalP 4.1軟件(https:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測CchiCSP8的信號肽序列。利用ClustalX 2.0(Larkinetal., 2007)將CchiCSP8與其他昆蟲的CSP進(jìn)行多序列比對，通過MEGA11(Tamuraetal., 2021)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 體外重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將純化回收的PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt3克隆載體(全式金，北京)上，重組克隆質(zhì)粒測序[通用生物(安徽)股份有限公司，滁州]成功后，使用FastDigest?限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ(Fermentas，上海)對pEASY-Blunt3-CchiCSP8和表達(dá)載體pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切。 將目的片段和載體分別進(jìn)行膠回收后，用T4 DNA連接酶(莫納，武漢)連接目的片段和表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金，上海)中，送公司測序。測序正確的質(zhì)粒pET30a(+)-CchiCSP8要求公司返還。將返還的正確質(zhì)粒pET30a(+)-CchiCSP8轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL 21(DE3)(鼎國，南京)，挑取單克隆，將陽性菌落接種到1 mL的具有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃ 250 r/min的振蕩箱中培育至OD600=0.6～0.8，吸取500 μL的菌液于無菌離心管中，另一半等比例加甘油保存于-80℃。往離心管中加入終濃度為100 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，37℃孵育5 h，用SDS-PAGE檢測。蛋白膠的相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶后，將保留的原始菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)，7 000 r/min離心10 min收集菌體。隨后進(jìn)行超聲破碎，設(shè)置超聲3 s，間歇3 s，破碎10 min。使用組氨酸標(biāo)簽蛋白鎳磁珠純化技術(shù)Beaver BeadsTMHis-tag Protein Purification Kit(金斯瑞，南京)對融合蛋白進(jìn)行純化，用尿素梯度遞減的透析方式復(fù)性蛋白，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的蛋白的熒光競爭結(jié)合實驗分析

選擇N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)為結(jié)合實驗的探針，共測定了重組蛋白CchiCSP8與41種梨樹揮發(fā)物(Luetal., 2012; Najar-Rodriguezetal., 2013)的結(jié)合特性。以色譜級甲醇為溶劑將1-NPN和梨樹揮發(fā)物配制成1 mmol/L的工作液。設(shè)定激發(fā)光波長Ex=337 nm，掃描發(fā)射光波長范圍Em=400～500 nm。在反應(yīng)總體積為250 μL Tris-HCl緩沖液中加入2 μmol/L重組蛋白CchiCSP8，隨后在反應(yīng)液里依次加入終濃度為0～20 μmol/L 1-NPN。將配制好的梨樹揮發(fā)物工作液依次加入CchiCSP8蛋白與1-NPN的混合體系中，使終濃度由2 μmol/L遞增至40 μmol/L。所有揮發(fā)物純度>95%。

利用GraphPad Prism 7.0用最大發(fā)射峰處的熒光強度對配基濃度作圖，根據(jù)公式Ki=[IC50]/(l+[1-NPN]/Kl-NPN)計算出目的蛋白CchiCSP8與配體的結(jié)合常數(shù)Ki。[IC50]為CchiCSP8/1-NPN復(fù)合物的熒光強度下降到50%的配體濃度。[1-NPN]為未結(jié)合時1-NPN的濃度。Kl-NPN是利用Scatchard方程計算的目的蛋白與1-NPN的解離常數(shù)。

1.6 同源建模與分子對接

建模和分子對接方法參考本課題組前期已有研究(Zhangetal., 2020a, 2020b)。描述如下：將CchiCSP8的氨基酸序列提交到NCBI BLASTp服務(wù)器(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源比對，并在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org)中搜索合適的建模模板。選擇甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae化學(xué)感受蛋白 MbraCSP2(PDB ID: 1K19)作為CchiCSP8同源建模的合適模板，采用MODELER v.9.25(http:∥salilab.org/modeller/)進(jìn)行同源建模。利用AutoDock Vina v.1.1.2(Trottetal., 2010)研究CchiCSP8與配體結(jié)合模式。選取熒光競爭結(jié)合實驗中與CchiCSP8有結(jié)合力的18種梨樹揮發(fā)物開展分子對接分析。利用ChemDraw 20.0繪制配體的二維結(jié)構(gòu)，然后通過Chem3D 20.0軟件將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)。選擇AutoDock Vina的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行對接分析，并根據(jù)Vina對接評分，對排名最高的構(gòu)象使用PyMOL v.1.9.0(http:∥www.pymol.org/)進(jìn)行可視化分析。

采用新辦法摸清農(nóng)村家底。創(chuàng)新運用“天地網(wǎng)”同查法，全面排查農(nóng)村“三資”，把“糊涂賬”弄清楚，把“家底子”搞明白?！疤臁敝笇恋炔块T航拍圖和確權(quán)地塊定位圖進(jìn)行分析，初步計算出村集體資源總面積；“地”指對照村集體資源分類分布區(qū)域圖，到村組實地測繪、勘查核查；“網(wǎng)”指對新測繪數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總繪圖，實行一村一圖、一組一表、集中公示的“網(wǎng)格化”管理，做到賬實、賬款、賬證、賬賬、賬表“五相符”，各類自然資源信息面積、四至、現(xiàn)狀、管理人“四清晰”。通過“天地網(wǎng)”同查，全縣共核查出被占用和閑置的村級集體土地3萬畝，為集體增收創(chuàng)造了條件。

1.7 數(shù)據(jù)分析

CchiCSP8和不同配體的結(jié)合力數(shù)據(jù)由1/Ki的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS17.0軟件(美國)按照單因素方差分析(ANOVA)中的最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行平均值的比較分析。

2 結(jié)果

2.1 CchiCSP8的克隆及序列特征

CchiCSP8的開放閱讀框全長426 bp，編碼141個氨基酸，N端有一個包含21個氨基酸的信號肽。成熟的CchiCSP8蛋白的預(yù)測分子量和等電點分別為15.02 kD和9.77；將CchiCSP8與同目昆蟲(柑橘木虱Diaphorinacitri、煙粉虱Bemisiatabaci、豆莢草盲蝽Lygushesperus和綠盲蝽Apolyguslucorum)CSP的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CchiCSP8具有4個保守的半胱氨酸位點(圖1: A)；進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示CchiCSP8與柑橘木虱DcitCSP11的進(jìn)化關(guān)系最近(圖1: B)。

圖1 CchiCSP8與其他半翅目昆蟲CSPs的氨基酸序列比對(A)及其基于氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(B)Fig. 1 Amino acid sequence alignment between CchiCSP8 and CPSs from other hemipteran insects (A)and their phylogenetic tree based on amino acid sequence (B)A圖中堆疊的整體高度表示該位置的序列保守性，堆疊內(nèi)符號的高度表示每個氨基酸在該位置的相對頻率。紅點表示保守的半胱氨酸。In Fig. A, the overall height of the stack indicates the sequence conservation at that position, and the height of the symbols within the stack suggests the relative frequency of each amino acid at that position. Red dots indicate the conserved cysteines. CSPs來源物種Origin species of CSPs: Llin: 美國牧草盲蝽Lygus lineolaris; Aluc: 綠盲蝽Apolygus lucorum; Lhes: 豆莢草盲蝽Lygus hesperus; Dcit: 柑橘木虱Diaphorina citri; Btab: 煙粉虱Bemisia tabaci; Cchi: 梨木虱Cacopsylla chinensis.

2.2 CchiCSP8重組蛋白的表達(dá)和純化

將含有pET-30a(+)-CchiCSP8質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌落接種培養(yǎng)后，用終濃度為1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳顯示，在21 kD左右出現(xiàn)了蛋白條帶，這與預(yù)測含有His標(biāo)簽的重組蛋白分子量大小一致，且CchiCSP8重組蛋白主要在包涵體中表達(dá)，因此對包涵體復(fù)性處理后用鎳磁珠純化得到單一條帶的目的蛋白，并經(jīng)電泳證實符合CchiCSP8蛋白的分子量大小(圖2)。

圖2 CchiCSP8重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant CchiCSP8M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; -: 未誘導(dǎo)的pET30a-CchiCSP8大腸桿菌菌體Non-induced pET30a-CchiCSP8 in Escherichia coli; +: 經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-CchiCSP8蛋白Expressed protein pET30a-CchiCSP8 after induction by IPTG; P1: 經(jīng)過鎳磁珠純化獲得的CchiCSP8蛋白Purified protein CchiCSP8 through nickel magnetic bead; P2: 再次純化獲得的CchiCSP8蛋白Repurified protein CchiCSP8.

2.3 CchiCSP8與梨樹揮發(fā)物的結(jié)合特性

在337 nm激發(fā)光下，純化后的CchiCSP8蛋白與熒光探針1-NPN的熒光值隨著1-NPN濃度的增加逐漸達(dá)到飽和，具有良好的親和力，因此1-NPN可用于測定CchiCSP8與不同配體的結(jié)合特性。利用Scatchard方程可計算出CchiCSP8與1-NPN的解離常數(shù)(Ki)為15.58±3.45 μmol/L(圖3: A)。

為探究CchiCSP8與梨樹揮發(fā)物的識別對應(yīng)特征，本研究選擇41種梨樹揮發(fā)物作為配體，采用熒光競爭性結(jié)合實驗分析CchiCSP8的結(jié)合特性。結(jié)果顯示，CchiCSP8對18種梨樹植物揮發(fā)物具有不同程度的結(jié)合能力(Ki=4～30 μmol/L)，包括4種烯烴(1-庚烯、1-壬烯、莰烯和檜烯)(Ki=25～29 μmol/L，6種醇(3-甲基-2-丁烯-1-醇、順-3-己烯醇、正己醇、正庚醇、正辛醇和1-十一醇)(Ki=17～28 μmol/L)，4種醛(己醛、苯甲醛、庚醛和壬醛)(Ki=16～22 μmol/L)，1種酮(苯乙酮)(Ki=16.11±2.13 μmol/L)，1種酯(水楊酸甲酯)(Ki=14.77±0.96 μmol/L)，2種芳香類化合物[苯甲腈(Ki=15.47±4.07 μmol/L)和萘(Ki=19.02±0.29 μmol/L)](圖3: B-E; 表1)。

表1 重組蛋白CchiCSP8與不同梨樹揮發(fā)物(配體)的結(jié)合特性Table 1 Binding properties of the recombinant CchiCSP8 with different pear tree volatiles (ligands)

圖3 重組蛋白CchiCSP8與配體結(jié)合實驗Fig. 3 Ligand-binding assay for the recombinant CchiCSP8A: CchiCSP8和1-NPN的結(jié)合曲線以及Scatchard方程Binding curve and Scatchard plots of CchiCSP8 and 1-NPN; B: CchiCSP8與4種烯烴類揮發(fā)物的結(jié)合曲線Binding curves of CchiCSP8 to four alkene volatiles; C: CchiCSP8與6種醇類揮發(fā)物的結(jié)合曲線Binding curves of CchiCSP8 to six alcohol volatiles; D: CchiCSP8與4種醛類揮發(fā)物的結(jié)合曲線Binding curves of CchiCSP8 to four aldehyde volatiles; E: CchiCSP8與4種揮發(fā)物的結(jié)合曲線Binding curves of CchiCSP8 to four volatiles; F: CchiCSP8對不同配體的結(jié)合力(以1/Ki表示)的比較 Comparison of the binding affinities (indicated by 1/Ki) of CchiCSP8 with different ligands. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤； 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, LSD檢驗)； 圖4同。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, LSD test). The same for Fig. 4. 結(jié)合曲線上的誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。Error bars on binding curves represent standard errors.

進(jìn)一步分析顯示CchiCSP8與酮類、酯類、芳香類物質(zhì)的結(jié)合能力高于與烯烴類、醇類和醛類物質(zhì)的結(jié)合能力(圖4: A)。 在分類相同的配體中，CchiCSP8與配體的結(jié)合力表現(xiàn)出了隨碳原子數(shù)不同而變化的特點。在烯烴組(7-10C)中，CchiCSP8對1-壬烯(9C)的結(jié)合力最高(圖4: B)；在醇類(5-11C)中，對正庚醇(7C)的結(jié)合力最高(圖4: C)；在醛類(6-9C)中，對己醛(6C)的結(jié)合力最高(圖4: D)。

圖4 重組蛋白CchiCSP8結(jié)合力與配體的關(guān)系Fig. 4 Relationship between the binding affinities of the recombinant CchiCSP8 and ligandsA: CchiCSP8對不同類別配體的結(jié)合力(以1/Ki表示)的比較Comparison of the binding affinities (indicated by 1/Ki) of CchiCSP8 with different types of ligands; B: CchiCSP8與烯烴類結(jié)合力與碳原子數(shù)之間的關(guān)系Relationship between the binding affinities of CchiCSP8 with alkenes and the number of carbon atoms; C: CchiCSP8與醇類結(jié)合力與碳原子數(shù)之間的關(guān)系Relationship between the binding affinities of CchiCSP8 with alcohols and the number of carbon atoms; D: CchiCSP8與醛類結(jié)合力與碳原子數(shù)之間的關(guān)系Relationship between the binding affinities of CchiCSP8 with aldehydes and the number of carbon atoms.

2.4 CchiCSP8同源建模與分子對接

鑒定CchiCSP8與不同配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基是分析CchiCSP8與配體結(jié)合機制的重要步驟。根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，選擇甘藍(lán)夜蛾的化學(xué)感受蛋白MbraCSP2(PDB ID：1K19)作為模板，對CchiCSP8蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模。如圖5所示，CchiCSP8同MbraCSP2相似，均有6個α螺旋結(jié)構(gòu)(α1-α6)，這符合昆蟲CSP的結(jié)構(gòu)特征(Pelosietal., 2018)。這些表明，CchiCSP8和MbraCSP2的配體結(jié)合機制可能是相似的，構(gòu)建的CchiCSP8的三維結(jié)構(gòu)是可靠的，可以用于后續(xù)的分子對接分析。

圖5 CchiCSP8的三維模型Fig. 5 Three-dimensional (3D) structure of CchiCSP8A: 甘藍(lán)夜蛾MbraCSP2(PDB：1K19)的三維結(jié)構(gòu)模型作為模板Three-dimensional structure of MbraCSP2(PDB：1K19) of Mamestra brassicae used as a template; B: CchiCSP8的三維結(jié)構(gòu)模型Three-dimensional structure of CchiCSP8.

隨后計算CchiCSP8和每個配體之間的結(jié)合能(表2)，結(jié)果顯示，所有配體的結(jié)合能相差不大(-4.2～6.0 kJ/mol)， 且所有潛在的交互氨基酸殘基的距離均小于4 ?(圖6)，表明CchiCSP8和18種不同配體之間結(jié)合能力存在差異，這與上述熒光競爭結(jié)合實驗的結(jié)果一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)在CchiCSP8與不同配體結(jié)合過程中，存在多個共有氨基酸殘基(表2)，5個非極性殘基：丙氨酸Ala38(A38, 對應(yīng)13個配體)，丙氨酸Ala42(A42, 對應(yīng)13個配體)，亮氨酸Leu93(L93, 對應(yīng)17個配體)，亮氨酸Leu99(L99, 對應(yīng)14個配體)，纈氨酸Val100(V100, 對應(yīng)16個配體)；2個極性殘基：谷氨酰胺Gln107(Q107，對應(yīng)9個配體)，賴氨酸Lys46(K46, 對應(yīng)17個配體)。

續(xù)表1 Table 1 continued

表2 重組蛋白CchiCSP8與不同配體對接過程中的關(guān)鍵氨基酸殘基Table 2 Key amino acid residues of the recombinant CchiCSP8 during the docking to different ligands

圖6 重組蛋白CchiCSP8與不同配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基Fig. 6 Key amino acid residues of the recombinant CchiCSP8 interacting with different ligandsA-D: 烯烴Alkenes; E: 酮Ketone; F: 酯Ester; G-L: 醇Alcohols; M-P: 醛Aldehydes; Q-R: 芳香類Aromatics.

3 討論

同其他昆蟲一樣，梨木虱搜尋并取食梨樹枝葉會借助其精細(xì)發(fā)達(dá)的嗅覺感受系統(tǒng)，這其中主要依賴于嗅覺蛋白和梨樹揮發(fā)物的識別互作，而CSP則是確保梨木虱這一行為準(zhǔn)確發(fā)生的重要保障。本研究在前期基礎(chǔ)上，克隆了CchiCSP8的全長ORF序列，其編碼的氨基酸具有信號肽序列，4個保守的半胱氨酸，表明CchiCSP8具有昆蟲CSP的典型特征(Wanneretal., 2004)。結(jié)合進(jìn)化樹分析的結(jié)果也再次證實CchiCSP8屬于昆蟲CSP家族，在梨木虱定位梨樹過程中可能存在重要作用。隨后，我們借助大腸桿菌原核表達(dá)、包涵體復(fù)性、鎳磁珠純化等技術(shù)得到了高純的CchiCSP8蛋白，與熒光探針1-NPN的結(jié)合檢測也表明CchiCSP8蛋白具有與天然蛋白一致的活性，因此可以用于分析其與不同梨樹揮發(fā)物結(jié)合特征的熒光競爭結(jié)合檢測。

植食性昆蟲在尋找寄主植物、產(chǎn)卵地點、合適配偶和躲避天敵等過程中，必須應(yīng)對復(fù)雜的外界氣味環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，喀木虱屬Cacypsylla侵染梨樹后能夠誘導(dǎo)梨樹釋放揮發(fā)性化合物水楊酸甲酯，這一物質(zhì)能夠引誘歐原花蝽Anthocorisnemorum(Drukkeretal., 1995; Scutareanuetal., 2003)；對于處于交配時期的梨小食心蟲Cydiamolesta雌蛾，順-3-己烯基乙酸酯、順-3-己烯醇和苯甲醛按照4∶1∶1人工合成的混合物與寄主揮發(fā)的混合物具有相似的引誘效果(Nataleetal., 2003)；壬醛和苯甲醛對蘋果蠹蛾Cydiapomonella的幼蟲有驅(qū)避作用(Vallat and Dorn, 2005)；微量揮發(fā)的苯甲腈能夠吸引處于交配期的梨小食心蟲雌蛾(Pieroetal., 2008)；梨樹揮發(fā)物1-己醇、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛和萘對梨小食心蟲具有一定的引誘作用(Luetal., 2012; Najar-Rodriguezetal., 2013)。這些發(fā)現(xiàn)表明植物揮發(fā)物能夠影響植食性昆蟲定位寄主的行為，包括引誘、驅(qū)避作用等(Meiners, 2016)。

本研究選取了41種梨樹揮發(fā)物進(jìn)行熒光競爭結(jié)合實驗分析，CchiCSP8與其中的18種配體物質(zhì)表現(xiàn)出不同的結(jié)合能力，表明CchiCSP8在梨木虱識別梨樹揮發(fā)物的過程中應(yīng)當(dāng)具有重要的作用。18種具結(jié)合力的物質(zhì)中，醇類和芳香類物質(zhì)均占所測定同類物質(zhì)的66.67%，其次是醛類57.14%，酮類33.33%，烴類30.76%，而酯類占比最少為16.67%，表明CchiCSP8更趨向于結(jié)合醇和芳香類物質(zhì)，而對酯類結(jié)合能力較弱，因此配體物質(zhì)的官能團(tuán)特征能夠?qū)chiCSP8的結(jié)合力產(chǎn)生影響。相似的研究在其他昆蟲的嗅覺蛋白研究中也有報道，如：苜蓿盲蝽AdelphocorislineolatusAlinCSP1-3對酸類不結(jié)合，可與其他類型官能團(tuán)的物質(zhì)結(jié)合(Guetal., 2012)；銅綠麗金龜AnomalacorpulentaAcorOBP11只與酮、酯、烯、酸類結(jié)合，而不與醇和酚類物質(zhì)結(jié)合(秦健輝等, 2021)；白背飛虱SfurCSP5只與酮和萜烯類結(jié)合，而不與醇、醛、酯類物質(zhì)結(jié)合(Chenetal., 2018)。此外，已有研究表明，配體物質(zhì)的碳數(shù)能夠影響物質(zhì)與嗅覺蛋白的結(jié)合能力，如豌豆蚜AcyrthosiphonpisumApisOBP9對16個碳的醇和醛類物質(zhì)具有高結(jié)合力(D′Onofrioetal., 2012)，亦有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲嗅覺蛋白的結(jié)合能力與碳的數(shù)目之間不存在對應(yīng)的線性關(guān)系(Lietal., 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)CchiCSP8與配體的結(jié)合力表現(xiàn)出了隨碳原子數(shù)不同而變化的特點，在同類物質(zhì)中特別對1-壬烯(9C)、1-庚醇(7C)、己醛(6C)的結(jié)合力最高(圖4)，但未表現(xiàn)出明顯的與碳原子數(shù)相關(guān)的線性關(guān)系，說明配體物質(zhì)的官能團(tuán)是影響CchiCSP8結(jié)合能力的關(guān)鍵因素，同時也表明CchiCSP8在梨木虱體內(nèi)具有選擇識別不同梨樹揮發(fā)物的能力，可能會與梨木虱其他CSP協(xié)同作用以幫助梨木虱準(zhǔn)確區(qū)分不同的氣味物質(zhì)，確保做出及時正確的行為反應(yīng)。

為更好闡釋CchiCSP8與上述18個配體物質(zhì)的結(jié)合特性，本研究借助同源建模和分子對接的方法分別分析了CchiCSP8與不同配體相互作用時的結(jié)合自由能和關(guān)鍵氨基酸類別，結(jié)果顯示，所有結(jié)合自由能均為負(fù)值，這與已報道的斜紋夜蛾(Liuetal., 2012)、蘋果蠹蛾(Tianetal., 2016)、桃小食心蟲Carposinasasakii(劉孝賀等, 2021)、二點委夜蛾Athetislepigone(Zhangetal., 2020a, 2020b)、白背飛虱(Chenetal., 2018)等其他昆蟲嗅覺蛋白類似，表明CchiCSP8與18個配體之間均存在較強的相互作用力。已有很多研究證實昆蟲OBP或CSP常通過其疏水性結(jié)合腔內(nèi)的極性或非極性氨基酸殘基與不同配體物質(zhì)進(jìn)行相互作用(Fuetal., 2018; Heetal., 2019; Liuetal., 2019; Wenetal., 2019; Yangetal., 2019; Zhang XQetal., 2020; Zhang CNetal., 2021)?；贑chiCSP8與所有18個配體物質(zhì)的結(jié)合特性分析，我們也發(fā)現(xiàn)CchiCSP8中也有一些重要的極性或非極性氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)參與了其與配體物質(zhì)的結(jié)合過程，這表明CchiCSP8與配體的結(jié)合機制與其他昆蟲OBP或CSP的(Tianetal., 2016; Chenetal., 2018; Zhangetal., 2020b; 劉孝賀等, 2021)相似。值得注意的是，CchiCSP8中的一些氨基酸殘基，如非極性氨基酸丙氨酸A38、丙氨酸A42、亮氨酸L93、亮氨酸L99和纈氨酸V100以及極性殘基谷氨酰胺Q107和賴氨酸K46均可以結(jié)合多個不同的配體物質(zhì)，表明這些殘基應(yīng)當(dāng)在CchiCSP8識別配體過程中發(fā)揮重要的作用。因此，本課題組計劃今后將這些殘基作為研究重點，綜合借助CRISPR/Cas9基因編輯(Zhuetal., 2016, 2019)和定點突變(Zhangetal., 2019, 2020b)等技術(shù)深入解析關(guān)鍵殘基突變后對CchiCSP8配體結(jié)合能力的影響情況。

綜上，CchiCSP8能結(jié)合18種梨樹揮發(fā)物，表明該蛋白可能參與梨木虱對梨樹揮發(fā)物的識別過程。分子對接發(fā)現(xiàn)有7個氨基酸殘基可能是CchiCSP8與配體物質(zhì)相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。研究結(jié)果可為明晰梨木虱在定位梨樹過程中的嗅覺機制提供理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)基于擾亂嗅覺行為的新型梨木虱行為調(diào)控技術(shù)提供新思路。