胡 靜，楊媛媛，任 慧，崔小敏，李 寧，曲 彤，陳志永*

光葉丁公藤及其3個潛在代用品治療類風濕性關節(jié)炎差異性成分和作用機制研究

胡 靜1，楊媛媛2，任 慧1，崔小敏1，李 寧1，曲 彤1，陳志永1*

1. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710061 2. 西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054

目的 研究光葉丁公藤與3個潛在代用品多花丁公藤、凹脈丁公藤、大果飛蛾藤治療類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的差異性成分和潛在作用機制。采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法（UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS）分析光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分；結合Swiss Target Prediction、DisGeNET、OMIM、TTD等數(shù)據(jù)庫獲得差異成分治療RA的作用靶點；采用STRING數(shù)據(jù)庫構建共有靶點互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡模型，采用Cytoscape 3.6.0軟件進行可視化處理并分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)篩選出核心靶點；通過DAVID數(shù)據(jù)庫和R語言軟件對靶點進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，采用Cytoscape 3.6.0軟件構建“藥材-差異成分-靶點-通路（H-C-T-P）”網(wǎng)絡圖并進行分析，探討光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分治療RA的潛在作用機制。從光葉丁公藤及3個潛在代用品中共鑒定60個成分，其中差異成分35個，共涉及348個靶點。與RA相關的差異成分有18個，得到差異成分-RA共同靶點153個。GO和KEGG富集分析結果顯示光葉丁公藤及3個潛在代用品可能通過芒柄花素、丁公藤黃素E、圣草酚、-反式-對香豆酰酪胺、秦皮乙素共5個活性差異成分作用于RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、雙特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1（dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1，MAP2K1）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α亞型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）等32個靶點，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路等5個信號通路發(fā)揮治療RA的作用。初步明確了光葉丁公藤及3個潛在代用品治療RA的差異成分、關鍵靶點和核心通路；光葉丁公藤和大果飛蛾藤所鑒定的共有化學成分數(shù)量和H-C-T-P網(wǎng)絡圖中度值較其他2個潛在代用品高，說明大果飛蛾藤更適合做光葉丁公藤代用品；為瀕危中藥代用品開發(fā)提供了相對可靠的新策略。

丁公藤；差異性成分；網(wǎng)絡藥理學；類風濕性關節(jié)炎；多花丁公藤；凹脈丁公藤；大果飛蛾藤；芒柄花素；丁公藤黃素E；圣草酚；-反式-對香豆酰酪胺；秦皮乙素

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、以炎性滑膜炎為主的全身性自身免疫性疾病。其以手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥為特征，常伴有關節(jié)外器官受累及血清類風濕因子陽性，可以導致關節(jié)畸形及功能喪失[1]。Yamamoto等[2]研究發(fā)現(xiàn)，機體的免疫網(wǎng)絡失衡，成纖維樣滑膜細胞的類腫瘤樣增殖和細胞內(nèi)大量分泌金屬蛋白酶和促炎性細胞因子等，是造成RA關節(jié)內(nèi)炎性細胞聚集、滑膜組織增生、骨及軟骨降解和破壞的主要因素。目前臨床上常規(guī)治療RA主要為西藥，如非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）、慢作用抗風濕藥物（slow-acting antirheumatic drugs，SAARDs）、糖皮質激素、生物制劑等[3]。但是，化學藥所帶來的一系列不良反應[4]使得具有辨證施治、系統(tǒng)調(diào)節(jié)及不良反應小等特點[5]的中醫(yī)藥治療越來越受到人們的重視。

丁公藤藥材最早見于《本草拾遺》，其在《中國藥典》2020年版收載品種為旋花科丁公藤屬植物丁公藤Benth. 或光葉丁公藤Craib的干燥藤莖，具有祛風勝濕、消腫止痛的功效，主治風濕痹痛、風濕性關節(jié)炎、跌打損傷等癥[6-7]。近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化以及臨床需求量的快速增長，丁公藤和光葉丁公藤資源已經(jīng)近于枯竭，無法滿足人們的用藥需求，大果飛蛾藤Henmsl. 現(xiàn)已成為丁公藤的主流替代品種及事實上《中國藥典》所載丁公藤的代用品[8-9]。另據(jù)文獻報道，旋花科植物多花丁公藤Merr.、凹脈丁公藤Merr. et Chun.與丁公藤、光葉丁公藤成分近似，提示具有作為丁公藤藥材新基原/代用品的潛力[10]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)光葉丁公藤和大果飛蛾藤、多花丁公藤、凹脈丁公藤等3個潛在代用品主成分近似，并建立了4種藥材中8個共同成分的HPLC含量測定方法[11-12]。但光葉丁公藤與3個潛在替代品的化學成分差異，及差異性成分對治療RA的影響尚未得到系統(tǒng)闡釋。

本研究構建了有公開發(fā)表文獻支撐的旋花科丁公藤屬和飛蛾藤屬植物化學成分數(shù)據(jù)庫，在該數(shù)據(jù)庫的基礎上采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS）聯(lián)用技術對光葉丁公藤及3個潛在代用品的化學成分進行快速鑒定和確證，得到光葉丁公藤及3個潛在代用品的化學成分并分析差異成分；采用網(wǎng)絡藥理學的方法預測與篩選差異性成分治療RA的作用靶點，系統(tǒng)闡釋成分差異可能造成的機制差異。本研究為丁公藤藥材潛在代用品開發(fā)提供了實驗支持，研究技術與方法為瀕危中藥代用品開發(fā)提供了示范。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UPLC-Q Exactive Focus液質聯(lián)用系統(tǒng)：Thermo Q Exactive型質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司），Ultimate3000超高效液相色譜系統(tǒng)（美國戴安公司），Xcalibur 4.0工作站（美國賽默飛世爾科技公司），CD（Compound discovery，2.1）化合物分析鑒定軟件（美國賽默飛世爾科技公司）；色譜柱：Thermo Accucore aQ RP18（美國賽默飛世爾科技公司）；KQ-100型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；BS210S型萬分之一、BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥材與試劑

對照品東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、新綠原酸、傘形花內(nèi)酯、秦皮乙素和咖啡酸（上海圻明生物科技有限公司，批號分別為161208、1701904、17062003、18010202、18092803、17122804，質量分數(shù)均≥98%），東莨菪苷、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、（四川維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq20021510、wkq20082705、wkq20020403、wkq20021003、wkq20031101，質量分數(shù)均≥98%）。色譜純甲醇（Thermo Fisher Scientific，美國）、色譜純甲酸（Sigma-Aldrich，美國），均為LC-MS級，水為超純水（屈臣氏蒸餾水），其他試劑均為分析純。

光葉丁公藤（采自廣東省陽西縣，批號20111020；購自緬甸克欽邦，批號20121207；采自海南，批號20101102）、多花丁公藤（采自海南，批號20110918）、凹脈丁公藤（采自海南，批號20111023；采自海南，批號20131121）、大果飛蛾藤（購自南寧藥材市場，批號20130717；佛山馮了性藥業(yè)有限公司提供，批號20110829；購自廣西，批號20130120；佛山馮了性藥業(yè)有限公司提供，批號20130916；購自海南，批號20120825）清洗、切片、干燥并保存?zhèn)溆?，?jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員分別鑒定為旋花科植物光葉丁公藤Craib、多花丁公藤Merr.、凹脈丁公藤Merr. et Chun.和大果飛蛾藤Henmsl.的干燥藤莖。

2 方法

2.1 光葉丁公藤及3個潛在代用品的成分分析

2.1.1 樣品的制備

（1）供試品溶液制備[13]：精密稱取光葉丁公藤及3個潛在代用品的樣品粉末（過40目篩）0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中。精密加入80%甲醇水50 mL，稱定質量。常溫下超聲處理30 min（40 kHz，400 W），放冷，用80%甲醇水補足損失的質量。搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL轉移至10 mL量瓶中，40%甲醇水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

（2）對照品溶液制備[13]：取各對照品約1.0 mg，精密稱定并置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制備成0.1 mg/mL的單一對照品儲備液；分別量取上述儲備液適量，混合后用純甲醇稀釋，最終制備成各對照品質量濃度均為1 μg/mL的混合對照品溶液。以上對照品溶液均置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 UPLC-Q-Orbitrap分析條件 色譜條件[13]：Thermo Accucore aQ RP18色譜柱（150 mm×2.1 mm, 2.6 μm）；柱溫為30 ℃；進樣量為3 μL；體積流量0.3 mL/min；二元梯度洗脫：流動相為甲醇（A）- 0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～12 min，5%～25% A；12～20 min，25%～30% A；20～28 min，30%～38% A；28～40 min，38%～42% A。

質譜條件[13]：離子源為HESI，正負離子檢測模式；鞘氣流量為45 arb，輔助氣流量為15 arb，噴霧電壓為3500 V；毛細管溫度為350 ℃；霧化溫度為320 ℃；掃描模式為Full MS/dd-MS，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS分辨率為17 500，掃描范圍為/100～1200。MS/MS模式時所用碰撞能梯度為20、40 eV。

2.1.3 LC/MS數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采集在Xcalibur 4.0工作站進行。檢索國內(nèi)外文獻自建丁公藤屬、飛蛾藤屬植物化學成分數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化合物精確相對分子質量、二級碎片信息（差異設定＜5×10?6），通過在線檢索、自建成分庫檢索及對照品比對，進行化學成分結構鑒定。

2.2 網(wǎng)絡藥理學研究

2.2.1 光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分整理 對5批大果飛蛾藤、3批光葉丁公藤、2批凹脈丁公藤、1批多花丁公藤進行了成分鑒定，成分表征過程中成分的選取均盡量綜合多批次樣品質譜分析結果。將以上批次光葉丁公藤及3個潛在代用品鑒定的化學成分進行歸類，找出共有成分和差異成分，采用Cytoscape 3.6.0軟件展示，成分度值（degree）＜4為差異成分。

2.2.2 關鍵靶點的富集 利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）獲取差異成分的2D結構并下載其sdf文件保存?zhèn)溆?，將sdf文件導入Swiss Target Prediction（http://www. swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中預測差異成分的靶點，去掉重復靶點后即得差異成分潛在靶點。在TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https:// www.Drugbank.ca/）和DisGeNET（https://www.d- isgenet.org/）數(shù)據(jù)庫查詢RA相關靶點，去掉重復值即得RA相關靶點。取每一個藥材的差異成分作用靶點與疾病相關靶點交集，獲得差異成分治療風濕性關節(jié)炎的潛在關鍵靶點。

2.2.3 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建 將“2.2.2”項差異成分和RA相映射得到的共同靶點在STRING平臺進行PPI網(wǎng)絡分析，并將基本設置（Basic Settings）中的網(wǎng)絡邊緣設置為置信度（confidence）；互作資源（active interaction sources）設置為文本挖掘（Textmining）、實驗（Experiments）、數(shù)據(jù)庫（Databases）、共表達（Co-expression）、鄰近（Neighborhood）、基因融合（Gene Fusion）和共存（Co-occurrence）；所需的最低互作分數(shù)（minimum required interaction score）設置為最高置信度（highest confidence）0.900進行PPI分析。應用Cytoscape 3.6.0軟件繪制共同靶點互作網(wǎng)絡圖，并進行分析。

2.2.4 基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 為了探索光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分治療RA潛在靶點的相關信號通路，將差異成分治療RA的靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf. gov/home.jsp），限定物種為人，設定閾值＜0.05，進行GO分析和KEGG通路富集分析，篩選出光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分治療RA的重要生物進程和信號通路。

2.2.5 “藥材-差異成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建與分析 由“2.2.4”項篩選出KEGG通路富集分析中基因富集數(shù)量前20的通路，通過查閱文獻，再篩選出可能與治療RA相關的通路，找出富集在這些通路上的差異成分治療RA的潛在靶點，并找出對應的差異成分及歸屬藥材。將藥材-差異成分、差異成分-靶點、靶點-通路數(shù)據(jù)表導入Cytoscape 3.6.0軟件，運用“Merge”功能得到3個數(shù)據(jù)表的交集，即藥材- 差異成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖。

3 結果

3.1 差異成分的獲取

UPLC/Q Exactive Focus MS/MS分析得到光葉丁公藤及3個潛在代用品的總離子流圖，見圖1。從光葉丁公藤及3個潛在代用品中共預測了60個成分，其中有11個化合物通過與對照品比對明確識別。光葉丁公藤、凹脈丁公藤、多花丁公藤和大果飛蛾藤分別鑒定49、37、39和47個成分，各化合物信息見表1。圖2為光葉丁公藤及3個代用品各成分含量示意圖，顏色越深代表相應成分質譜峰面積越大。在樣品稱樣量相差小于0.005 0 g條件下，相應成分質譜峰面積越大代表該成分在該藥材中的含量越高。其中化合物6、8、12、15、24、35、42、51顏色較深、峰面積較大，分別為新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，與文獻報道的丁公藤屬植物主成分一致[11-12]。共有成分和差異成分用Cytoscape 3.6.0軟件展示出來，共有成分25個，差異成分35個，見圖3。

圖1 光葉丁公藤(A)、多花丁公藤(B)、凹脈丁公藤(C)、大果飛蛾藤(D)在正離子和負離子模式下的基峰色譜圖

3.2 差異成分靶點獲取及與RA靶點映射分析

基于“3.1”項下所識別的差異成分，本研究采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對35個差異成分進行反向預測靶點，共得到715個靶點，去掉未預測到靶點的化合物及重復靶點后，共得到光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分18個，潛在靶點348個。通過TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索“rheumatoid arthritis”，繪圖軟件將差異成分反向找靶所得到的348個靶點映射到RA相關靶點，即得光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分抗RA的潛在作用靶點共153個，見圖4。

表1 光葉丁公藤及3個潛在代用品化學成分的鑒定

Table 1 Identification of chemical compounds in Erycibe schmidtii and three substitutes

序號tR/min實測值(m/z)理論值(m/z)模式誤差(×10?6)分子式碎片離子(m/z)化合物名稱歸屬 10.97144.101 5144.101 9[M＋H]+?2.77C7H13NO2126.091 0, 108.080 6包公藤丙素或凹脈丁公藤堿ABCD 21.00267.065 6267.065 2[M－H]?1.50C16H12O4191.054 4, 113.023 8芒柄花素ABC 31.38186.112 8186.112 5[M＋H]+1.61C9H15NO3144.101 1, 108.080 1包公藤甲素ACD 44.05315.123 5315.122 7[M－H]?2.54C18H20O5152.010 4, 108.020 9丁公藤黃素EBCD 54.52153.017 8153.018 2[M－H]??3.27C7H6O4141.911 0, 123.007 43,4-二羥基苯甲酸ABCD 6*6.07353.086 3353.086 8[M－H]??1.42C16H18O9191.054 8, 179.033 7,173.044 0, 135.044 2新綠原酸ABCD 78.82 529.134 1[M－H]?4.85C26H26O12191.059 2, 179.035 7, 173.044 2, 135.045 23,5-二咖啡酰奎寧酸甲酯或3,4-二咖啡?？鼘幩峒柞セ?,5-二咖啡?？鼘幩峒柞 8*9.42 355.102 4[M＋H]+?2.82C16H18O9193.049 3, 178.025 9,165.054 3, 133.028 2東莨菪苷ABCD 99.43193.049 7193.049 5[M＋H]+?1.55C10H8O4178.025 8, 133.028 6東莨菪內(nèi)酯同分異構體ABCD 109.51 211.060 1[M－H]?4.26C10H12O5196.038 2, 181.050 4, 163.039 6, 153.055 63-(2,4,5-三羥基苯基)丙酸甲酯ABCD 1110.22 355.102 4[M＋H]+?2.82C16H18O9163.038 9, 145.028 5, 135.044 4東莨菪苷同分異構體ABCD 12*10.23353.086 3353.086 8[M－H]??1.42C16H18O9191.056 0, 173.043 9, 161.022 3, 135.044 0綠原酸ABCD 13*10.24179.033 4179.033 9[M－H]??2.79C9H8O4135.043 5咖啡酸ABCD 14*10.71177.018 2177.019 3[M－H]?3.87C9H6O4133.028 3, 104.025 3秦皮乙素ABD 15*11.78353.086 3353.086 8[M－H]??1.42C16H18O9191.054 8, 173.045 2, 161.023 2隱綠原酸ABCD 1611.84529.1366529.134 1[M－H]?4.73C26H26O12367.102 1, 191.056 8, 173.044 53,5-二咖啡酰奎寧酸甲酯或3,4-二咖啡?？鼘幩峒柞セ?,5-二咖啡酰奎寧酸甲酯B 17*11.86163.038 6163.038 8[M＋H]+?1.23C9H6O3145.028 2, 135.043 8, 117.033 6傘形花內(nèi)酯ABCD 1812.47529.1366529.134 1[M－H]?4.73C26H26O12374.498 6, 191.059 5, 173.044 13,5-二咖啡?？鼘幩峒柞セ?,4-二咖啡酰奎寧酸甲酯或4,5-二咖啡?？鼘幩峒柞 1913.22337.106 2337.107 1[M－H]??2.67C20H18O5191.054 8, 173.034 4, 119.049 4刺桐素BACD 2014.57367.101 7367.102 4[M－H]??1.91C17H20O9191.054 5, 173.043 8, 135.035 6綠原酸甲酯ACD 2114.64665.173 0665.171 2[M－H]?2.71C30H34O17197.045 4, 176.011 3, 121.029 3丁公藤苷A或丁公藤苷B或丁公藤苷CAD 2215.38581.220 0581.222 9[M－H]??4.99C28H38O13419.167 4, 373.126 7, 233.079 6, 153.054 5南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或其同分異構體BC 2315.89581.220 0581.222 9[M－H]??4.99C28H38O13419.168 8, 373.125 3, 233.079 7, 153.054 8南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或其同分異構體BC 24*16.29193.049 7193.049 5[M＋H]+?1.55C10H8O4178.025 5, 149.059 1, 137.059 5, 133.028 1東莨菪內(nèi)酯ABCD 2516.93695.180 4695.181 8[M－H]??2.01C31H36O18359.096 6, 197.044 1, 173.043 7, 153.053 8丁公藤苷FABCD 2618.89665.173 0665.171 2[M－H]?2.71C30H34O17197.045 5, 191.034 8, 153.055 6, 121.029 3丁公藤苷A或丁公藤苷B或丁公藤苷CAD 2719.08635.159 7635.160 7[M－H]??1.57C29H32O16191.033 4, 167.033 4, 121.043 3丁公藤苷D或丁公藤苷EAD 2820.61627.189 1627.192 0[M－H]??4.62C28H36O16447.112 1, 429.102 0, 315.072 3, 197.045 7丁公藤苷N或貓尾木酚苷B或二者同分異構體A 2920.74533.129 5533.129 0[M－H]?0.94C25H26O13371.097 6, 353.086 7, 335.076 8, 197.045 3, 173.045 2, 161.024 1,135.045 05-O-咖啡?；?4-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?3-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡酰基-5-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?4-O-香草?？鼘幩峒柞BCD 3020.83635.159 7635.160 7[M－H]??1.57C29H32O16327.314 5, 191.034 9, 167.034 9, 123.045 0丁公藤苷D或丁公藤苷EA

續(xù)表1

序號tR/min實測值(m/z)理論值(m/z)模式誤差(×10?6)分子式碎片離子(m/z)化合物名稱歸屬 3121.94711.246 4711.249 5[M－H]??4.06C33H44O17582.574 6, 417.156 3, 387.109 4, 233.066 1, 181.050 4, 125.024 1obtusifoside AACD 3222.07595.203 6595.202 1[M－H]?2.52C28H36O14415.193 6, 385.128 7, 233.082 3, 181.050 6aketrilignoside B或其同分異構體ABD 3322.11665.173 0665.171 2[M－H]?2.71C30H34O17197.045 5, 153.055 6, 121.029 2丁公藤苷A或丁公藤苷B或丁公藤苷CAD 3422.13627.189 1627.1920[M－H]??4.62C28H36O16167.034 4, 152.011 8, 123.045 5, 108.021 7丁公藤苷N或貓尾木酚苷B或二者同分異構體A 35*22.60515.116 4515.118 4[M－H]??3.88C25H24O12353.085 1, 191.054 7, 179.033 6, 173.044 1, 161.023 3, 135.044 2異綠原酸BABCD 3622.75595.203 6595.202 1[M－H]?2.52C28H36O14415.142 1, 385.130 0, 233.082 0, 181.050 5aketrilignoside B或其同分異構體AD 3722.76657.204 2657.202 5[M－H]?2.59C29H38O17375.059 2, 197.045 7, 153.055 6, 121.029 4合歡諾苷A或1-O-[6-O-(5-O-丁香?；? β-D-呋喃芹糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-3,4,5-三甲氧基苯AD 3823.51691.189 5691.186 9[M－H]?3.76C32H36O17223.060 9, 191.035 2, 149.024 1obtusifoside F或obtusifoside GAD 3923.80627.189 1627.192 0[M－H]??4.62C28H36O16375.069 5, 335.037 5, 201.016 9, 179.034 9丁公藤苷N或貓尾木酚苷B或二者同分異構體A 4023.86657.204 2657.202 5[M－H]?2.59C29H38O17375.068 3, 197.045 5, 182.021 9, 153.055 7, 121.029 4合歡諾苷A或1-O-[6-O-(5-O-丁香酰基- β-D-呋喃芹糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-3,4,5-三甲氧基苯AD 4123.97533.129 5533.1290[M－H]?0.94C25H26O13371.097 6, 197.045 3, 173.045 2, 153.055 5, 121.029 25-O-咖啡?；?4-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?3-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡酰基-5-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡酰基- 4-O-香草?？鼘幩峒柞BCD 42*24.02515.116 4515.118 4[M－H]??3.88C25H24O12353.085 3, 191.054 8, 179.033 7, 135.044 3異綠原酸AABCD 4324.36287.054 8287.055 0[M－H]??0.70C15H12O6243.064 8, 199.074 6, 163.038 0, 137.022 3圣草酚D 4424.79691.189 5691.186 9[M－H]?3.76C32H36O17515.115 5, 353.085 1, 255.064 2, 191.054 7, 179.033 6, 135.044 2obtusifoside F或obtusifoside GAD 4525.57282.112 2282.112 5[M－H]??1.06C17H17O3N282.112 2, 145.027 8, 136.075 0, 119.048 5N-反式-對香豆酰酪胺ABD 4626.27683.216 8683.218 2[M－H]??2.05C31H40O17223.061 3, 205.050 4, 179.071 3, 164.048 2, 149.024 41-O-[6-O-(5-O-芥子?；?β-D-呋喃芹糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-3,4,5-三甲氧基苯酚或其同分異構體AB 4726.68312.123 8312.123 8[M－H]?0C18H19O4N190.050 8, 178.050 6, 148.052 8, 135.045 1N-反式阿魏酰酪胺或N-順式阿魏酰酪胺ABCD 4826.73683.216 8683.218 2[M－H]??2.05C31H40O17553.060 9, 375.071 2, 205.050 5, 179.071 4, 149.024 41-O-[6-O-(5-O-芥子?；?β-D-呋喃芹糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-3,4,5-三甲氧基苯酚或其同分異構體AB 4927.20559.1426559.144 6[M－H]??3.58C27H28O13353.085 2, 223.059 5, 191.054 7, 179.033 6, 135.044 24-O-咖啡?；?3-O-芥子酰奎寧酸或5-O-咖啡?；?4-O-芥子?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?3-O-芥子?？鼘幩酇BCD 5027.91701.303 5701.301 5[M－H]?2.85C33H50O16603.106 3, 304.100 4, 197.045 6, 179.034 4, 153.055 4丁公藤苷IA 51*28.51515.116 4515.118 4[M－H]??3.88C25H24O12353.085 8, 191.054 8, 179.033 6, 173.044 2, 135.044 1異綠原酸CABCD 5228.62533.129 5533.129 0[M－H]?0.94C25H26O13371.097 8, 197.045 4, 173.045 2, 137.024 25-O-咖啡?；?4-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?3-O-丁香酰奎寧酸或4-O-咖啡?；?5-O-丁香?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?4-O-香草?？鼘幩峒柞BCD 5329.28559.142 6559.144 6[M－H]??3.58C27H28O13397.110 9, 223.059 5, 191.054 5, 173.043 9, 149.023 14-O-咖啡?；?3-O-芥子酰奎寧酸或5-O-咖啡?；?4-O-芥子?？鼘幩峄?-O-咖啡?；?3-O-芥子?？鼘幩酇BCD

續(xù)表1

*通過對照品對比確認；藥材歸屬：A-光葉丁公藤 B-多花丁公藤 C-凹脈丁公藤 D-大果飛蛾藤

*Confirmed by comparison with the reference substances; Herb attribution: A-B-C-D-

顏色由黃至紅代表含量的增大，白色代表該成分在對應藥材中未被檢出即峰面積為0

3.3 差異成分治療RA潛在靶點PPI網(wǎng)絡構建及潛在靶點拓撲參數(shù)分析

將“3.2”項差異成分和RA相映射得到的共同靶點在STRING平臺進行PPI網(wǎng)絡分析。為對PPI的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)進一步分析，將其導入Cytoscape 3.6.0中重新構建，見圖5。其中，碳酸桿酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）、鉀電壓門控通道亞家族A成員3（potassium voltage-gated channel subfamily A member 3，KCNA3）、血清對氧磷酶/芳基酯酶1（serum paraoxonase/arylesterase 1，PON1）等34個靶標節(jié)點未與其他靶標節(jié)點構成相互作用，因此Cytoscape 3.6.0構建的PPI網(wǎng)絡中共顯示119個節(jié)點，521條邊。應用NetworkAnalyzer對其進行分析，利用各節(jié)點的度值設置節(jié)點大小和顏色，其節(jié)點的度值由小變大，則節(jié)點形狀由小變大，顏色由黃變紅，節(jié)點越大、顏色越紅表示度值越大，說明在網(wǎng)絡中越關鍵；“combined score”設置邊的粗細，邊越粗，表示“combined score”越大，說明靶點之間的連接關系越緊密。

三角形節(jié)點表示差異成分，菱形節(jié)點表示共有成分

圖4 差異成分抗RA靶點圖

在Cytoscape 3.6.0軟件中對候選靶點PPI網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)進行分析，選取度值、接近中心性、中介中心性均大于均值的靶點作為關鍵靶點（表2）。候選靶點PPI網(wǎng)絡分析結果顯示，119個潛在靶標節(jié)點的度值均值為8.6，接近中心性均值為0.396 9，中介中心性均值為0.014 0，共有23個靶點的3個網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)同時大于相應的均值。這23個靶點包括脾酪氨酸激酶（tyrosine-protein kinase，SYK）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase 1，CDK1；Cyclin-dependent kinase 5，CDK5）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α亞型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）、AP-1轉錄因子（transcriptionfactor AP-1，JUN）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質金屬蛋白酶（72 kDa ype IV collagenase，MMP2；matrix metalloproteinase-9，MMP9）、炎癥因子白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等，不僅在網(wǎng)絡關系中有重要作用，在差異成分治療RA的過程中也起到了重要作用，可作為研究光葉丁公藤與3個潛在代用品差異成分治療RA的關鍵靶點基因。

圖5 差異成分治療RA的PPI

表2 差異成分治療RA的候選靶點拓撲學參數(shù)

Table 2 Topology parameters of candidate targets for discriminatory components in treatment of RA

靶點中文全稱ID度值接近中心性中介中心性 SRC原癌基因酪氨酸蛋白激酶P12931440.567 30.174 3 PIK3CA磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型P42336410.546 30.119 8 MAPK1絲裂原活化蛋白激酶1P28482330.526 80.106 5 HRAS肉瘤病毒癌基因P01112330.500 00.063 3 AKT1RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶P31749300.508 60.104 7 VEGFA血管內(nèi)皮生長因子AP15692250.513 00.098 7 APPβ-淀粉樣蛋白前體蛋白P05067220.485 60.129 0 JUNAP-1轉錄因子P05412200.473 90.037 2 RELA轉錄因子p65Q04206200.493 70.043 5 PRKCD蛋白激酶Δ型Q05655190.457 40.021 7 EGFR表皮生長因子受體P00533180.468 30.032 2 MAP2K1雙特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1Q02750180.466 40.025 2 ESR1雌激素受體P03372170.470 10.062 1 F2凝血酶原P00734160.460 90.042 6 MAPK14絲裂原活化蛋白激酶14Q16539160.450 40.015 7 CCND1G1/S-特異性細胞周蛋白-D1P24385120.412 60.017 4 CDK1細胞周期蛋白依激酶1P06493120.414 00.043 8 ERBB2酪氨酸激酶受體2P04626110.435 40.021 5 PLG纖溶酶原P00747110.400 00.036 4 IL4白細胞介素-4P0511290.402 70.039 4 CDK5細胞周期蛋白依激酶5Q0053590.411 10.020 8 MMP9基質金屬蛋白酶9P1478090.408 30.031 4 MMP2基質金屬蛋白酶2P0825390.411 10.029 8

3.4 GO生物進程分析和KEGG通路富集分析

為了更系統(tǒng)地深入研究光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分對RA的作用機制，將差異成分治療RA的153個靶蛋白通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析，共得到GO條目284個，其中生物過程（biological process，BP）201個，分子功能（molecular function，MF）47個，細胞組分（cellular component，CC）36個，BP、MF、CC分別占比70.77%、16.55%、12.68%。以＜0.01為篩選條件，選取值最小的排名前10的生物進程，根據(jù)富集基因數(shù)的大小進行排序并作圖，見圖6。結果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白在BP方面主要涉及血管生成（angiogenesis）、固有免疫應答（innate immune response）、細胞增殖的調(diào)節(jié)（regulation of cell proliferation）、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）等；在MF方面主要涉及ATP結合（ATP binding）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、受體結合（receptor binding）、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性（non-membrane spanning protein tyrosine kinase activity）等；在CC方面主要涉及細胞外外切體（extracellular exosome）、細胞外間隙（extracellular space）、細胞液（cytosol）、細胞外基質（extracellular matrix）、質膜細胞質側的外源成分（extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane）等。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫平臺對差異成分治療RA的靶蛋白進行KEGG富集分析，共得到了102條通路。除去諸如前列腺癌、大腸癌和胰腺癌等具體疾病或其他無關條目后，以＜0.01為篩選條件，選取其中顯著性最高的20條通路用R語言軟件進行富集分析。見圖7，氣泡圖的橫坐標（gene radio）表示每條通路中涉及的核心靶點占該通路總靶點數(shù)的比率；氣泡大小表示該通路中涉及到的核心靶點數(shù)；氣泡顏色由綠至紅表示值越來越小，即該通路的顯著性越高。

圖6 GO功能富集分析

圖7 KEGG功能富集分析(前20)

3.5 光葉丁公藤及3個潛在代用品“藥材-差異成分-靶點-通路（H-C-T-P）”網(wǎng)絡構建及分析

綜合GO分析和KEGG通路富集分析的結果，分析篩選出可能具有治療RA作用的通路，并與差異成分和潛在靶點一一對應，即通路與潛在靶點對應，潛在靶點與差異活性成分對應，差異活性成分與藥材對應。將相關數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建光葉丁公藤及3個潛在代用品“藥材-差異成分- 靶點-通路”網(wǎng)絡圖，共有111個節(jié)點（20條通路、70個靶點、17個差異成分、4個藥材）和455條邊。采用Network Analyzer對網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)進行分析，并用Degree Sorted Circle Layout對節(jié)點進行布局見圖8，其節(jié)點的度值越大，節(jié)點越大，說明在網(wǎng)絡中越關鍵。

應用NetworkAnalyzer對H-C-T-P網(wǎng)絡拓撲參數(shù)進行分析，結果如下：70個潛在靶標節(jié)點的度值均值為4.1、接近中心性均值為0.349 7、中介中心性均值為0.003 5，共有32個靶點的3個網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)同時大于相應的均值，分別為AKT1、絲裂原活化蛋白激酶（dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1，MAP2K1；mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1；mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、PIK3CA、PIK3CD、PIK3CG、EGFR、轉錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、JUN、MMP2、胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、VEGFA、G1/S特異性細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin-D1，CCND1）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR）、SYK、腺苷受體（adenosine receptor A2a，ADORA2A；adenosine receptor A3，ADORA3）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, endothelial，NOS3）、細胞周期蛋白依賴激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、CDK4、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor 1，SERPINE1）、胎盤生長因子（placenta growth factor，PGF）、MMP9、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1； Estrogen receptor beta，ESR2）、鈣調(diào)素-1（calmodulin-1，CALM1）、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2，BCL2）、IL2、IL4、Bcl-2樣蛋白1（Bcl-2-like protein 1，BCL2L1）；17個差異活性成分的度值均值為10.6、接近中心性均值為0.372 8、中介中心性均值為0.030 7，共有5個差異成分的3個網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)同時大于相應的均值，分別為化合物2、43、45、14、19；20條通路的度值均值為13.6、接近中心性均值為0.382 5、中介中心性均值為0.026 0，共有5個信號通路的3個網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)同時大于相應的均值，分別為磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、小G蛋白Rap信號通路（Rap1 signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、缺氧誘導因子信號通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）。以上分析結果顯示，光葉丁公藤及3個潛在代用品的差異成分靶點分布于不同的通路并協(xié)同發(fā)揮治療RA作用，同時關鍵靶點也分布在不同通路上表明富集的RA通路可作為光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分治療RA的重要通路。

圓形節(jié)點表示藥材，菱形節(jié)點表示差異成分，平行四邊形節(jié)點表示靶點，“V”形表示信號通路

另外，4個藥材所連接的差異活性成分數(shù)量分別為光葉丁公藤12個、大果飛蛾藤12個、凹脈丁公藤4個、多花丁公藤8個，可見光葉丁公藤和大果飛蛾藤的化學成分在數(shù)量和活性上更為相似。

4 討論

4.1 差異性成分分析

本研究以光葉丁公藤及3個潛在代用品為研究對象，基于UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS平臺，共鑒定了60個化學成分，其中差異成分35個，為分析其潛在差異藥效成分奠定了物質基礎。在35個差異成分中，化合物3為生物堿類，化合物2、4、19、43為黃酮類，化合物7、16、18、20、55、57、59、60為奎尼酸衍生物；化合物14、21、26、27、30、33為香豆素類，化合物22、23、31、32、36、38、44為木脂素類，化合物45為酰胺類；化合物28、34、37、39、40、46、48、50為其他類。結合表1和圖2可知，化合物43為大果飛蛾藤專屬成分，化合物7、16、18為多花丁公藤專屬成分，化合物28、30、39、50為光葉丁公藤專屬成分，凹脈丁公藤無專屬化合物。專屬成分的鑒別將為馮了性風濕跌打藥酒、藤絡寧膠囊、丁公藤注射液等中成藥中丁公藤藥材投料品種的快速鑒別提供依據(jù)。另外，在35個差異性成分中，光葉丁公藤與多花丁公藤、凹脈丁公藤、大果飛蛾藤分別有6、5、16個共同化合物。因此，理論上可認為大果飛蛾藤與光葉丁公藤在化學成分上更加近似，具有更大的成為丁公藤藥材代用品的潛力。

4.2 差異性成分網(wǎng)絡藥理學研究

通過Cytoscape 3.6.0軟件對H-C-T-P網(wǎng)絡圖進行網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)5個化合物的3個拓撲參數(shù)均大于均值。這5個化合物主要存在于光葉丁公藤和大果飛蛾藤中，具有抗炎鎮(zhèn)痛、軟骨保護、健骨等藥理作用。芒柄花素（2）可抑制骨組織MMP-9的合成和分泌、破骨細胞的骨吸收，同時降低腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及IL6水平，具有明顯的健骨作用[14]；圣草酚（43）可通過抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路，激活核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）/ 血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路，發(fā)揮抑制IL-1β刺激的軟骨細胞炎癥效應的作用[15]；-反式-對香豆酰酪胺（45）和刺桐素B（19）均可抑制脂多糖誘導的RAW 264.7細胞釋放一氧化氮，發(fā)揮抗炎作用[16]；秦皮乙素（14）在小鼠耳腫脹和醋酸扭體實驗中表現(xiàn)出顯著的抗炎活性和外周鎮(zhèn)痛作用[17]，能夠通過抑制MMP的合成、分泌及其活性，治療骨關節(jié)炎和風濕性關節(jié)炎造成的軟骨損傷[18]。

將光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分靶點映射到RA疾病靶點并構建網(wǎng)絡，獲得153個共同靶點。進一步PPI網(wǎng)絡分析顯示SRC、PIK3CA、MAPK1等23個靶點最為重要，提示其為光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分治療RA的關鍵靶點。這些靶點主要包含絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶、磷脂酰肌醇-3激酶、炎癥因子等。KEGG通路富集分析整合預測結果顯示，RA發(fā)病機制與關鍵靶點及其所分布的通路有密切關聯(lián)，這與光葉丁公藤及3個潛在代用品差異成分及其關鍵靶點的研究結果和其與RA間關系的相關研究基本一致。

SYK是蛋白酪氨酸激酶（protein-tyrosine kinase，PTK）中的一種，是一種非受體型的酪氨酸激酶[19]。SYK在B細胞受體Fc受體等免疫信號的傳導中起重要作用[20]。而B細胞等免疫細胞在RA發(fā)病中發(fā)揮了關鍵作用，有研究應用口服型SYK抑制劑fostamatinib（R788）作用于實驗小鼠后，可觀察到其能夠控制類風濕關節(jié)炎實驗小鼠的滑膜炎、關節(jié)炎以及骨侵蝕等，證實滑膜組織中的炎癥細胞和SYK水平有關[21]。AKT1是3種密切相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，被稱為Akt激酶，它調(diào)控代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等許多過程，如股骨頭壞死[22]和維持骨量及骨轉化[23-24]等。AKT1還可以促進軟骨內(nèi)骨血管生成和骨化[25]，這對修復RA所造成的關節(jié)損傷有重要作用。PI3K是肌醇與磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）的重要激酶，PIK3CA、PIK3CD、PIK3CG均為PI3K Ι型催化亞單位。PI3K參與多種信號通路，與Akt共同組成的PI3K/Akt信號通路在RA患者的滑膜組織中PI3K表達水平升高，升高的PI3K促進Akt磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路；活化的Akt可磷酸化多種蛋白，介導細胞的生長發(fā)育和血管生成的調(diào)節(jié)[26]，甚至引起PIK3CA相關的過度生長現(xiàn)象[27]。已有動物實驗證明JUN的表達和骨細胞、成骨細胞的凋亡有關，與原發(fā)性骨質疏松關系密切[28]，故JUN可能在RA病程發(fā)展及轉移的過程中起到重要作用。MAPK1、MAPK14等屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，已證實MAPK1能輔助β-雌二醇通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK-1/2）抑制RA滑膜細胞的凋亡和MMF3的釋放，是治療RA的潛在靶點[29]；雌激素不僅對性發(fā)育和生殖功能重要，而且參與RA的病程發(fā)展，阻止健康人向RA發(fā)展[30-31]。ESR1為介導骨內(nèi)雌激素作用的受體，能夠促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞，但是由于雌激素可能同時具有抗炎和促炎特性，所以ESR1是否會加劇骨關節(jié)炎的發(fā)生仍有爭議[32]。VEGFA是血管生成和成骨的有效耦合所必需的，具有促進骨形成減少骨吸收的作用[33]。RA滑膜襯里層VEGF蛋白表達與血管形態(tài)、彎曲血管走行方式及血管密度均呈正相關[34]。EGFR能通過刺激關節(jié)軟骨細胞的增殖發(fā)揮合成代謝的作用[35]；CCND1表達抑制會抑制軟骨細胞增殖[36]；CDKs是一類調(diào)控細胞周期及細胞轉錄的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而RA患者化膜細胞異常增殖可能與CDK1、CDK5的過度表達有關[37]。MMPS是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，是胞外基質降解過程中主要的蛋白酶，參與關節(jié)炎及轉移、細胞外基質的破裂等正常生理過程。研究表明絕經(jīng)后女性血清MMP-2及MMP-9水平隨骨密度的降低呈現(xiàn)升高趨勢，可成為新的反映骨代謝的指標[38]。另外，IL-4等是臨床常見的與炎癥相關的靶點，如IL-4可以抑制炎癥反應[39]。

KEGG富集的20條通路，經(jīng)H-C-T-P網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析表明PI3K-Akt、Rap1、Ras、HIF-1、Estrogen信號通路共5條通路的度值、接近中心性、中介中心性均大于均值。其中PI3K-Akt信號通路與RA滑膜細胞的增殖或凋亡有關[40]。Ras是小分子G蛋白，Rap1為Ras相關蛋白屬于Ras癌基因家族成員之一。Ras信號通路可以增強血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達[41]，表明Ras信號通路可能在RA血管生成中起重要作用；有研究表明Rap1的過度表達會增強T細胞的激活和增加IL-2的產(chǎn)生，可能在RA作用機制中起到免疫調(diào)節(jié)作用[42]；另外，在血小板整合素激活及血小板生成過程中Rap1信號通路也發(fā)揮重要作用[43]。由于RA患者滑膜細胞大量增殖，其關節(jié)腔為缺氧環(huán)境，缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）表達增加。HIF-1信號通路可以調(diào)節(jié)VEGF信號通路，通過上調(diào)VEGF而激活NOS，從而促進血管生成與舒張[44]。Estrogen信號通路與骨骼的生長與重構有關[45]。這5條包括了153個共同靶點中的49個，占32%。故推測光葉丁公藤及3個代用品的差異成分可能是通過與RA相關生物通路中的靶蛋白相作用來維持滑膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，降低炎癥反應、防止和減少關節(jié)的破壞，從而改善患者生活質量。

中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所根據(jù)“親緣關系相近的植物類群具有相似的化學成分”的親緣學理論，尋找出一批藥效非常相似的替代品，如國產(chǎn)蘿芙木、新疆阿魏等[46-47]。本研究在親緣學理論指導下開展丁公藤藥材的代用品開發(fā)，將代用品開發(fā)目標定位于丁公藤、光葉丁公藤的近緣品種，研究結果也切實驗證了親緣學理論。綜上，珍稀瀕危植物光葉丁公藤及3個代用品的差異成分中芒柄花素、圣草酚、-反式-對香豆酰酪胺、刺桐素B及秦皮乙素可能作用于SRC、PIK3CA、MAPK1等23個RA相關靶點，調(diào)控包括PI3K-Akt、Rap1、Ras、HIF-1和Estrogen在內(nèi)的多條信號通路。光葉丁公藤及3個代用品的差異成分通過多靶點、多通路調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控炎癥因子、抑制滑膜細胞增殖、抑制軟骨破壞及促進成骨細胞增殖分化等達到治療RA的目的。本研究系統(tǒng)闡釋了光葉丁公藤及其3個潛在代用品的成分異同，探討了成分差異在治療RA方面可能導致的機制差異。本研究為丁公藤藥材代用品開發(fā)，中成藥中正品丁公藤與潛在代用品投料的快速鑒別提供了依據(jù)。同時，本研究采用的技術與方法為珍稀瀕危中藥代用品開發(fā)研究提供了新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Discriminatory compounds and mechanism ofand three potential substitutes against rheumatoid arthritis

HU Jing1, YANG Yuan-yuan2, REN Hui1, CUI Xiao-min1, LI Ning1, QU Tong, CHEN Zhi-yong1

1. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Xi’an 710061, China 2. Xi’an Institute for Food and Drug Control, Xi’an 710054, China

To clarify the discriminatory compounds and action mechanism ofCraib and three potential substitutes against rheumatoid arthritis (RA).The discriminatory compounds betweenand three potential substitutes were analyzed by UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS. Combined with Swiss target prediction and DisGeNET, OMIM, TTD databases, the common targets for discriminatory compounds in the treatment of RA was obtained. The common targets were imported into the STRING database to construct the network diagram of target interaction, and Cytoscape 3.6.0 software was used to screen out the core targets. The GO and KEGG enrichment analysis of the target were carried out by DAVID database and R language software. The network diagram of Herb-Component-Target-Passway (H-C-T-P) was constructed by Cytoscape 3.6.0 software and analyzed to explore the potential mechanism of the discriminatory components ofand three potential substitutes against RA.A total of 60 components were identified fromand three potential substitutes, including 35 discriminatory components, involving 348 targets. There were 18 components related to RA, and there were 153 common targets for the discriminatory components and RA. GO and KEGG pathway enrichment analysis revealed that five active discriminatory components (formononetin, erycibenin E, eriodictyol,---coumaroyltyramine and esculetin) ofand three potential substitutes acted on AKT1, MAP2K1, PIK3CA and other 32 targets, and may regulate five pathways including PI3K-Akt, Rap1, Ras and so on.The present study preliminarily identified the discriminatory components, key targets and core pathways ofand three potential substitutes in the treatment of RA. The number of common chemical components identified inandand the degree of H-C-T-P network diagram were higher than the other two potential substitutes, which indicate thatis more suitable than other two substitutes. This study provides a relatively reliable strategy for the development of endangered traditional Chinese medicine substitutes.

Benth.; discriminatory compounds; network pharmacology; rheumatoid arthritis;Merr.;Merr.et Chun.;Henmsl.; formononetin; erycibenin E;eriodictyol;--- coumaroyltyramine; esculetin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)16 - 4958 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.005

2021-02-19

國家自然科學基金面上項目（81973419）；陜西省重點研發(fā)計劃一般項目（2022-SF-315）；陜西省中醫(yī)藥管理局青年培優(yōu)項目（2021-PY-003）；陜西省中醫(yī)藥管理局項目（2021-ZZ-JC033）；陜西省中醫(yī)藥研究院“苗圃計劃”一般項目（2021-12）

胡 靜（1988—），女，碩士，主管藥師，研究方向為中藥質量控制與活性成分研究。Tel: (029)85395696 E-mail: huj668@163.com

陳志永（1987—），男，博士，副研究員，研究方向為中藥質量控制與活性成分研究。Tel: (029)85395696 E-mail: chenzy0612@163.com

[責任編輯 王文倩]