梁達均，林宇建，時 軍, 2*，吳欣穎，劉銳萍

綠原酸-黃芩苷共載納米粒鼻腔原位凝膠的制備及增強鼻黏膜免疫作用

梁達均1，林宇建1，時 軍1, 2*，吳欣穎1，劉銳萍1

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省局部精準遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

制備綠原酸-黃芩苷共載納米粒鼻腔原位凝膠（chlorogenic acid-baicalin co-loaded nanoparticlesnasal gel，CA&B-NPs/ISNG），初步考察其對上呼吸道黏膜免疫功能低下（upper airway immunity dysfunction，UAID）小鼠的影響。以包封率和膠凝溫度為評價指標，制備出CA&B-NPs/ISNG，表征其形態(tài)、粒徑分布、ζ電位、體外釋藥量及凝膠溶蝕量；采用牛蛙上顎離體法考察CA&B-NPs/ISNG對纖毛的毒性；建立UAID小鼠模型，測定小鼠唾液的分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）含量和溶菌酶活性，考察CA&B-NPs/ISNG增強鼻黏膜免疫的作用。優(yōu)選處方：取綠原酸和黃芩苷各11.0 mg，加入10 mL聚乙二醇（PEG）400溶解成CGA-BC溶液，磁力攪拌下緩慢滴入到25 mL 2.72 mg/mL殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH至5.0，然后磁力攪拌下緩慢滴加10 mL 1.00 mg/mL三聚磷酸鈉（tripolyphosphate，TPP）溶液，得CA&B-NPs混懸液；往CA&B-NPs混懸液中加入體系18.5%泊洛沙姆407（Poloxamer 407，P407），溶脹分散均勻后，加入體系1%泊洛沙姆188（Poloxamer 188，P188），待完全溶脹分散均勻，調(diào)節(jié)pH至5.5，得CA&B-NPs/ISNG。納米粒形態(tài)規(guī)則，平均粒徑（536.10±16.24）nm，粒子分散系數(shù)0.310±0.053，ζ電位（24.39±0.27）mV，綠原酸和黃芩苷包封率分別為（44.67±0.43）%和（55.25±0.61）%；膠凝溫度為（32.03±0.31）℃。CA&B-NPs/ISNG表現(xiàn)出持續(xù)緩慢釋藥和無明顯的纖毛毒性，且能顯著提高SIgA的含量和溶菌酶的活性（＜0.05）。制備的CA&B-NPs/ISNG均一穩(wěn)定，包封率高，適用鼻用制劑要求，可提高UAID小鼠的鼻黏膜免疫功能。

綠原酸；黃芩苷；納米粒；原位凝膠；鼻黏膜免疫

上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI），是臨床常見的呼吸道傳染病，大部分由病毒引起[1]。中醫(yī)將URTI歸于傷風(fēng)范疇，認為外感六淫之邪，以風(fēng)邪為主、入里化熱、肺失宣降為傷風(fēng)的主要病機[2]。同時，肺開竅于鼻，鼻黏膜可以介導(dǎo)黏膜及全身免疫反應(yīng)[3-5]。鼻腔給藥對防治URTI有較大應(yīng)用價值。以金銀花-黃芩2藥相配為基礎(chǔ)的制劑，具有良好的抗感染能力，被廣泛用于治療URTI[6-7]。綠原酸和黃芩苷分別是金銀花和黃芩的主要有效成分，均具有抗菌、抗病毒[8-9]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，兩者均可促進分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）的合成及分泌，增強機體的免疫屏障[10-11]，同時，提高溶菌酶的活力，增強其對細菌的殺滅作用[12-13]。綠原酸-黃芩苷2藥聯(lián)用，以期協(xié)同調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強機體的抗病原體能力。

殼聚糖納米粒（chitosan nanoparticles）攜帶正電荷，易與帶負電的鼻黏膜產(chǎn)生電荷吸引，可以促進藥物的吸收[14]。溫敏型原位凝膠（thermosensitivegels）液態(tài)時有助于精確的用藥量，固態(tài)時可以減少鼻纖毛對藥物的清除和提高藥物在鼻腔內(nèi)的滯留性[15]，具有溫度觸變性。本研究將綠原酸-黃芩苷共載殼聚糖納米粒中，并應(yīng)用于溫敏原位凝膠，制備綠原酸-黃芩苷共載納米粒鼻腔原位凝膠（chlorogenic acid-baicalin co-loaded nanoparticlesnasal gel，CA&B-NPs/ ISNG），以期延長藥物的鼻腔滯留時間，增強上呼吸道黏膜免疫功能，為綠原酸-黃芩苷鼻用制劑防治URTI提供新的思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000 HPLC系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司；JEM-1200EX型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社；85-2A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；Delso Nano C型激光粒度電位儀，美國Beckman Coulter公司；TGL-16型高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-25型pH計，上儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TP-6型透皮擴散儀，天津市精拓儀器科技有限公司；SHA-B型恒溫振蕩器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；E100型正置光學(xué)顯微鏡，上海成貫儀器有限公司；Olympus CKX41型倒置式生物顯微鏡，北京中儀光科科技發(fā)展有限公司；RT-6100型自動酶標儀，雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 試劑

綠原酸（批號PS0132-1000MG）、黃芩苷（批號PS010447），質(zhì)量分數(shù)均≥98%，成都普思生物科技股份有限公司；殼聚糖（批號C105799）、三聚磷酸鈉（批號S100099），阿拉丁試劑有限公司；聚乙二醇（PEG）400，批號20200515，天津市大茂化學(xué)試劑廠；波洛沙姆188（P188，批號GND17422B）、波洛沙姆407（P407，批號GND11321B），巴斯夫有限公司；脫氧膽酸鈉，批號S31095，上海源葉生物科技有限公司；小鼠SIgA ELISA試劑盒、溶菌酶測試盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司；色譜純（甲醇、乙腈），默克股份兩合公司。

1.3 動物

牛蛙36只，體質(zhì)量40～60 g，購于廣州市白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場；健康昆明小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2016-0041。所有動物實驗遵循廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 CA&B-NPs的制備及包封率的測定

取綠原酸和黃芩苷各10.0 mg，加入10 mL PEG400溶解成綠原酸-黃芩苷溶液，磁力攪拌下緩慢滴入到25 mL含2%醋酸的2 mg/mL殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10 min，1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，然后磁力攪拌下以2滴/s的速率緩慢滴加10 mL 1 mg/mLTPP溶液，繼續(xù)攪拌20 min，得CA&B-NPs混懸液（V1）[16]。取5 mL CA&B-NPs混懸液置離心管中，12 000 r/min離心（離心半徑為9.98 cm）30 min后，收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過。精密量取濾液1 mL，加入50%甲醇定容至10 mL，混勻，得含有未包封藥物的混懸液（V2）。采用HPLC法測定V1和V2中藥物的質(zhì)量濃度（V1和V2）。按包封率＝(V1－V2)/V1，分別計算綠原酸和黃芩苷的包封率。

2.2 單因素實驗考察CA&B-NPs制備工藝

2.2.1 藥物投料質(zhì)量 按“2.1”項下方法制備CA&B-NPs，固定殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比為5∶1、殼聚糖溶液pH值為5.0和磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1000 r/min（離心半徑為6.30 cm），考察藥物投料質(zhì)量2.5、5.0、10.0、15.0 mg對包封率的影響。結(jié)果（表1）顯示，當投放量較少時，包封率較低，當投放量10.0 mg時，包封率較高，但投放量15.0 mg時，包封率下降，說明投藥量對包封率影響較大。

表1 藥物投料質(zhì)量對包封率的影響

Table 1 Effects of drug feeding quality on encapsulation efficiency

藥物投料質(zhì)量/mg包封率/% 綠原酸黃芩苷 2.514.33±0.5224.25±0.88 5.020.23±0.2536.26±0.90 10.032.04±0.8644.71±0.99 15.023.03±0.4035.33±0.49

2.2.2 殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比 按“2.1”項下方法制備CA&B-NPs，固定藥物投料質(zhì)量為10.0 mg、殼聚糖溶液pH值為5.0和磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1000 r/min（離心半徑為6.30 cm），考察殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比3∶1、5∶1、7∶1、9∶1對包封率的影響。結(jié)果（表2）顯示，5∶1和7∶1時，包封率較高。而9∶1時，觀察到納米粒不穩(wěn)定，容易沉降，可能是TPP質(zhì)量濃度過高，與殼聚糖形成的粒徑較大且分布不均勻?qū)е隆?/p>

2.2.3 殼聚糖溶液pH值 按“2.1”項下方法制備CA&B-NPs，固定藥物投料質(zhì)量為10.0 mg、殼聚糖

表2 殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比對包封率的影響

Table 2 Effects of mass concentration ratio of chitosan to TPP on encapsulation efficiency

殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比包封率/% 綠原酸黃芩苷 3∶119.58±0.4227.99±0.77 5∶132.04±0.8644.71±0.99 7∶127.51±0.3341.90±1.34 9∶129.33±0.6939.82±0.18

與TPP質(zhì)量濃度比為5∶1和磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1000 r/min（離心半徑為6.30 cm），考察殼聚糖溶液pH值為3.0、4.0、5.0、6.0對包封率的影響。結(jié)果如表3所示，pH值為5.0和6.0時，包封率較為理想，而pH值為6.0時溶液較渾濁，pH值為3.0和4.0時包封率較低，說明pH值對包封率影響較大。

表3 殼聚糖溶液pH值對包封率的影響

Table 3 Effects of pH value of chitosan solution on encapsulation efficiency

殼聚糖溶液pH值包封率/% 綠原酸黃芩苷 317.44±0.5125.87±0.49 422.04±0.4334.71±0.45 532.04±0.8644.71±0.99 630.65±0.8443.89±0.98

2.2.4 攪拌速率 按“2.1”項下方法制備CA&B- NPs，固定藥物投料質(zhì)量為10.0 mg、殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比為5∶1和殼聚糖溶液pH值為5.0，考察用磁力攪拌器調(diào)節(jié)滴入TPP時的轉(zhuǎn)速分別為600、800、1000、1200 r/min（離心半徑為6.30 cm）對包封率的影響。結(jié)果（表4）顯示，攪拌速度對包封率影響不大，因此不把攪拌速度納入考察范圍，實驗選用1000 r/min（離心半徑為6.30 cm）轉(zhuǎn)速。

表4 攪拌速率對包封率的影響

Table 4 Effects of stirring rate on encapsulation efficiency

攪拌速度/(r?min?1)包封率/% 綠原酸黃芩苷 60031.57±0.5942.87±0.98 80031.84±0.4244.80±0.74 100032.04±0.8644.71±0.99 120032.11±1.1343.88±1.29

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化CA&B-NPs制備工藝及最優(yōu)處方驗證

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取藥物投料質(zhì)量（1）、殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比（2）和殼聚糖溶液pH值（3）為考察因素，綠原酸包封率（1）和黃芩苷包封率（2）為考察指標，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對CA&B-NPs的制備進行處方優(yōu)化，實驗設(shè)計和結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 10.0軟件對結(jié)果進行分析見表6，得出綠原酸和黃芩苷2次多項回歸方程模型為1＝30.21＋2.151＋3.172＋13.353＋0.2212＋3.0313－2.2023－10.0112－2.9722＋2.0032，2＝38.19＋1.521＋4.222＋9.103－1.3312＋0.6313－1.3623－4.5212＋0.6622＋4.1632，2個模型都有顯著性差異（＜0.05），失擬項都無顯著性差異，且相關(guān)系數(shù)12＝0.992 0和22＝0.992 1，模型中3、12有極顯著差異（＜0.001）。表明該回歸方程擬合度良好，符合本實驗的要求，能夠準確預(yù)測綠原酸和黃芩苷的包封率。

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化

Table 5 Optimization of response surface experiment design

序號X1/mgX2X3Y1/%Y2/%序號X1/mgX2X3Y1/%Y2/%序號X1/mgX2X3Y1/%Y2/% 115 (+1)5 (0)3 (?1)9.5629.987157422.5439.111357418.4538.34 25 (?1)55 (+1)28.7844.448105429.9739.681453412.3532.98 310 (0)54 (0)31.2336.669103 (?1)542.9849.9815153415.5826.89 455310.6528.571010339.3627.9916107544.7355.32 5107 (+1)319.8938.7811105428.8837.8817105430.6738.78 6155539.7948.3512105430.2837.97

表6 方差分析結(jié)果

Table 6 Results of variance analysis

方差來源自由度Y1Y2方差來源自由度Y1Y2 平方和F值P值平方和F值P值平方和F值P值平方和F值P值 模型92 079.8796.17＜0.000 1991.5697.37＜0.000 1X121421.83175.55＜0.000 186.1076.09＜0.000 1 X1137.0715.430.005 718.5716.420.004 9X22137.0615.420.005 71.841.620.243 3 X2180.2033.380.000 7142.13125.61＜0.000 1X32116.907.030.032 972.9764.49＜0.000 1 X311 426.05593.46＜0.000 1661.93584.98＜0.000 1殘差716.82 7.92 X1X210.180.080.789 57.056.230.041 2失擬項313.745.940.059 02.870.760.573 8 X1X3136.7215.280.005 81.561.380.278 4純誤差43.08 5.05 X2X3119.328.040.025 27.436.560.037 5總回歸162 096.69 999.48

根據(jù)模型繪制二維等高線和三維響應(yīng)面圖。二維等高線圖的形狀可反應(yīng)2個因素的交互作用，等高線呈橢圓形則表示兩因素交互作用較強，而圓形則表示2因素交互作用較弱；三維響應(yīng)面圖的傾斜度可反應(yīng)各因素的交互作用，傾斜度越大則表示交互作用越強。結(jié)果見圖1、2，均顯示3與1、2兩兩因素的等高線圖趨向橢圓形，以及響應(yīng)面圖傾斜度較高，故對載藥工藝的影響顯著；1與2交互作用不明顯，故對載藥工藝的影響不顯著。

優(yōu)選處方為1＝11，2＝6.8，3＝5，預(yù)測值綠原酸包封率為44.72%，黃芩苷包封率為55.32%。重復(fù)測定3次，綠原酸包封率為（44.67±0.43）%，黃芩苷包封率為（55.25±0.61）%，和預(yù)測值接近，表明該處方對CA&B-NPs的包封率預(yù)測可靠，具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4 CA&B-NPs的性狀考察

取CA&B-NPs適量，加水稀釋10倍，通過激光粒度電位儀測定其平均粒徑、粒徑分散指數(shù)和ζ電位。另取納米粒稀釋樣品滴至銅網(wǎng)上，滴加2%磷鎢酸溶液進行負染，在TEM下觀察其形貌特征。結(jié)果如圖3所示，所制備的納米粒的平均粒徑為（536.10±16.24）nm，粒徑分散指數(shù)為0.310±0.053，ζ電位為（24.39±0.27）mV，表明納米粒粒徑較小且分布均勻，ζ電位穩(wěn)定，不易發(fā)生絮凝。電鏡下納米粒呈類球形，形狀規(guī)則，形態(tài)飽滿。

2.5 CA&B-NPs/ISNG的制備

稱取18.5% P407，加入到CA&B-NPs混懸液中，磁力攪拌使其分散均勻，4 ℃靜置過夜，至P407充分溶脹分散均勻。在磁力攪拌下，緩慢加入1% P188，繼續(xù)4 ℃靜置過夜，至P188完全溶脹分散均勻。最后在磁力攪拌下逐滴滴加1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH值至5.5左右，得CA&B-NPs/ ISNG[17]。

2.6 CA&B-NPs/ISNG的質(zhì)量評價

2.6.1 膠凝效果 取凝膠適量加入試管中，并置于15 ℃的恒溫水浴鍋，以1.0 ℃/min的速度緩慢加熱水浴，每升高0.1 ℃，將試管傾斜90°，觀察液面直至其不再流動，記錄此時的溫度，重復(fù)3次結(jié)果為（32.0±0.3）℃，表明其符合鼻腔溫度（32～35 ℃）的范圍。取適量凝膠加入試管中，并置于32 ℃的恒溫水浴鍋，觀察液面直至其不再流動，記錄膠凝時間，重復(fù)6次結(jié)果為（5±1）s，表明其在32 ℃凝膠速度較快。將凝膠分別放置于25 ℃和34 ℃ 2周，取出，3000 r/min離心（離心半徑為6.30 cm）10 min，觀察凝膠均無分層，表明其性質(zhì)穩(wěn)定。

圖1 藥物投料質(zhì)量、殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比和殼聚糖溶液pH對綠原酸包封率的二維等高線和三維響應(yīng)面圖

圖2 藥物投料質(zhì)量、殼聚糖與TPP質(zhì)量濃度比和殼聚糖溶液pH對黃芩苷包封率的二維等高線和三維響應(yīng)面圖

a-粒徑 b-ζ電位 c-納米微粒外觀（透射電鏡觀察）

2.6.2 體外釋藥量的測定 精密稱取2 g CA&B- NPs/ISNG置透析袋內(nèi)，懸于200 mL釋放介質(zhì)中，于32 ℃水浴以150 r/min振搖，分別在0.5、1、1.5、2、3、6、10、12、24 h移取2 mL釋放液（）經(jīng)0.22 μm濾過備用，并及時補充同溫度的釋放介質(zhì)2 mL，HPLC法測定釋放液中綠原酸和黃芩苷質(zhì)量濃度（C），按公式計算體外累積釋放率（綠原酸或黃芩苷）。結(jié)果如圖4-a所示，前6 h釋放較快，綠原酸和黃芩苷累積釋放率分別為57%和41%，隨后24 h持 續(xù)緩慢釋藥，具有良好的緩釋作用。綠原酸釋放曲線與一級方程擬合度最好，綠原酸＝0.793 44 (1－e?0.266 49 t)，2＝0.950 1；黃芩苷釋放曲線與Higuchi方程擬合度最好，黃芩苷＝0.157 821/2－0.014 77，2＝0.959 1。

綠原酸或黃芩苷＝(CV＋CV)/W

是凝膠中綠原酸或黃芩苷的總含量

2.6.3 凝膠溶蝕量的測定 稱取CA&B-NPs/ISNG 1 g置于已精密稱定質(zhì)量的離心管（1）中，于32 ℃水浴以150 r/min振搖使其完全形成凝膠后，精密稱定凝膠和離心管的總質(zhì)量（0）。加入同溫度的生理鹽水1 mL，繼續(xù)恒溫振蕩，分別于15、30、45、60、90、120、180 min將離心管中的溶液全部傾倒出，精密稱定剩余質(zhì)量（W），并及時補充同溫度的生理鹽水1 mL。2個時間點的質(zhì)量差即為溶蝕量＝(0－W)/(0－1)。

a-體外釋藥量 b-凝膠溶蝕量

分別吸取上述時間點傾倒出的溶液于5 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μm濾過備用，HPLC法測定釋放液中綠原酸和黃芩苷質(zhì)量濃度，即體外累積釋放率（綠原酸或黃芩苷）[18]。結(jié)果如圖4-b所示，綠原酸和黃芩苷的釋放隨凝膠的不斷溶蝕同時進行，表明藥物釋放速率主要受到凝膠溶蝕速率的控制，180 min時綠原酸和黃芩苷累積釋放率均超過60%。回歸方程分別為溶蝕＝0.004 5＋0.097 8，2＝0.964 6；綠原酸＝0.003 6＋0.084 6，2＝0.937 8；黃芩苷＝0.003 2＋0.079 1，2＝0.935 1。

2.7 CA&B-NPs/ISNG的鼻黏膜纖毛毒性評價

2.7.1 牛蛙上顎黏膜的直觀考察 隨機分為空白組、陽性組、空白凝膠組和CA&B-NPs/ISNG組，每組6只牛蛙。固定牛蛙，依次往每組牛蛙上顎黏膜處分別滴加0.5 mL生理鹽水、1%脫氧膽酸鈉、空白凝膠和CA&B-NPs/ISNG；30 min后，用生理鹽水洗凈，分離出黏膜約2 mm×2 mm；分離后立即洗凈血跡等雜物，纖毛面朝上平鋪于載玻片上，黏膜表面滴加適量生理鹽水，蓋上蓋玻片，得樣本玻片，于顯微鏡下觀察黏膜形態(tài)[19]。

結(jié)果給予生理鹽水的黏膜面齊整，纖毛保存完好及其有序運動（圖5-a）；給予1%脫氧膽酸鈉30 min后觀察到黏膜表面零碎殘缺，纖毛完全脫落，已觀察不到纖毛運動，說明其對黏膜組織纖毛運動有嚴重影響（圖5-b）；給予空白凝膠、CA&B-NPs/ ISNG的黏膜面較齊整，纖毛數(shù)量較多，個別纖毛運動略減弱，表明CA&B-NPs/ISNG在一定程度上減弱纖毛運動，但影響不大，具有良好的安全性（圖5-c和圖5-d）。

2.7.2 纖毛持續(xù)運動時間和輸送速率的測定 將“2.7.1”項的樣本玻片置于蒸餾水飽和的密閉層析缸中，溫度20～25 ℃，每隔30 min取出載玻片在顯微鏡下觀察，如纖毛繼續(xù)運動則放回層析缸中，直至纖毛運動停止。記錄從滴加藥物開始至纖毛運動停止所持續(xù)的時間，即纖毛持續(xù)運動時間（persistent vibration duration，PVD），給藥組PVD除以空白組PVD，即得纖毛持續(xù)運動百分率。按“2.7.1”項方法，將牛蛙分組給藥，5 min后，在上顎靠前方位置用棉簽輕沾甲基紅顆粒以作標記，將刻度尺平行放置在旁觀察，甲基紅顆粒將在黏膜表面緩慢向咽部移動劃下明顯痕跡，記錄顆粒移動1 cm所需時間，即纖毛輸送速率（mucoiliary transport rate，MTR），給藥組MTR除以空白組MTR，即得纖毛輸送速率百分率。結(jié)果如表7所示，空白凝膠組和CA&B-NPs/ISNG組的PVD百分率小于90，說明凝膠對纖毛運動有一定影響，可能與P407、P108、殼聚糖等輔料具有黏度有關(guān)；空白凝膠組和CA&B- NPs/ISNG組的MTR百分率大于95，說明CA&B- NPs/ISNG無明顯纖毛毒性，可用于鼻腔給藥。

a-空白組 b-陽性組 c-空白凝膠組 d-CA&B-NPs/ISNG組

表7 牛蛙上顎黏膜纖毛持續(xù)運動及纖毛輸送速率(, n = 6)

Table 7 Sustained movement and transport rate of cilia in bullfrog maxillary mucosa (, n = 6)

組別PVD/minPVD百分率MTR/(cm?min?1)MTR百分率 空白552.5±31.6100.00.885±0.025100.0 陽性0000 空白凝膠491.7±18.289.00.850±0.03396.0 CA&B-NPs/ISNG485.8±23.387.90.843±0.03195.2

2.8 CA&B-NPs/ISNG的鼻黏膜免疫評價

2.8.1 UAID小鼠模型的建立 隨機分為空白組、模型組、銀翹組、CA&B-NPs/ISNG低劑量組和高劑量組，共5組，每組8只小鼠。除空白組外，其余各組小鼠置?20 ℃寒冷環(huán)境60 min，1次/d，連續(xù)冷刺激3 d，以小鼠唾液中SIgA含量及溶菌酶活性作為評價指標，建立UAID小鼠模型[20-21]。

2.8.2 鼻黏膜給藥 寒冷刺激前1 h，按小鼠體質(zhì)量進行給藥，空白組和模型組滴鼻5.0 μL/g生理鹽水，銀翹組ig 21.84 g/kg銀翹散，低劑量組及高劑量組分別滴鼻2.5 μL/g和5.0 μL/g CA&B-NPs/ISNG；第3天冷刺激后，室溫適應(yīng)60 min，每只小鼠ip 0.1%毛果蕓香堿注射液0.5 mL，2 min后移取其唾液，ELISA試劑盒測定唾液中SIgA含量和溶菌酶活性。結(jié)果如表8所示，模型組與空白組小鼠相比，唾液中SIgA含量和溶菌酶活性顯著降低，表明?20 ℃寒冷刺激可以建立小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型；CA&B-NPs/ISNG高劑量組和銀翹組小鼠，與模型組小鼠相比，SIgA含量、溶菌酶活性均有顯著性升高，而與空白組小鼠相比無顯著差異，表明高劑量CA&B-NPs/ISNG和銀翹散均能抵抗寒冷刺激致上呼吸道黏膜免疫功能的下降；CA&B-NPs/ ISNG高劑量組與低劑量組相比，SIgA含量、溶菌酶活性有升高趨勢，但無顯著差異，表明CA&B- NPs/ISNG發(fā)揮藥效無顯著劑量相關(guān)性。

表8 小鼠上呼吸道黏膜免疫功能(, n = 8)

Table 8 Mucosal immunity in the upper respiratory tract of mice (, n = 8)

組別劑量SIgA/(g?L?1)溶菌酶/(μg?L?1) 空白?4.89±0.467.67±1.50 模型?3.98±0.51##5.97±0.96# 銀翹散21.84 g?kg?14.85±0.71*7.70±1.19** CA&B-NPs/ISNG2.5 μL?g?14.47±0.647.11±0.76* 5.0 μL?g?14.89±0.63**7.46±1.49*

與空白組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

#< 0.05##< 0.01blank group;*< 0.05**< 0.01model group

3 討論

金銀花-黃芩2藥配伍被廣泛用于治療上呼吸道感染，如銀黃、金花清感、清開靈、雙黃連方等，具備優(yōu)良的抗感染能力。2藥常以整體使用，也有以其有效成分使用，在銀黃注射液中，2藥有效成分綠原酸和黃芩苷以1∶1～1∶2質(zhì)量比進行配伍用藥。與全身給藥治療上呼吸道感染相比，鼻腔給藥方便并且作用可靠。鼻為肺之竅，鼻作為身體與外界空氣相通的器官，是為肺把關(guān)的重要關(guān)卡，同時，成人近80%免疫細胞與黏膜表面相關(guān)，鼻腔給藥能夠誘導(dǎo)全身和黏膜免疫反應(yīng)，增強機體抗感染能力。

人體鼻腔黏膜面積僅約150 cm3，加上普通滴鼻劑給藥滯留時間較短，以及鼻腔黏膜纖毛清除作用，會極大地限制鼻腔給藥的療效。殼聚糖具備高生物相容性和促滲透性，其帶正電荷的胺殘基和帶負電荷的鼻黏液層之間存在相互作用，使之具有一定的黏附能力，能夠充當?shù)伪侵苿┑膬?yōu)良載體材料；溫敏原位凝膠給藥系統(tǒng)有著獨特的鼻腔給藥優(yōu)勢，表現(xiàn)為在環(huán)境溫度下呈流體狀，作為滴鼻制劑可高劑量精度給藥，在進入鼻腔后受鼻腔溫度刺激迅速經(jīng)歷液體-凝膠轉(zhuǎn)變，從而能夠延長藥物與黏膜的接觸時間并能實現(xiàn)緩慢釋放。因此本研究將綠原酸和黃芩苷共載于納米粒，結(jié)合溫敏凝膠，以期提高藥物的鼻腔滯留能力。

鼻黏膜毒性評價是鼻腔給藥安全性研究的重要內(nèi)容。其中鼻黏膜毒性最常見的表現(xiàn)是鼻黏膜纖毛毒性，主要是影響纖毛運動，更甚者可導(dǎo)致纖毛脫落。牛蛙上腭的纖毛與哺乳動物的鼻腔黏膜纖毛相似，因此，常常用于代替哺乳動物的鼻腔黏膜纖毛毒性研究。SIgA和溶酶菌是機體免疫防御重要成分，前者可有效中和入侵病毒，后者可引起細菌溶解[22-23]，兩者是UAID小鼠鼻黏膜免疫的重要評價指標。預(yù)實驗中，將制備好的CGA-BC納米粒鼻腔原位凝膠以5.0 μL/g滴入UAID模型小鼠的鼻腔[24]，觀察發(fā)現(xiàn)其行為正常，無明顯不適，試劑盒檢測其唾液中SIgA含量和溶菌酶活性，相比未滴鼻給藥的模型小鼠有顯著升高，因此以5.0 μL/g作為鼻黏膜免疫評價實驗的高劑量。

本研究所制備的CA&B-NPs/ISNG具有良好的生物相容性，可延長藥物的作用時間，對寒冷刺激誘導(dǎo)小鼠上呼吸道黏膜免疫低下有提升的作用，為臨床用于防治URTI提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中華醫(yī)學(xué)會, 中華醫(yī)學(xué)會雜志社, 中華醫(yī)學(xué)會全科醫(yī)學(xué)分會, 等. 急性上呼吸道感染基層診療指南(2018年) [J]. 中華全科醫(yī)師雜志, 2019, 18(5): 422-426.

[2] 梅雪, 彭衡陽, 劉天強, 等. 上呼吸道感染研究綜述 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2012, 8(2): 187-188.

[3] 李立浩, 陳利娟, 吳勇, 等. 鼻腔沖洗輔助治療兒童急性上呼吸道感染的效果 [J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2015, 36(2): 219-221.

[4] 栗昀, 賴艷妮, 李向陽, 等. 冰香散揮發(fā)油黏膜免疫抗流感病毒效果評價 [J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2016, 33(4): 535-539.

[5] Shibuya M, Tamiya S, Kawai A,. Nasal- subcutaneous prime-boost regimen for inactivated whole- virus influenza vaccine efficiently protects mice against both upper and lower respiratory tract infections [J]., 2021, 554: 166-172.

[6] 馮群, 關(guān)永霞, 姚景春, 等. 銀黃制劑抗感染作用與臨床應(yīng)用進展 [J]. 中國藥物評價, 2020, 37(3): 211-214.

[7] Li M W, Wang Y X, Jin J,. Inhibitory activity of honeysuckle extracts against influenza A virusand[J]., 2021, 36(3): 490-500.

[8] 樊榮, 羿國娟, 魯蘭, 等. 綠原酸及其13種體內(nèi)主要代謝物的體外抗菌作用研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(24): 6239-6245.

[9] 龍宇, 向燕, 譚裕君, 等. 黃芩苷藥理作用及新劑型的研究進展 [J]. 中草藥, 2019, 50(24): 6142-6148.

[10] Chen J L, Xie H M, Chen D W,. Chlorogenic acid improves intestinal development via suppressing mucosa inflammation and cell apoptosis in weaned pigs [J]., 2018, 3(2): 2211-2219.

[11] Cheng K B, Wu Z H, Gao B L,. Analysis of influence of baicalin joint resveratrol retention enema on the TNF-α, SIgA, IL-2, IFN-γ of rats with respiratory syncytial virus infection [J]., 2014, 70(2): 1305-1309.

[12] 王多伽, 暢麗芳, 遲玉楊, 等. 日糧中添加不同水平綠原酸對獺兔血清免疫指標的影響 [J]. 飼料研究, 2013(3): 33-36.

[13] Cheng X Y, Cao Z Y, Luo J R,. Baicalin ameliorates APEC-induced intestinal injury in chicks by inhibiting the PI3K/AKT-mediated NF-κB signaling pathway [J]., 2022, 101(1): 101572.

[14] 楊夢璐, 張娜, 王方遠, 等. 殼聚糖在納米藥物遞送載體領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀 [J]. 中國組織工程研究, 2021, 25(28): 4546-4552.

[15] 何朝星, 王欣, 高淑穎, 等. 白藜蘆醇眼用納米乳-離子敏感型原位凝膠的制備與質(zhì)量評價 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2022, 57(2): 124-131.

[16] 吳瑛, 李陽, 李鳳琴, 等. 黃芩苷殼聚糖納米粒的制備及表征 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2014, 20(15): 15-19.

[17] 孫健. 殼聚糖納米粒的復(fù)合法制備及其在溫敏凝膠中的應(yīng)用 [D]. 南京: 南京師范大學(xué), 2015.

[18] 謝錦. 去氫駱駝蓬堿納米晶體原位凝膠給藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其鼻腔給藥研究 [D]. 南昌: 江西中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

[19] 謝偉容. 黃連解毒鼻用溫敏凝膠對蟾蜍上顎黏膜纖毛毒性作用的研究 [J]. 江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2019, 31(2): 85-87.

[20] 李爽, 楊居崩, 廖陳, 等. 解表方對寒冷刺激致大鼠鼻黏膜免疫屏障功能低下模型的作用 [J]. 中成藥, 2022, 44(1): 227-230.

[21] 李嫻, 雷娜, 段小花, 等. 寒冷刺激致小鼠上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的研究 [J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(8): 1662-1664.

[22] 關(guān)景平, 孔春燕, 李霞. 瀉脾散加減對脾胃伏火型復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者口腔菌群及唾液免疫指標的影響 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2020, 29(27): 3035-3039.

[23] 劉洪, 李海文, 劉鳳斌. 唾液成分與消化道疾病相關(guān)性研究及中醫(yī)藥防治思路 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2016, 27(3): 460-465.

[24] 陳秀秀, 周紅霞, 亓文寶, 等. 甘草酸聯(lián)合利巴韋林體內(nèi)抗甲型H1N1流感病毒作用 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2015, 50(8): 966-972.

Preparation of chlorogenic acid-baicalin co-loaded nanoparticlesnasal gel and investigation on enhancing nasal mucosal immunity

LIANG Da-jun1, LIN Yu-jian1, SHI Jun1, 2, WU Xin-ying1, LIU Rui-ping1

1. Department of Traditional Chinese Medicine, Guangdong PharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China 2. Guangdong Engineering & Technology Research Center of Topical PreciseDrug Delivery System, Guangzhou 510006, China

To prepare for chlorogenic acid and baicalin co-loaded nanoparticlesnasal gel (CA&B-NPs/ISNG) and to investigate its effect on upper airway immunity dysfunction (UAID) mice.To use encapsulation rate and gelation temperature as evaluation index, CA&B-NPs/ISNG was prepared. Then it was characterized by morphology, particle size distribution, ζpotential, drug releaseand gel corrosion amount. The toxicity of CA&B-NPs/ISNG to cilia was investigated by using toad palate mucosa. The UAID mice was established and the enhancement effect of CA&B-NPs/ISNG on nasal mucosal immunity was detected by measuring the SIgA content and lysozyme activity in saliva of mice.The preferred prescription is to take 11.0 mg each of chlorogenic acid and baicalin, 10 mL PEG400 was added to dissolve intochlorogenic acid- baicalin solution and slowly dropped into 25 mL 2.72 mg/mL chitosan solution with magnetic stirring. Adjusted the pH to 5.0. Then 10 mL 1.00 mg/mL TPP solution was slowly added dropwise under magnetic stirring to obtain CA&B-NPs suspension; CA&B-NPs was added to system 18.5% P407, swollen and dispersed well, then added system 1% P188, completely swollen and dispersed well, and the pH was adjusted to 5.5 to obtain CA&B-NPs/ISNG. Nanoparticles showed regular morphology with particle size (536.10 ± 16.24) nm, ζ potential (24.39 ± 0.27) mV, particle dispersion coefficient 0.310 ± 0.053, chlorogenic acid and baicalin encapsulation rates of (44.67 ± 0.43)% and (55.25 ± 0.61)%, respectively. The gelling temperature was (32.03 ± 0.31) ℃. CA&B-NPs/ISNG showed sustained slow drug release and no obvious ciliary toxicity, and significantly increased SIgA content and lysozyme activity (< 0.05).The prepared CA&B-NPs/ISNG was stable and had high encapsulation rate. It was suitable for nasal preparation requirement and can improve nasal mucosal immune function in UAID mice.

chlorogenic acid; baicalin; nanoparticles;gel; nasal mucosal immunity

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 5001 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.009

2022-04-08

全國中醫(yī)藥創(chuàng)新骨干人才培養(yǎng)對象項目［國中醫(yī)藥人教函（2019）128號］

梁達均（1996—），男，碩士研究生，研究方向為中藥制劑研究與開發(fā)。Tel: 15913444215 E-mail: 15913444215@163.com

時 軍（1980—），男，博士，副教授，研究方向為中藥新劑型與制劑新技術(shù)研究。E-mail: shijun8008@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]