張翡峰，錢 柯, 2#，馬莉莎, 2，趙 悅, 2，施經(jīng)斌, 2，許淑君, 2，熊 陽, 2*

·藥劑與工藝·

人參皂苷Rg3和大黃酸納米乳的制備及其聯(lián)合aPD-L1治療三陰性乳腺癌的藥效學研究

張翡峰1，錢 柯1, 2#，馬莉莎1, 2，趙 悅1, 2，施經(jīng)斌1, 2，許淑君1, 2，熊 陽1, 2*

1. 浙江中醫(yī)藥大學藥學院，杭州 浙江 311402 2. 浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，杭州 浙江 310053

根據(jù)中醫(yī)治療腫瘤時提倡的“扶正祛邪”治則，選用中藥人參和大黃的主要成分人參皂苷Rg3（ginsenoside Rg3，G-Rg3）和大黃酸（rhein，Rhe）進行組合，制備G-Rg3/Rhe納米乳（G-Rg3/Rhe NE），同時提高G-Rg3和Rhe溶解度以利于注射給藥，并利用該納米乳聯(lián)合程序性死亡受體配體1單抗（anti-programmed cell death ligand 1，aPD-L1）治療三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。采用紫外分光光度法分別測定G-Rg3和Rhe在不同輔料中的溶解能力，篩選出合適的乳化劑、助乳化劑和油相。利用偽三元相圖考察乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比（m值）對納米乳體系的影響，根據(jù)形成納米乳區(qū)域面積大小選擇適宜的m值，優(yōu)選G-Rg3/Rhe NE的處方，并對其進行表征和穩(wěn)定性評價。選用4T1Fluc原位乳腺腫瘤小鼠模型，評價G-Rg3/Rhe NE聯(lián)合aPD-L1抗TNBC的效果。G-Rg3/Rhe NE的優(yōu)化組分比為聚氧乙烯氫化蓖麻油EL35-聚乙二醇400-辛癸酸甘油酯-水，其質(zhì)量比為1.33∶2.67∶2.80∶12.50，m值為1∶2，G-Rg3/Rhe NE的平均粒徑為（84.8±1.1）nm，多分散性系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.21±0.02，ζ電位為（?11.30±0.43）mV。載藥納米乳中G-Rg3、Rhe的包封率分別為96.51%、97.47%，兩藥共載的載藥量為0.75%。G-Rg3/Rhe NE聯(lián)合aPD-L1，能顯著抑制荷4T1Fluc小鼠的腫瘤生長。G-Rg3/Rhe NE粒徑均一、穩(wěn)定性好，可聯(lián)合aPD-L1增強其抗TNBC的效果。

人參皂苷Rg3；大黃酸；納米乳；三陰性乳腺癌；aPD-L1

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤[1]，其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一個亞型，其特點是用于治療“靶點”的雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均為陰性表達，占所有乳腺癌病理類型的10%～20%[2]，具有侵襲性強、易復發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等特點[3]。目前常采用的化療手段存在耐藥性和毒副作用問題[4]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)使用程序性死亡受體配體1單抗（anti-programmed cell death ligand 1，aPD-L1）能提高腫瘤微環(huán)境中的細胞毒性T細胞活性，恢復免疫細胞功能來消除癌細胞的免疫療法，應(yīng)用于多種類型癌癥的治療[5]，如非小細胞肺癌[6]、腎細胞癌[7]。而在2018年，Atezolizumab也被批準用于治療PD-L1表達的TNBC患者[8]。然而，單獨使用aPD-L1對超80%的TNBC患者治療無效[9]。因此人們開始探索aPD-L1的聯(lián)合療法，如2019年，PD-L1單抗阿替利珠獲FDA批準與紫杉醇聯(lián)用治療晚期或轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者[10]。中藥治療調(diào)控免疫抗乳腺癌由來已久，早前便提出治療時需將扶正固本放在首位，強調(diào)從整體層面調(diào)節(jié)機體的免疫功能，這和腫瘤免疫治療的觀念非常吻合[11]。同時傳統(tǒng)中醫(yī)認為實體瘤的發(fā)生是人體正氣不足，痰瘀互結(jié)形成的有形腫塊，病理因素為毒、痰、濕、瘀互結(jié)為“瘤”，屬于正虛邪實，治法宜扶正祛邪[12-14]，這也與現(xiàn)代醫(yī)學對腫瘤免疫的認識非常類似。此外，中藥抗腫瘤具有多方位、多靶點、多效性、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[15]。因此，將傳統(tǒng)中藥聯(lián)合aPD-L1進行腫瘤免疫治療有望取得較好的效果。

本實驗根據(jù)中醫(yī)治療腫瘤時提倡的“扶正祛邪”治則，選用中藥人參和大黃的主要有效成分人參皂苷Rg3（ginsenoside Rg3，G-Rg3）和大黃酸（rhein，Rhe）進行組合。人參和大黃為藥中四維[16]，兩者常配伍扶正祛邪治療腫瘤[17-18]。如徐靈胎所云“如大黃與人參同用。大黃必然逐去堅積，決不反傷正氣，人參自然充盈正氣，決不反補邪氣”[19]。這與腫瘤正虛邪實、需要扶正祛邪治法非常吻合，兩者配伍有攻補兼施之妙[20]。因此，將G-Rg3/Rhe配伍或可聯(lián)合aPD-L1增強抗TNBC的效果。但是，G- Rg3和Rhe溶解性差，生物利用度低，不利于注射給藥[21-22]。而納米載體技術(shù)被認為是提高難溶性藥物的溶解度和生物利用度最有前途的方法之一[23]。目前，已有多種納米載體系統(tǒng)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域得到開發(fā)，包括基于聚合物的納米粒和膠束，基于脂質(zhì)成分的脂質(zhì)體、納米乳等[24-25]。納米乳（nanoemulsion，NE）能極大提高難溶性藥物在水中的溶解性及穩(wěn)定性[26]，由于其粒徑小、黏度低、使藥物在其中有較好的分散性，有利于機體迅速吸收，從而提高其生物利用度[27-28]。本研究擬將G-Rg3和Rhe共載制備成G-Rg3/Rhe納米乳（G-Rg3/Rhe NE），解決溶解性差等不利于注射給藥的問題，并對其聯(lián)合aPD-L1的體內(nèi)抗腫瘤藥效進行初步評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外可見分光光度儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；馬爾文Zetasizer Nano激光粒度儀，英國Malvern公司；MSE125P-100-DU型分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；VORTEX3渦旋混勻器，德國IKA集團；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海江星儀器有限公司；TS-200型脫色搖床數(shù)顯，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；CS601型超級恒溫水浴槽，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JY88-II型液晶超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技有限公司；D3024型臺式高速微量離心機，北京創(chuàng)譽科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

G-Rg3，質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號ZL20201216YY，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；Rhe，質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號20200319，中國食品藥品檢定研究院；InVivoMab anti-mouse PD-L1（B7-H1），美國Bio X Cell公司；油酸山梨坦，上海泰坦科技股份有限公司；聚山梨酯80，聚氧乙烯氫化蓖麻油EL35（polyoxyethylene hydrogenated castor oil EL35，PHCO EL35）、聚乙二醇400，源葉生物科技有限公司；大豆油，阿拉丁試劑有限公司；油酸乙酯、辛癸酸甘油酯，廣東翁江化學試劑有限公司；肉豆蔻酸異丙酯，上海麥克林生化科技有限公司；正丁醇、無水乙醇、1,2-丙二醇，上海滬試化工有限公司；75%乙醇、PBS、胰蛋白酶，杭州諾森德生物技術(shù)有限公司；高氯酸、冰乙酸，浙江漢諾化工科技有限公司；香草醛、氫氧化鈉，杭州蕭山化學試劑廠。試劑均為分析純。

1.3 供試瘤株與實驗動物

鼠源乳腺癌4T1細胞，由浙江中醫(yī)藥大學高建莉老師饋贈，4T1Fluc細胞由慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染所得。6～8周齡健康雌性SPF級BALC/C小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。所有小鼠實驗期間全程飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心SPF級環(huán)境中，在25 ℃和50%～60%濕度下，每12小時進行光照/黑暗交替，并允許自由獲取水和食物。實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2018-0012。所有動物實驗遵循浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 G-Rg3/Rhe NE含量測定方法的建立

2.1.1 溶液的配制

（1）5%香草醛冰乙酸溶液：精密稱取5.0 g香草醛，加適量冰乙酸使其溶解，置于100 mL量瓶中，繼續(xù)滴加冰乙酸定容至刻度，搖勻，即得。

（2）0.5%氫氧化鈉溶液：精密稱取0.50 g氫氧化鈉固體，加適量水使其溶解，置于100 mL量瓶中，繼續(xù)滴加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取G-Rg3對照品10.20 mg，加適量75%乙醇溶解，置于10 mL量瓶中，繼續(xù)滴加75%乙醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.02 mg/mL的G-Rg3對照品溶液。精密稱取Rhe對照品10.40 mg，加適量0.5%氫氧化鈉溶液溶解，置于10 mL量瓶中，繼續(xù)滴加0.5%氫氧化鈉溶液定容至刻度，搖勻，即得1.04 mg/mL的Rhe對照品溶液。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取G-Rg3對照品儲備液0.10 mL于試管中，水浴蒸干。然后，依次加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，混勻，于60 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出，迅速冰浴10 min，再加入冰乙酸定容至10 mL。將其在200～800 nm進行全波長掃描，選取吸收峰較大的波長。同時將各種輔料按上述方法分別配制成相應(yīng)的溶液在200～800 nm進行全波長掃描，觀察在選定波長下有無吸收，確定測定G-Rg3的最佳波長為550 nm。精密吸取Rhe對照品儲備液0.10 mL，將其在200～800 nm進行全波長掃描，選取吸收峰較大的波長。同時將各種輔料用0.5%氫氧化鈉溶液分別配制成相應(yīng)的溶液，在200～800 nm進行全波長掃描，確定測定Rhe的最佳波長為241 nm。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL的G-Rg3對照品儲備液，置于10 mL量瓶中，水浴蒸干后精確加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，混勻，于60 ℃水浴鍋上加熱15 min，取出，迅速冰浴10 min，加入冰乙酸定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別20.40、30.60、40.80、51.00、61.20、71.40 μg/mL的G-Rg3對照品溶液。以空白為參比，分別在550 nm波長處測定吸光度（）值。精密吸取0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL的Rhe對照品儲備液，置于10 mL量瓶中，加入0.5%氫氧化鈉溶液定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為10.40、12.48、14.56、16.64、18.72、20.80 μg/mL的Rhe對照品溶液。以空白為參比，分別在241 nm波長處測定值。以值為縱坐標，標準溶液質(zhì)量濃度（）為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。結(jié)果G-Rg3的標準曲線方程為＝0.012 1＋0.033 4，2＝0.999 3，結(jié)果表明G-Rg3在20.40～71.40 μg/mL線性關(guān)系良好。Rhe的標準曲線方程為＝0.030 6－0.004 9，2＝0.999 4，結(jié)果表明Rhe在10.40～20.80 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取適量的G-Rg3、Rhe對照品儲備液，按“2.1.4”項下方法分別制得20 μg/mL的對照品溶液，于550、241 nm波長處測定值，重復6次。結(jié)果G-Rg3值的RSD值為0.48%，Rhe值的RSD值為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取適量的G-Rg3、Rhe對照品儲備液，各1份，按“2.1.4”項下方法分別制得40、14 μg/mL的對照品溶液。分別于室溫下放置0、5、10、15、20、25 min時測定值。結(jié)果G-Rg3值的RSD值為1.25%，Rhe值的RSD值為0.66%，表明G-Rg3對照品溶液、Rhe對照品溶液在25 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密吸取適量的G-Rg3、Rhe對照品儲備液，按“2.1.4”項下方法分別制得40、14 μg/mL的對照品溶液，各6份，分別于550、241 nm波長處測定值。結(jié)果G-Rg3值的RSD值為0.41%，Rhe值的RSD值為0.63%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 稱取3.0 mg已測定含量的G-Rg3，共6份，分別精密加入G-Rg3對照品儲備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入75%乙醇溶解并稀釋至刻度。按“2.1.4”項下方法顯色后于550 nm波長處測定值。稱取1.0 mg已知含量的Rhe，共6份，分別精密加入Rhe對照品儲備液0.4 mL，置于100 mL量瓶中，加入0.5%氫氧化鈉溶液定容至刻度，于241 nm波長處測定值。結(jié)果G-Rg3的平均加樣回收率為98.89%，RSD值為0.71%，Rhe的平均加樣回收率為97.87%，RSD值為0.94%，表明該方法具有較好的加樣回收率。

2.2 G-Rg3/Rhe NE處方的確定及制備

2.2.1 輔料的選擇 親水親油平衡（hydrophile- lipophile balance，HLB）是選擇乳化劑和助乳化劑的一個重要依據(jù)。G-Rg3、Rhe溶解性差的問題可通過制備成O/W納米乳而改善，HLB值介于8～18可用于制備O/W納米乳，故選擇油酸山梨坦、聚山梨酯80、PHCO EL35作為侯選乳化劑，選擇正丁醇、乙醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇400作為候選助乳化劑。油相[29]是脂溶性和難溶性藥物的主要載體，一般選擇成分較純、性質(zhì)穩(wěn)定、黏度低的油類，故選擇藥用納米乳中常用的大豆油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、辛癸酸甘油酯作為候選油相。

2.2.2 G-Rg3和Rhe在各輔料中溶解能力的考察 量取各輔料2 mL置于具塞錐形瓶中，加入過飽和的G-Rg3或Rhe，渦旋5 min，超聲20 min，置于（37.0±0.5）℃恒溫水浴24 h后，4000 r/min離心10 min，精密吸取適量上清液，按照紫外分光光度法測定并計算G-Rg3或Rhe在不同輔料中的溶解度（表1）。結(jié)合G-Rg3和Rhe兩者的溶解度情況，在各乳化劑中的溶解度為PHCO EL35＞油酸山梨坦＞聚山梨酯80，在各助乳化劑中的溶解度為聚乙二醇400＞1,2-丙二醇＞乙醇＞正丁醇，在各油相中的溶解度為辛癸酸甘油酯＞大豆油＞肉豆蔻酸異丙酯＞油酸乙酯。因此，選擇乳化劑PHCO EL35、助乳化劑聚乙二醇400、油相辛癸酸甘油酯這3種輔料作為G-Rg3/Rhe NE的處方組成。

表1 G-Rg3和Rhe在不同輔料中的溶解度

Table 1 Solubility of G-Rg3 and Rhe in different excipients

輔料類別輔料名稱G-Rg3/(μg?mL?1)Rhe/(μg?mL?1) 乳化劑油酸山梨坦747.06±0.13193.66±0.11 聚山梨酯80502.12±0.22157.21±0.27 PHCO EL35773.85±0.051 580.83±0.40 助乳化劑正丁醇326.46±0.0723.23±0.15 乙醇403.65±0.3133.14±0.21 1,2-丙二醇695.40±0.5794.50±0.34 聚乙二醇4001 806.61±0.323 318.88±0.51 油相大豆油768.11±0.09322.18±0.13 油酸乙酯442.80±0.24133.92±0.11 肉豆蔻酸異丙酯509.78±0.17107.48±0.05 辛癸酸甘油酯1 367.06±0.32207.61±0.02

2.2.3 乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比（m值）對納米乳體系形成的影響 采用滴加水相法繪制偽三元相圖。室溫條件下，首先將m值分別為1∶1、1∶2、1∶4的乳化劑與助乳化劑混勻得到混合乳化劑（S），再將油相和混合乳化劑分別按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合得到油相混合物。然后在所得的油相混合物中緩慢滴加水相，滴加的同時不斷地攪拌，當體系變成透明并帶有淡藍色乳光的溶液時，認定納米乳液形成，記錄臨界加入水量，繪制偽三元相圖。偽三元相圖中，其中1條邊代表乳化劑與助乳化劑組成的混合乳化劑（S），另外2條邊分別代表油相（O）和水相（W），根據(jù)臨界點各成分的質(zhì)量分數(shù)，用Origin 9.1繪制偽三元相圖，確定納米乳區(qū)界限，以形成的納米乳區(qū)域面積最大的體系確定最佳m值。結(jié)果顯示，當m＝1∶2時，所形成的納米乳區(qū)域最大（圖1）。因此，確定G-Rg3/Rhe NE的最佳處方組成為m值為1∶2的PHCO EL35-聚乙二醇400-辛癸酸甘油酯-水，其質(zhì)量比為1.33∶2.67∶2.80∶12.50。

圖1 Km值對PHCO EL35-聚乙二醇400-辛癸酸甘油酯-水納米乳體系的影響

2.2.4 G-Rg3/Rhe NE的制備 精密稱取1.33 g PHCO EL35、2.67 g聚乙二醇400、2.80 g辛癸酸甘油酯于50 mL燒杯中，在37 ℃下用磁力攪拌器以200 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10 min使其充分混勻，之后少量多次地投入0.026 g G-Rg3、0.027 g Rhe，繼續(xù)攪拌10 min并超聲助溶30 min，最后緩慢滴加12.50 g水于混合體系中，混合均勻，即得G-Rg3/Rhe NE。

2.3 G-Rg3/Rhe NE理化性質(zhì)的考察

2.3.1 粒徑與電位考察 取G-Rg3/Rhe NE適量，稀釋100倍后使用馬爾文激光粒度儀測定G-Rg3/ Rhe NE的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及ζ電位。根據(jù)優(yōu)化處方制備的空白納米乳澄清透明，略帶淡藍色乳光，具有一定的流動性（圖2-a）。G-Rg3/Rhe NE的外觀呈淡黃色、可見乳光，流動性良好（圖2-b），平均粒徑和PDI為（84.8±1.1）nm和0.21±0.02（圖3），ζ電位為（?11.30±0.43）mV（圖4）。

2.3.2 穩(wěn)定性考察

（1）離心試驗：將G-Rg3/Rhe NE以4000 r/min離心20 min后，納米乳未出現(xiàn)分層、渾濁、藥物沉淀等現(xiàn)象。

圖2 空白納米乳(a)與載藥納米乳(b)的外觀圖

圖3 G-Rg3/Rhe NE的粒徑分布

圖4 G-Rg3/Rhe NE的ζ電位

（2）溫度試驗：將G-Rg3/Rhe NE放置于高溫（40、60 ℃）、低溫（4 ℃）下，于3、7 d取樣觀察，仍為黃色澄清均一體系，納米乳未出現(xiàn)分層、渾濁、藥物沉淀等現(xiàn)象。表明該納米乳具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.3 包封率和載藥量 取適量稀釋后的G-Rg3/ Rhe NE，按照紫外分光光度法測定G-Rg3和Rhe的含量，計算包封率和載藥量。計算得出G-Rg3、Rhe的包封率分別為96.51%、97.47%，兩藥共載的載藥量為0.75%。

包封率＝包封/總

載藥量＝包封/(包封＋載體)

包封為納米乳中藥物質(zhì)量，總為投入藥物總量，載體為除水的納米乳空白載體質(zhì)量

2.4 G-Rg3/Rhe NE的體內(nèi)抗腫瘤藥效學研究

2.4.1 荷4T1Fluc小鼠模型的建立 將約8周齡的BALB/C小鼠在動物房飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)環(huán)境后進行造模實驗。首先選擇處于對數(shù)生長期的4T1Fluc細胞，經(jīng)除去舊培養(yǎng)基、PBS清洗、胰蛋白酶消化、離心、棄去上清等一系列步驟后，立即加入PBS制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)約為5×106個/mL。用無菌注射器快速吸取0.1 mL，注射于小鼠右前肢外側(cè)皮下的第2對乳房下，當腫瘤體積長至約60 mm3時，開始給藥。

2.4.2 動物分組及給藥 將20只荷瘤小鼠隨機分為4組，分別為PBS（10 mg/kg）組、aPD-L1（100 μg/只）組、G-Rg3/Rhe NE（10 mg/kg）組、G-Rg3/Rhe NE＋aPD-L1組，每組5只。其中PBS組和G-Rg3/Rhe NE組每天1次，連續(xù)給藥12 d；aPD-L1組每2天1次，連續(xù)給藥4次；G-Rg3/Rhe NE＋aPD-L1組2種藥物的給藥方式與各自單一給藥時相同，并于G-Rg3/Rhe NE給藥第1天同時開始給予aPD-L1。均采用ip給藥，停藥1周后處死小鼠。

2.4.3 腫瘤體積變化及抑瘤效果 給藥期間，用游標卡尺測量荷瘤小鼠腫瘤的最長徑（）與最短徑（），自給藥日起每2天1次連續(xù)測定直至處死。按公式＝2/2記錄腫瘤體積變化，繪制腫瘤生長曲線（圖5）。試驗結(jié)束時，剝離各試驗組荷瘤小鼠的腫瘤，拍照留存（圖6）。結(jié)果顯示，PBS組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨著治療時間的延長而不斷增長，aPD-L1組同PBS組腫瘤大小較為接近，均沒有表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用。而G-Rg3/Rhe NE組和G-Rg3/Rhe NE＋aPD-L1組的荷瘤小鼠腫瘤體積隨時間延長得到明顯抑制并同PBS組和aPD-L1組具有顯著差異。結(jié)果表明，經(jīng)G-Rg3/Rhe NE治療后，能抑制荷瘤小鼠腫瘤增長，而聯(lián)合aPD-L1能取得更加顯著的治療效果。

與PBS組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與aPD-L1組比較：#P＜0.05；與G-Rg3/Rhe NE組比較：&P＜0.05

圖6 荷4T1Fluc瘤株的BALB/C小鼠腫瘤剝離圖

3 討論

G-Rg3、Rhe及其制劑的常用的含量檢測方法主要有HPLC法、熒光分析法、紫外分光光度法等。其中，HPLC法的優(yōu)點是靈敏度高、檢測限低、精確度高，但該方法操作繁瑣，不適于快速分析和現(xiàn)場檢測。而紫外分光光度法所用儀器較普遍，操作快速簡便，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，結(jié)果準確。

納米乳因其粒徑較小且均勻而優(yōu)于普通乳劑，同時相比其他劑型如膏劑、凝膠劑等，納米乳的給藥途徑多樣，尤其適用于注射給藥。納米乳的黏度遠低于普通液滴，可緩解傳統(tǒng)的注射給藥因注射液黏度大易導致人體注射部位疼痛的問題，因此，具有良好的順應(yīng)性[30]。

在納米乳液的開發(fā)中，處方組成篩選是制備納米乳的關(guān)鍵，其實質(zhì)是確定油相、乳化劑和助乳化劑的種類及三者的最佳配比。若處方組成及比例不當，則不能形成納米乳或形成納米乳的區(qū)域太小，不能達到增溶藥物的目的。因此，本實驗采用紫外分光光度法建立含量分析方法學，測定G-Rg3、Rhe在不同輔料中的溶解情況來確定處方組成。最終選擇辛癸酸甘油酯作為油相，PHCO EL35為乳化劑和聚乙二醇400作助乳化劑。辛癸酸甘油酯是一種中碳鏈脂肪酸甘油酯，可與各種溶劑互溶，它的溶解性和穩(wěn)定性都優(yōu)于普通油脂[31]。PHCO EL35是一種非離子型表面活性劑，HLB值為15～18，常作為 增溶劑，該乳化劑的加入可以有效降低分散體系的界面張力，并形成界面膜，從而提高乳化液的穩(wěn)定性[32]。此外，有研究表明具有中等碳鏈長度和較高HLB值的油類在納米乳液的生產(chǎn)中更可取[33-34]。但非離子型表面活性劑在溫度升高時，由于水分子會逐漸脫離醚鍵而使水溶性降低，因此，助乳化劑的加入能使納米乳更加穩(wěn)定。其中醇類是常用的助乳化劑，與乳化劑在適宜的比例下，可在油水界面形成油-水混合膜，破壞油水界面中水相的有序排列，提高混合膜的柔韌性[35]，能明顯減小O/W型納米乳的粒徑，增大其溶解度。m值的確定對納米乳體系的形成也是至關(guān)重要的。在不同的m值條件下納米乳的粒徑、載藥量方面也會表現(xiàn)出較大的差異，進而影響藥效的發(fā)揮[36]。本研究采用偽三元相圖法對G-Rg3/Rhe NE的處方成分配比進行優(yōu)化，該方法操作簡便，結(jié)果直觀可靠。

TNBC是復發(fā)轉(zhuǎn)移性強、侵襲性高、預(yù)后差的難治性腫瘤，以aPD-L1為代表的腫瘤免疫療法單用響應(yīng)率極低。G-Rg3/Rhe NE的體內(nèi)抗腫瘤藥效學研究也證明了這一點。且這種單方面拮抗性治療的觀念缺乏整體性，可能導致免疫不平衡引發(fā)新的副作用，具有一定的局限性[37]。目前aPD-L1常聯(lián)合化療應(yīng)用于TNBC但毒副作用較大，而中藥調(diào)控免疫抗TNBC將扶正固本放在首位，強調(diào)從整體層面調(diào)節(jié)機體的免疫功能。目前G-Rg3在腫瘤免疫以及與aPD-L1聯(lián)合抗腫瘤的研究很多，其可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞凋亡，還可抑制腫瘤血管生成，影響腫瘤信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因的表達等[38-40]。此外，G-Rg3能抑制核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）表達[41]，調(diào)控γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ），介導磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白（phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/mammalian rapamycin protein，PI3K/Akt/mTOR）信號通路[42]，降低化療耐藥誘導的PD-L1表達，恢復T細胞對癌細胞的細胞毒作用[41]。而Rhe能抑制腫瘤細胞增殖、遷移、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、增強低氧環(huán)境中效應(yīng)T細胞的抗腫瘤活性等多種途徑實現(xiàn)抗腫瘤[43]。Shen等[44]將Rhe與阿特珠單抗聯(lián)合治療乳腺癌后發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤生長得到抑制，Rhe可增強阿特珠單抗對乳腺癌的治療作用。此外，Rhe可通過誘導活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的產(chǎn)生和激活c-Jun氨基末端激酶（C-Jun amino terminal kinase，JNK）/Jun/Caspase-3這一信號通路促使細胞凋亡[45]，還可以下調(diào)缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的表達，改善腫瘤免疫微環(huán)境[46]。本研究中G-Rg3/Rhe NE的體內(nèi)抗腫瘤藥效學也表明經(jīng)G-Rg3/Rhe NE治療后，能抑制荷瘤小鼠腫瘤增長，而聯(lián)合aPD-L1的抑瘤效果更佳。

綜上，本實驗基于中醫(yī)整體觀及扶正祛邪治法，選擇G-Rg3、Rhe配伍開展了聯(lián)合aPD-L1治療TNBC的研究，制備了包載G-Rg3和Rhe可iv的納米乳，為改善G-Rg3和Rhe溶解度以便于臨床注射給藥提供了實驗基礎(chǔ)。并結(jié)合動物實驗通過初步藥效學研究證實了G-Rg3/Rhe NE聯(lián)合aPD-L1可顯著抑制荷瘤小鼠乳腺腫瘤增長，為該制劑在腫瘤免疫治療的應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

志謝：浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院醫(yī)學科研中心公共平臺提供的技術(shù)協(xié)助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I,. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]., 2018, 68(6): 394-424.

[2] Lusho S, Durando X, Bidet Y,. PERCEPTION trial protocol: Comparison of predictive and prognostic capacities of neutrophil, lymphocyte, and platelet counts and tumor-infiltrating lymphocytes in triple negative breast cancer [J]., 2020, 99(50): e23418.

[3] An G, Lu F, Huang S,. Effects of miR-93 on epithelial-to-mesenchymal transition and vasculogenic mimicry in triple-negative breast cancer cells [J]., 2021, 23(1): 30.

[4] Nedeljkovi? M, Damjanovi? A. Mechanisms of chemotherapy resistance in triple-negative breast cancer-how we can rise to the challenge [J]., 2019, 8(9): 957.

[5] Choi J, Lee H J, Yoon S,. Blockade of CCL2 expression overcomes intrinsic PD-1/PD-L1 inhibitor- resistance in transglutaminase 2-induced PD-L1 positive triple negative breast cancer [J]., 2020, 10(9): 2878-2894.

[6] Gulley J L, Rajan A, Spigel D R,. Avelumab for patients with previously treated metastatic or recurrent non-small-cell lung cancer (JAVELIN solid tumor): Dose- expansion cohort of a multicentre, open-label, phase 1b trial [J]., 2017, 18(5): 599-610.

[7] Vaishampayan U, Sch?ffski P, Ravaud A,. Avelumab monotherapy as first-line or second-line treatment in patients with metastatic renal cell carcinoma: phase Ib results from the JAVELIN solid tumor trial [J]., 2019, 7(1): 275.

[8] Schmid P, Adams S, Rugo H S,. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer [J]., 2018, 379(22): 2108-2121.

[9] Adams S, Loi S, Toppmeyer D,. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study [J]., 2019, 30(3): 405-411.

[10] Mens L A, Cruz C, Eder J P,. Long-term clinical outcomes and biomarker analyses of Atezolizumab therapy for patients with metastatic triple-negative breast cancer: A phase 1 study [J]., 2019, 5(1): 74-82.

[11] 賈喜花, 高尚璞, 鄭勇, 等. 唐漢鈞治療乳腺癌經(jīng)驗 [J]. 中醫(yī)雜志, 2003(2): 96-97.

[12] 羅毅. 胃MALT淋巴瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療策略探討 [J]. 新中醫(yī), 2013, 45(8): 134-136.

[13] 周迪, 朱文偉, 胡明輝, 等. 從自噬效應(yīng)探討“扶正祛邪法”治療惡性腫瘤的作用及臨床應(yīng)用 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2018, 45(12): 2537-2539.

[14] 熊露, 田少霞. 扶正培本治則方藥調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫與血管正?；乃悸费芯?[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010, 30(2): 201-204.

[15] 譚婉燕, 熊枝繁. 中藥抗腫瘤臨床應(yīng)用的相關(guān)思考 [J]. 山西醫(yī)科大學學報, 2017, 48(9): 966-967.

[16] 明·張介賓. 景岳全書 [M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 1994: 645.

[17] 彭曄, 胡志強, 韓軼超, 等. 大黃人參方聯(lián)合改良DCF方案治療晚期胃癌臨床研究 [J]. 河北中醫(yī), 2015, 37(7): 1008-1011.

[18] 李炳茂, 彭曄, 王艷玲, 等. 大黃人參方緩解晚期消化道惡性腫瘤患者化療副反應(yīng)及提高療效的臨床研究 [J]. 河北中醫(yī), 2015, 37(12): 1780-1783.

[19] 張瑞賢. 徐靈胎神農(nóng)本草經(jīng)百種錄 [M]. 北京: 華夏出版社, 1998: 1102.

[20] 郭先帥, 吳純偉, 梁生旺, 等. 大黃與人參配伍用于治療缺血性腦中風的探討 [J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2015, 17(2): 110-112.

[21] 李健瑩, 欒曉嬌, 王凱乾, 等. 人參皂苷Rg3固體分散體的制備及表征 [J]. 中國藥學雜志, 2015, 50(10): 872-875.

[22] Xu H, Lu Y, Zhang T,. Characterization of binding interactions of anthraquinones and bovine β-lactoglobulin [J]., 2019, 281: 28-35.

[23] Crivelli B, Perteghella S, Bari E,. Silk nanoparticles: From inert supports to bioactive natural carriers for drug delivery [J]., 2018, 14(4): 546-557.

[24] Mukherjee A, Waters A K, Kalyan P,. Lipid-polymer hybrid nanoparticles as a next-generation drug delivery platform: state of the art, emerging technologies, and perspectives [J]., 2019, 14: 1937-1952.

[25] Jin X, Sun P, Tong G,. Star polymer-based unimolecular micelles and their application in bio- imaging and diagnosis [J]., 2018, 178: 738-750.

[26] Yen C C, Chen Y C, Wu M T,. Nanoemulsion as a strategy for improving the oral bioavailability and anti-inflammatory activity of andrographolide [J]., 2018, 13: 669-680.

[27] Liu G Y, Yang J Q, Wang Y X,. Protein-lipid composite nanoparticles for the oral delivery of vitamin B12: Impact of protein succinylation on nanoparticle physicochemical and biological properties [J]., 2019, 92: 189-197.

[28] Rai VK, Mishra N, Yadav KS,. Nanoemulsion as pharmaceutical carrier for dermal and transdermal drug delivery: Formulation development, stability issues, basic considerations and applications [J]., 2018, 270: 203-225.

[29] Wan J, Zhong SB, Schwarz P,. Physical properties, antifungal and mycotoxin inhibitory activities of five essential oil nanoemulsions: Impact of oil compositions and processing parameters [J]., 2019, 291: 199-206.

[30] 姚云霞, 李云, 李媛, 等. 納米乳在藥劑學中的研究及應(yīng)用進展 [J]. 軍事醫(yī)學, 2021, 45(6): 473-478.

[31] 張萬福編譯. 食品乳化劑 [M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1993: 117-135.

[32] 吳艾璟. 食用香味料常用溶劑乳化性能研究及穩(wěn)定性評價 [D]. 貴州: 貴州大學, 2015.

[33] Rao SV, Shao J. Self-nanoemulsifying drug delivery systems (SNEDDS) for oral delivery of protein drugs: I. Formulation development [J].,2008, 362(1-2): 2-9.

[34] Elnaggar Y S, El-Massik M A, Abdallah O Y. Self- nanoemulsifying drug delivery systems of tamoxifen citrate: Design and optimization [J]., 2009, 380(1/2): 133-41.

[35] 王敏娟, 李惠民, 馮鎖民, 等. 納米乳載藥研究進展 [J]. 化工科技, 2020, 28(1): 69-75.

[36] 羅國平, 妙苗, 白楊, 等. 偽三元相圖法優(yōu)化復方丁香油微乳制備工藝 [J]. 中國藥業(yè), 2020, 29(7): 87-89.

[37] 韓立煒, 果德安, 劉菊妍, 等. 2020年度中醫(yī)藥重大科學問題及工程技術(shù)難題 [J]. 中醫(yī)雜志, 2020, 61(19): 1671-1678.

[38] Zhao L, Shou H, Chen L,. Effects of ginsenoside Rg3on epigenetic modification in ovarian cancer cells [J]., 2019, 41(6): 3209-3218.

[39] Meng L, Ji R, Dong X,. Antitumor activity of ginsenoside Rg3in melanoma through downregulation of the ERK and Akt pathways [J]., 2019, 54(6): 2069-2079.

[40] Yang X, Zou J, Cai H,. Ginsenoside Rg3inhibits colorectal tumor growth via down-regulation of C/EBPβ/ NF-κB signaling [J]., 2017, 96: 1240-1245.

[41] Jiang Z, Yang Y, Yang Y,. Ginsenoside Rg3attenuates cisplatin resistance in lung cancer by downregulating PD-L1 and resuming immune [J]., 2017, 96: 378-383.

[42] 王蔚, 王旭, 余蘇云, 等. 人參皂苷Rg3調(diào)節(jié)免疫檢查點PD-L1抑制肺癌Lewis細胞增殖的作用及機制研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(1): 166-171.

[43] Li G M, Chen J R, Zhang H Q,. Update on pharmacological activities, security, and pharmacokinetics of rhein [J]., 2021, 2021: 4582412.

[44] Shen Z, Zhu B, Li J,. Rhein augments antiproliferative effects of atezolizumab based on breast cancer (4T1) regression [J]., 2019, 85(14/15): 1143-1149.

[45] Wang A L, Jiang H H, Liu Y Y,. Rhein induces liver cancer cells apoptosis via activating ROS-dependent JNK/Jun/caspase-3 signaling pathway [J]., 2020, 11(2): 500-507.

[46] 袁向飛, 田文聰, 謝俊木子, 等. 大黃酸增強低氧環(huán)境中效應(yīng)T細胞的抗結(jié)腸癌活性 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志, 2018, 24(4): 476-481.

Preparation of ginsenoside Rg3 and rhein nanoemulsion and pharmacodynamics study of its combination with aPD-L1 in treatment of triple negative breast cancer

ZHANG Fei-feng1, QIAN Ke1, 2, MA Li-sha1, 2, ZHAO Yue1, 2,SHI Jing-bin1, 2,XU Shu-jun1, 2,XIONG Yang1, 2

1. Department of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China 2. Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

According to the “supporting healthy energy to eliminate evils” treatment principle advocated by traditional Chinese medicine in the treatment of tumors, the main components ginsenoside Rg3(G-Rg3) and rhein (Rhe) in ginseng and rhubarb, respectively, were selected to prepare G-Rg3/Rhe nanoemulsion. At the same time, the solubility of G-Rg3and Rhe was improved to facilitate injection administration, and the nanoemulsion combined with anti-programmed cell death ligand 1 (aPD-L1) was used to treat triple negative breast cancer (TNBC).The solubility of G-Rg3and Rhe in different excipients was determined by UV spectrophotometry, and the appropriate emulsifier, co-emulsifier and oil phase were screened out. The pseudo-ternary phase diagram was used to investigate the effect ofmvalue on the nanoemulsion system, and the appropriatemvalue was selected according to the size of the nanoemulsion area. The prescription of G-Rg3/Rhe NE was optimized, and its characterization and stability were evaluated. The 4T1Flucmammary tumor mouse model was selected to evaluate the effect of G-Rg3/Rhe NE combined with aPD-L1 on TNBC.The optimized component ratio of G-Rg3/Rhe NE was as follows: polyoxyethylene hydrogenated castor oil EL35-polyethylene glycol 400-caprylic acid glyceride-water, and the mass ratio was 1.33:2.67:2.80:12.50, themvalue was 1:2. The average particle size of G-Rg3/Rhe NE was (84.8 ± 1.1) nm, the polydispersity index (PDI) was 0.21 ± 0.02, and the ζ potential was (?11.30 ± 0.43) mV. The encapsulation rates of G-Rg3and Rhe in drug-carrying nanoemulsions were 96.51% and 97.47%, respectively, and the drug loading capacity of the two drugs was 0.75%. G-Rg3/Rhe NE combined with aPD-L1 could significantly inhibit the tumor growth in 4T1Fluc-bearing mice.The G-Rg3/Rhe NE was of uniform particle size and good stability, it could synergistically enhance the antitumor effect of aPD-L1 on TNBC.

ginsenoside Rg3; rhein; nanoemulsion; triple negative breast cancer; aPD-L1

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 4973 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.006

2022-02-20

國家自然科學基金資助項目（82174095）；浙江省自然科學基金重點項目（Z22H296589）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2021KY813）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（202110344032）

張翡峰，女，在讀本科生。E-mail:1390923765@qq.com

熊 陽，女，博士生導師，教授，從事腫瘤免疫治療、腫瘤聯(lián)合用藥及新型遞送系統(tǒng)研究。E-mail: xyxnb@126.com

#共同第一作者：錢 柯，女，碩士研究生，研究方向為藥物新劑型及新技術(shù)研究。E-mail: imqianke@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]