花義同 侯長冉 張浩杰 杲霄源

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院乳腺外科，濱州 256600

乳腺癌被認為是一種全身性疾病，是世界上最常見的女性惡性腫瘤，對女性的健康造成嚴重損害［1］。目前，乳腺癌的主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療［2］。盡管乳腺癌治療取得了一定進展，但多藥耐藥仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因［3］。探索多藥耐藥的分子基礎(chǔ)，開發(fā)臨床試劑或策略來預(yù)防耐藥性的發(fā)生是非常重要的。

有許多機制可以誘導(dǎo)癌細胞對細胞毒性藥物不敏感，如藥物靶點的突變或過表達、藥物失活或藥物從細胞流出［4］。一些證據(jù)強烈支持GSTs的過度表達是耐藥的主要機制之一［5］。GST 酶家族可分為α、μ、π、δ 等幾類［6］。谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶π（GST-π）參與解毒的作用，被認為是導(dǎo)致耐藥性的機制之一［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，GST-π 在乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/ADR 細胞中的表達量較高，其活性為原細胞系的 45 倍［8］。目前有研究表明，使用 GST-π 抑制劑逆轉(zhuǎn)GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥對于提高化療藥物的靈敏度以及藥代動力學和藥效學特征是可行的［9］。到目前為止，GST-π的特異性逆轉(zhuǎn)劑非常少，利尿酸成為世界上研究較多的藥物之一［10］。然而，利尿、代謝紊亂和嚴重的過敏反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用［11］。因此，有必要找到合適的逆轉(zhuǎn)劑來逆轉(zhuǎn)GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥。

補骨脂素是一種天然產(chǎn)物，存在于幾種植物中，是補骨脂的主要活性成分［12-13］。有研究表明其具有廣泛的生物活性，包括細胞毒性、藥物毒性等［14］?，F(xiàn)代研究表明，補骨脂素對許多動物和人的腫瘤生長有顯著抑制作用［15］。在本研究中，我們分析了補骨脂素對MCF-7/ADR 細胞具有較強的細胞毒性，并發(fā)現(xiàn)補骨脂素在體外對MCF-7/ADR 細胞也具有抗腫瘤作用［16］。提高了MCF-7/ADR 對阿霉素的靈敏度，這與之前在人類其他癌細胞系中進行的研究一致［17］。

我們實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素實際上可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌 MCF-7/ADR 細胞［16，18］。補骨脂素對多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用已經(jīng)明確，但其機制尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)補骨脂素并沒有降低多藥耐藥基因（MDR1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和肺耐藥蛋白（LRP）的表達，但是發(fā)現(xiàn)它可以顯著降低GST-π 的表達，對基因和蛋白水平有明顯影響。我們推測逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機制可能與GST-π 有關(guān)，因此提出了補骨脂素可以作為GST-π 的抑制劑的假說，然后進行了進一步研究，以確定可能的相關(guān)調(diào)控途徑。

材料與方法

1、試劑

RMPI-1640完全培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、核蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司。Maxima SYBR Green qPCR 及 ReverTra Ace qPCR RT Kit 購自美國 Thermo scientific 公司。GST-π 基因正、反向引物購于上海生工生物有限公司。補骨脂素購于中國生物制品鑒定所。抗體購于美國Proteintech公司。

2、細胞系

細胞系購自南京凱基生物有限公司。

3、細胞培養(yǎng)

將MCF-7/ADR 細胞培養(yǎng)在阿霉素濃度為1 mg/L 的RMPI-1640 完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、濕度100%、體積分數(shù)5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。所有試驗均在細胞對數(shù)生長期進行。

4、細胞活力分析

采用CCK-8法測定補骨脂素和SN50的藥物作用濃度。我們將實驗組分為 4 組（MCF-7/ADR、MCF-7/ADR+P、MCF-7/ADR+SN50、MCF-7/ADR+P+SN50），初步實驗是確定補骨脂素的濃度，并將其應(yīng)用于后續(xù)的實驗，SN50（18 μmol/L）的濃度是從其他文獻中參考而來的［19］。使用CCK-8試劑盒檢測了阿霉素對細胞增殖的影響。將呈對數(shù)生長期的 MCF-7/ADR 細胞（5×103/孔，100 μl）在 96 孔板中培養(yǎng)約8.0 h，使得粘附在培養(yǎng)板上的細胞生長到約50%。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次后，用含有不同藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。加入 10.0 μl CCK-8 溶液，37 ℃條件下孵育3.0 h。在酶標儀上選擇450 nm 波長檢測吸光度值。

5、蛋白免疫印跡分析（Western blot）

采用Western blot 研究不同濃度補骨脂素對GST-π 蛋白表達的影響。用不同濃度的補骨脂素（4 μg/ml、8 μg/ml、12 μg/ml 和 16 μg/ml）處理細胞后，用冷 PBS 洗滌細胞 2 次，然后用裂解液裂解，取上清液測定總蛋白濃度。將等量的蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中，然后進行轉(zhuǎn)膜（100 V，2.0 h），用5%脫脂牛奶室溫下在搖床上封膜1.5 h。將膜與一抗（1：2 000）孵育約8.0 h然后用TBST洗滌3 次，每 5 min 1 次，用稀釋的二抗（1：2 000）在室溫（25 ℃）下孵育約2.0 h。在3 次清洗后（每次5 min）后，使用化學發(fā)光試劑盒對膜進行分析。

6、實時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

采用RT-PCR 技術(shù)檢測不同濃度的補骨脂素對GST-π基因表達的影響。以O(shè)ligo-dTPrimer 為引物按照ReverTra Ace qPCR RT Kit 說明書進行操作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。基因引物序列見表1。制作標準曲線，根據(jù)標準曲線擴增效率的一致性，采用 2-ΔΔCt法計算 GST-π 基因的相對表達量。

表1 基因引物序列

7、免疫熒光

采用免疫熒光技術(shù)探討補骨脂素逆轉(zhuǎn)GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥的作用機制。NF-κB的活性與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)，我們重點關(guān)注NF-κB 信號通路。補骨脂素已被證明是NF-κB 的抑制劑。在MCF-7/ADR 及補骨脂素處理后的MCF-7/ADR細胞中檢測到細胞核NF-κB的表達。

8、統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理。所符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、不同治療組間阿霉素半抑制濃度（IC50）的比較

CCK-8 結(jié)果顯示，SN50（18 μmol/L）［19］和補骨脂素（8 μg/ml）［16］對細胞增殖沒有影響（P>0.05）。CCK-8結(jié)果表明，補骨脂素可以呈現(xiàn)劑量依賴性地抑制MCF-7/ADR 細胞的增殖，這與之前的研究一致。研究了補骨脂素在8 μg/ml和 16 μg/ml 濃度下對 MCF-7/ADR 細胞的 MDR 逆轉(zhuǎn)能力。不同治療組的阿霉素IC50具有不同的結(jié)果。分別為：MCF-7/ADR=（85.15±2.16）μg/ml，MCF-7/ADR+P=（74.55±3.10） μg/ml， MCF-7/ADR+SN50= （56.93±1.19） μg/ml，MCF-7/ADR+P+SN50=（45.31 ±3.10）μg/ml。補骨脂素和SN50可增加阿霉素對MCF-7/ADR細胞的毒性（圖1）。

圖1 阿霉素抑制MCF-7/ADR細胞增殖，且呈劑量依賴性

2、補骨脂素在mRNA 和蛋白水平上均下調(diào)GST-π 的表達

通過PCR（圖2A 和2B）和Western blot（圖2C 和2D）檢測GST-π 的表達。圖2A 和2B 中的數(shù)據(jù)表明補骨脂素抑制GST-π 的基因表達水平，不同濃度的藥物治療組之間的基因表達差異無統(tǒng)計學意義。IC10（8 μg/ml）和IC20（16 μg/ml）被認為是低毒濃度，而低于IC10的濃度被認為是無毒濃度。因此，在后續(xù)的實驗中，我們選擇4 μg/ml、8 μg/ml、12 μg/ml和16 μg/ml的濃度作為工作濃度。通過檢測GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥的蛋白及基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR+P細胞表達均顯著下調(diào)。

圖2 補骨脂素抑制MCF-7/ADR 細胞中GST-π 的表達水平（A為不同濃度補骨脂素對GST-π 的基因表達水平影響的PCR 結(jié)果；B 為不同濃度補骨脂素對GST-π 的基因表達水平影響的PCR 數(shù)據(jù)；C 為不同濃度補骨脂素對GST-π 的基因表達水平影響的Western blot結(jié)果；D為不同濃度補骨脂素對GST-π的基因表達水平影響的Western blot數(shù)據(jù)）

3、免疫熒光檢測NF-κB活化水平被補骨脂素抑制

通過免疫熒光法研究了NF-κB的活化情況，圖3A和圖3B 中的數(shù)據(jù)顯示，補骨脂素抑制了NF-κB 的核移位。在MCF-7/ADR+P 細胞中，細胞核NF-κB 的表達水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果提示補骨脂素可能通過抑制NF-κB的活化來逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。

圖3 NF-κB 通路的激活狀態(tài)（A）。NF-κB 在MCF-7/ADR 細胞中各位置均有表達（免疫熒光染色 ×200）。MCF-7/ADR細胞的NF-κB 主要在細胞核中表達。被補骨脂素阻斷的NF-κB 的激活主要發(fā)生在細胞質(zhì)中，抑制了其向核內(nèi)移位（B），免疫熒光染色 ×200

4、采用RT-PCR檢測GST-π的表達

采用RT-PCR 檢測補骨脂素對GST-π 基因表達的影響。用補骨脂素或SN50 處理MCF-7/ADR 細胞，均能抑制GST-π 的 mRNA 水平。SN50 作為一種特異性抑制劑，它的抑制作用比補骨脂素的抑制作用明顯（圖4）。

圖4 分離總RNA（采用實時聚合酶鏈反應(yīng)方法進行分析）

5、采用Western blot檢測細胞核中NF-κB的表達

提取細胞核蛋白，檢測NF-κB 的表達水平。不同處理組間NF-κB 在細胞核中的表達非常明顯（圖5）。補骨脂素（8 μg/ml）處理組細胞核中NF-κB 的表達確實降低。補骨脂素的作用非常明顯，這與免疫熒光檢測的結(jié)果一致。

圖5 用補骨脂素培養(yǎng)細胞24 h，NF-κB表達水平明顯降低

討 論

本研究旨在探討補骨脂素逆轉(zhuǎn)GST-π介導(dǎo)的MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的機制。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)補骨脂素可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，但不能降低MDR1、MRP 和LRP 的表達，因此我們需要探索逆轉(zhuǎn)MDR的作用機制［16，18］。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GST-π 的表達在藥物處理48 h后被抑制（補骨脂素處理24 h和48 h沒有差異）。這些結(jié)果進一步提示補骨脂素與抗癌藥物聯(lián)合使用可通過抑制GST-π 的表達來提高化療藥物的細胞內(nèi)濃度，補骨脂素可作為GST-π 的抑制劑或逆轉(zhuǎn)劑。補骨脂素對GST-π 的抑制程度沒有劑量依賴性，可能受到其他途徑的影響，其一可能通過細胞周期影響細胞增殖。我們還需要進行進一步的研究和討論，這也是我們實驗的缺點。

高度多樣化的GST 超家族的所有成員都能夠結(jié)合三肽谷胱甘肽［20］。GST-π 是參與化療藥物代謝的第2 階段解毒酶家族的成員［21］。GST-π 的高表達和GST-π 的核定位與腫瘤細胞的侵襲性和患者的低生存率相關(guān)［22］。多證據(jù)表明，GST-π在腫瘤細胞中的作用不是對細胞增殖的影響，而是獲得對抗癌藥物的耐藥性［23］。Kamada 等［24］研究了過氧化氫處理引起的氧化應(yīng)激條件下GST-π 的功能，GST-π 通過減少DNA 損傷來阻止細胞凋亡。在我們的實驗中，發(fā)現(xiàn)補骨脂素治療組中GST-π的表達明顯降低。有證據(jù)表明補骨脂素可顯著降低NF-κB 的表達。采用免疫熒光法檢測NF-κB的活化情況，數(shù)據(jù)與既往研究一致［16］。在MCF-7/ADR細胞中使用 NF-κB 抑制劑 SN50 后，實驗組 GST-π 的表達量低于正常對照組。我們認為GST-π 可能是NF-κB 下游信號通路的關(guān)鍵因子。隨后的結(jié)果證明了該假設(shè)的成立。

NF-κB信號通路參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫細胞激活、增殖、分化、凋亡，是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要轉(zhuǎn)錄因子［25］。NF-κB 存在于大部分細胞質(zhì)中，只有當它從細胞質(zhì)到細胞核被激活后，才能發(fā)揮重要作用［26］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的異常激活與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)［27］。根據(jù)一項新的研究，使用NF-κB 抑制劑可以使傳統(tǒng)的抗腫瘤治療更有效果［28］。我們之前的實驗表明，補骨脂素可以降低細胞核中NF-κB 的表達，這是補骨脂素可以減少NF-κB 從細胞質(zhì)進入細胞核的有力證據(jù)。

在抗腫瘤方面，由于中藥不良反應(yīng)較小近年來引起了人們的關(guān)注。本研究旨在開發(fā)新的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的藥物。該實驗也存在許多缺點，如沒有體內(nèi)實驗，需要進一步研究。

綜上所述，本研究表明補骨脂素通過抑制NF-κB 信號通路的激活，顯著地在MCF-7/ADR 細胞中抑制了GST-π介導(dǎo)的多藥耐藥。補骨脂素的這種作用可以使其作為一種化學增敏劑，通過一種有效的途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥，從而為腫瘤的治療提供新的治療局面。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突