陳重，野慶松，吳錦慧

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210093）

近幾十年來，各種藥物遞送系統(tǒng)已得到廣泛的研究。一些藥物遞送系統(tǒng)因具有提高藥物溶解性、靶向性、半衰期，以及減少全身副作用等優(yōu)勢被應(yīng)用于臨床。常見的用于藥物遞送的材料有蛋白質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)類、膠束等[1]。以人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)因其可生物降解性、非免疫原性、生物相容性和較長的半衰期而受到越來越多的關(guān)注[2]。

HSA是肝臟合成的最豐富的內(nèi)源性多功能血漿蛋白，在機(jī)體中的半衰期約為19 d。HSA作為血液中的天然運(yùn)輸載體，其能夠在生理環(huán)境中可逆地與各種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性分子結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到各種組織。HSA的內(nèi)部結(jié)合位點和表面活性基團(tuán)使其能夠同時攜帶多種治療分子，從而實現(xiàn)聯(lián)合治療。這些表面活性基團(tuán)也可以被配體修飾以提高HSA的靶向能力。此外，在溫和的條件下，HSA能夠通過多種方法被制備成不同大小的載藥納米顆粒。HSA的這些內(nèi)在特性使其成為一種具有吸引力的藥物載體，可用于遞送各種治療藥物和診斷試劑。一些基于HSA的制劑已被FDA批準(zhǔn)用于各種疾病，如癌癥、糖尿病、血友病的治療以及腫瘤成像等[3]。

本文綜述了HSA的載藥策略和HSA納米顆粒的制備方法，以及HSA藥物遞送系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用情況，并對HSA制劑在治療和診斷中的未來前景進(jìn)行了展望。

1 人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點

HSA是人血漿中最豐富的蛋白（35 ～ 50 g · L-1），占血漿總蛋白的40% ～ 60%。它由肝實質(zhì)細(xì)胞合成，在血漿中的半衰期約為19 d。HSA是體內(nèi)物質(zhì)（如脂肪酸、激素、膽紅素、脂溶性維生素等）運(yùn)輸?shù)闹匾d體，此外，它還能運(yùn)輸體內(nèi)大多數(shù)脂溶性藥物，從而可提高藥物在血漿中的溶解性和半衰期[4]。因此，HSA作為一種藥物載體被廣泛應(yīng)用。

HSA由585個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為66 500。在結(jié)構(gòu)上，HSA由3個結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域組成：結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ（見圖1）。每個結(jié)構(gòu)域又進(jìn)一步細(xì)分為子結(jié)構(gòu)域A和B。根據(jù)HSA的結(jié)構(gòu)，其主要有2個對多種分子具有高親和力的多配體結(jié)合位點，分別稱為Sudlow位點Ⅰ和Sudlow位點Ⅱ。此外，還鑒定出9個脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）結(jié)合位點（其中2個與Sudlow位點重合）。HSA還具有4個金屬結(jié)合位點，分別稱為N端結(jié)合位點（N-terminal binding site，NTS），34位半胱氨酸（Cys34）位點，金屬結(jié)合位點（metal binding site，MBS）-A和MBS-B（位置未知），它們能夠結(jié)合不同的金屬離子[5]（見表1）。

圖1 人血清白蛋白結(jié)構(gòu)示意圖及相關(guān)結(jié)合位點的位置Figure 1 Schematic diagram of human serum albumin structure and locations of the related binding sites

表1 人血清白蛋白結(jié)合位點的分布情況Table 1 Distribution of binding sites of human serum albumin

2 人血清白蛋白的載藥方式

在各種藥物遞送系統(tǒng)中，HSA藥物體系因其可生物降解、非免疫原性、半衰期長等特點，被廣泛應(yīng)用于小分子化藥、多肽、蛋白、核酸等多種治療藥物的遞送。HSA能夠以單分子的形式載藥，如將治療藥物通過非共價、共價、基因融合的方式連接到HSA分子上，也可以通過制備成納米粒子的形式載藥。

如前所述，HSA具有2個多配體結(jié)合位點，9個FA結(jié)合位點和4個MBS。非共價連接就是利用HSA的這些固有的結(jié)合位點連接藥物。在這種載藥方法中，選擇適合的連接基團(tuán)和連接位點對延長藥物的半衰期尤為重要。共價連接可形成一種更穩(wěn)定的HSA-藥物復(fù)合物。理論上，每個HSA分子含有1個N端羧基、1個Cys34和全部的賴氨酸殘基（59個）可用于連接藥物。但在HSA表面連接過多的分子會改變HSA的天然性質(zhì)，使其迅速從血液循環(huán)中清除[6]。因此，藥物與HSA連接的比例對藥效非常重要?；瘜W(xué)方法常用于制備小分子藥物-HSA偶聯(lián)物，而基因融合主要用于遞送蛋白質(zhì)和肽類，其基本原理是將HSA基因與目的基因融合，然后表達(dá)目的蛋白/肽-HSA偶聯(lián)物。雖然這種方法提高了蛋白質(zhì)和多肽的治療效果，但融合HSA依然降低了其對HSA受體的結(jié)合能力，從而降低體內(nèi)循環(huán)半衰期。因此，通過改造HSA的結(jié)構(gòu)，使其與HSA受體具有更好的親和力可能是延長融合HSA半衰期的一種有前景的策略。以上制備HSA-藥物結(jié)合物的主要缺點是載藥效率低，適用性有限，因為每個HSA分子只能連接少量藥物分子，并且HSA的載藥能力很大程度上受限于藥物的理化性質(zhì)。因此，還可以將藥物包裹在HSA內(nèi)制備成HSA納米顆粒[7]。該載藥方法的適用性廣泛，可用于各種不能與HSA非共價/共價連接或進(jìn)行基因融合的治療性分子，還可以包裹多種藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。此外，制備的納米粒子可以通過在表面修飾配體提高靶向能力。藥物被包裹在HSA納米顆粒中，直到在靶標(biāo)部位被響應(yīng)性釋放，從而提高了治療效果。

3 載藥人血清白蛋白納米粒子制備方法

迄今為止，人們已經(jīng)開發(fā)了多種HSA納米粒子的制備方法，如去溶劑法、乳化法、熱凝膠法、自組裝法、Nab技術(shù)等。這些制備方法已經(jīng)被詳細(xì)綜述[8]，在此不再贅述?？偟膩碚f，以上幾種制備方法中，去溶劑法和乳化法都需要加入有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑，但有機(jī)溶劑的用量和種類不同。熱凝膠法、自組裝法和Nab技術(shù)都不需要交聯(lián)劑，因為它們都是采用自交聯(lián)的方法：首先，HSA分子內(nèi)的二硫鍵分別通過加熱、還原劑和高壓均質(zhì)展開；然后HSA分子內(nèi)部以及分子之間重新生成的二硫鍵可以將HSA交聯(lián)成納米顆粒。

除了上述制備方法，筆者所在課題組一直致力于HSA制劑的開發(fā)[9-11]。課題組首次提出了一種綠色的“單水相”制備系統(tǒng)（single aqueous phase technology，Sap-technology）。該技術(shù)利用HSA的特性一步法制備了HSA納米藥物。簡單地說，在最佳溫度、離子強(qiáng)度、pH和超聲強(qiáng)度下，將HSA溶解在水溶液中，然后將溶于乙醇的疏水藥物滴入HSA溶液中，攪拌后將疏水藥物包裹在HSA的疏水口袋中，經(jīng)進(jìn)一步純化后凍干保存。不同于其他方法，該方法制備的藥物-HSA可以形成復(fù)合物，而不是交聯(lián)納米粒子，沒有二硫鍵的破壞和交聯(lián)。在不破壞蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將藥物大量地裝載到HSA內(nèi)部，最大程度保留了HSA的天然性質(zhì)。該制備方法簡單，整個過程避免了毒性有機(jī)溶劑的使用，耗時短，可工業(yè)化生產(chǎn)。該技術(shù)已獲得3項國際專利。課題組利用該技術(shù)實現(xiàn)了注射用HSA紫杉醇的連續(xù)、大規(guī)模生產(chǎn)，建立了一條符合國家GMP要求的HSA紫杉醇生產(chǎn)線。注射用HSA紫杉醇已在我國上市（國藥準(zhǔn)字：H20213539）。此外，HSA多西他賽（已進(jìn)入臨床試驗階段）和HSA雷帕霉素正在開發(fā)中。

4 人血清白蛋白在體內(nèi)的調(diào)控

不同于其他載體，以HSA為基礎(chǔ)的制劑在體內(nèi)的循環(huán)和分布可能受到多種HSA結(jié)合蛋白（albumin binding protein，ABP）的共同調(diào)控。其他納米制劑在體內(nèi)的長循環(huán)只能通過不被腎臟濾過和不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲來實現(xiàn)，是一種“被動”的長循環(huán)。而以HSA為基礎(chǔ)的制劑可以通過與ABP結(jié)合而“獲救”，這是一種“主動的”的長循環(huán)。此外，其他納米制劑主要被動地跨內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入目標(biāo)組織，而以HSA為載體的藥物可以通過ABP介導(dǎo)的跨內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織。幾種ABP已被鑒定，包括細(xì)胞表面糖蛋白Gp18、Gp30、Gp60（albondin），一種酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC），新生兒Fc受體（FcRn）和Cubilin/Megalin復(fù)合物。了解HSA與這些ABP相互作用的機(jī)制對于HSA制劑靶向給藥至關(guān)重要（見表2）。

表2 人血清白蛋白結(jié)合蛋白的類型和分布Table 2 Types and distribution of human serum albumin-binding proteins

4.1 通過Gp60進(jìn)行調(diào)控

Gp60是一種血管內(nèi)皮膜蛋白，其相對分子質(zhì)量為60 000。Gp60作用是介導(dǎo)體內(nèi)天然HSA在內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞，然后將HSA完整地運(yùn)輸?shù)窖芡饪臻g而不受溶酶體降解。這種HSA運(yùn)輸機(jī)制約占人體內(nèi)總HSA運(yùn)輸?shù)?0%。因此，以HSA為藥物載體的優(yōu)勢在于其可完整地跨過內(nèi)皮細(xì)胞，將藥物運(yùn)輸?shù)桨悬c[12]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，Gp60在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上大量表達(dá)，并介導(dǎo)了載藥HSA在腫瘤的蓄積[13]，但仍沒有直接證據(jù)表明，藥物-HSA復(fù)合物是否和天然HSA一樣能夠通過Gp60轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，載藥HSA的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)并蓄積在腫瘤組織的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.2 通過Gp18/Gp30進(jìn)行調(diào)控

Gp18和Gp30的相對分子質(zhì)量分別為18 000和30 000。它們在多種細(xì)胞中表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Gp60主要結(jié)合天然HSA并防止HSA被溶酶體降解；與其不同的是，Gp18和Gp30優(yōu)先結(jié)合化學(xué)修飾的、氧化的、老化的、變性的HSA，并被胞內(nèi)溶酶體進(jìn)一步降解。這是一種去除損壞和有害HSA的安全保護(hù)機(jī)制[14]。因此，保留HSA的天然結(jié)構(gòu)，防止其被Gp18/Gp30吞噬降解，對于維持HSA藥物在體內(nèi)的長循環(huán)非常重要。

4.3 通過SPARC進(jìn)行調(diào)控

SPARC也被稱為骨黏連蛋白，是一種位于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌性糖蛋白。其也在多種細(xì)胞中表達(dá)，如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。與健康組織相比，SPARC廣泛在惡性腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)。在多種癌癥組織中，SPARC過表達(dá)提示預(yù)后不良，與生存期呈負(fù)相關(guān)。有文獻(xiàn)表明，SPARC可以促進(jìn)腫瘤對HSA制劑的攝取[15]。然而，臨床試驗和基因?qū)嶒灢]有顯示出一致的結(jié)果[16]。因此，尚不清楚SPARC在載藥HSA遞送中的作用。

4.4 通過FcRn進(jìn)行調(diào)控

FcRn最初被發(fā)現(xiàn)是因為它能夠?qū)gG從母體轉(zhuǎn)移到胎兒體內(nèi)。此外，F(xiàn)cRn也參與保護(hù)HSA，使其不被溶酶體降解，在延長HSA半衰期方面起著關(guān)鍵作用。當(dāng)HSA通過胞飲作用被內(nèi)吞到早期核內(nèi)體后，其與位于酸化核內(nèi)體中的FcRn結(jié)合，然后被運(yùn)送到細(xì)胞外以避免溶酶體降解[17]。與野生型小鼠相比，F(xiàn)cRn缺陷小鼠的血清HSA水平下降了30%～50%。因此，HSA制劑能否被FcRn結(jié)合并重新循環(huán)到細(xì)胞外決定了其在體內(nèi)的半衰期。

4.5 通過Cubilin/Megalin進(jìn)行調(diào)控

Cubilin和Megalin為內(nèi)吞性糖蛋白，相對分子質(zhì)量分別為460 000和600 000。它們共同實現(xiàn)了配體的內(nèi)化，已被證實參與HSA、IgG等多種配體的胞吞和胞間運(yùn)輸。Cubilin和Megalin在腎臟主要負(fù)責(zé)多種物質(zhì)的重吸收。由于HSA的流體動力學(xué)直徑（約7.2 nm）小于腎小球濾過屏障（約10 nm），HSA可以被腎小球濾過進(jìn)入腎小管并重吸收回血液。腎臟每天可以生成約180 L的原尿，這意味著至少7 kg的HSA在腎小管中被重吸收[18]。當(dāng)Cubilin/Megalin表達(dá)不足時，近端小管表現(xiàn)出不同程度的HSA重吸收減少、血液HSA水平降低和尿蛋白升高。因此，通過Cubilin/Megalin受體介導(dǎo)，將HSA類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管可能是一種潛在的治療腎小管相關(guān)疾病的策略。

4.6 通過RAS突變誘導(dǎo)的巨胞飲進(jìn)行調(diào)控

除了受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)外，HSA也可通過非特異性識別被腫瘤細(xì)胞攝取。巨胞飲是一種不依賴受體的液相內(nèi)吞途徑，在從細(xì)胞外液獲取營養(yǎng)物質(zhì)的過程中起關(guān)鍵作用。一般情況下，HSA在體內(nèi)不被正常細(xì)胞作為能量物質(zhì)吸收和代謝。然而，在RAS突變的腫瘤細(xì)胞中，HSA通過巨胞飲作用被攝取作為氨基酸來源，這是載藥HSA在腫瘤中大量積累的重要機(jī)制[19]。RAS突變是最常見的癌癥（尤其是胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌）相關(guān)基因突變之一[20]。這可能解釋了Abraxane（HSA結(jié)合型紫杉醇）的臨床適用范圍。進(jìn)一步的研究表明，腫瘤細(xì)胞的巨胞飲水平可以通過營養(yǎng)剝奪的方式上調(diào)，這增加了HSA藥物在腫瘤中的累積并提高了治療效果[21]。

5 基于人血清白蛋白的遞送系統(tǒng)的臨床應(yīng)用

在過去的幾十年里，HSA已成為最重要的多功能藥物載體之一。如前所述，HSA遞送系統(tǒng)具有的諸多優(yōu)點，使其成為一種有吸引力的藥物載體，被用于遞送各種治療藥物和診斷試劑。一些基于HSA的藥物制劑已被FDA批準(zhǔn)用于臨床。Abraxane是FDA于2005年批準(zhǔn)的首個用于治療癌癥的HSA類化療藥物。該制劑通過Nab技術(shù)將HSA與紫杉醇制備成納米顆粒，用于治療乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌[22]。此后，用于治療糖尿病和血友病以及成像的基于HSA的制劑陸續(xù)成功獲批上市[23]。最近，基于Nab技術(shù)的第2款藥物FararrotmTM也已于2021年上市，用于治療局部晚期不可切除或轉(zhuǎn)移的惡性血管周圍上皮樣細(xì)胞瘤。此外，大量HSA制劑的臨床前和臨床試驗正在進(jìn)行中（見表3）。

表3 已獲批上市的基于人血清白蛋白的藥物遞送系統(tǒng)Table 3 The human serum albumin-based drug delivery systems approved for marketing

6 結(jié)語與展望

HSA遞送系統(tǒng)具有良好的生物相容性、生物降解性和較長的半衰期。其有多種載藥方式，如共價、非共價、基因融合、載藥納米粒子等。HSA表面的活性基團(tuán)也可以通過多種靶向配體修飾來增強(qiáng)遞送系統(tǒng)的靶向性和穿透能力。刺激敏感的HSA遞送系統(tǒng)還可以在特定的內(nèi)源性或外源性條件下分解并釋放藥物，減少藥物在非靶器官的積累。因此，以HSA為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)引起了廣泛關(guān)注。它們正成為各種治療藥物（如小分子藥物、蛋白質(zhì)、核酸、成像劑等）的重要載體，顯著提高了各種疾病的治療效果。到目前為止，一些HSA制劑已被批準(zhǔn)用于臨床，還有更多的正在進(jìn)行臨床試驗。

盡管HSA遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出許多獨(dú)特的優(yōu)點，但仍有一些問題需要解決。1）眾所周知，高通透性和滯留效應(yīng)（EPR）被認(rèn)為在將納米顆粒遞送到實體腫瘤的過程中起著至關(guān)重要的作用，但一直存在爭議。研究表明，在皮下和原位腫瘤模型中EPR效應(yīng)確實能增強(qiáng)納米顆粒在腫瘤組織中的積累，但在更接近人類癌癥的轉(zhuǎn)基因小鼠的自發(fā)癌癥中，尚未觀察到這種增強(qiáng)效應(yīng)[24]。另一項研究表明，只有3% ～ 25%的納米顆粒通過EPR效應(yīng)滲入腫瘤組織[25]。因此，有必要進(jìn)一步確定EPR效應(yīng)對HSA納米粒子攝取的貢獻(xiàn)。2）Gp60主要負(fù)責(zé)體內(nèi)天然HSA的轉(zhuǎn)運(yùn)，而載藥HSA是否依然通過Gp60被攝取，并沒有直接的證據(jù)。載藥HSA（160 mg · L-1）在體內(nèi)高濃度HSA（50 g · L-1）存在的情況下仍可在腫瘤中積聚而不被競爭性抑制[26]。因此，除Gp60外，載藥HSA被轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制仍有待研究。3）HSA本身具有生物相容性和較長的半衰期，但HSA與藥物結(jié)合、配體修飾、制備成納米顆粒后是否會影響其正常生理行為，如被Gp60轉(zhuǎn)運(yùn)以及被FcRn結(jié)合并避免降解，目前還沒有完全的答案。澄清上述問題對我們理解HSA制劑的生物學(xué)作用具有重要價值，也是進(jìn)一步開發(fā)HSA遞送系統(tǒng)的重要前提。

天然HSA在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布已被廣泛研究，其半衰期約為19 d。但目前上市的HSA制劑尚未達(dá)到如此高的半衰期，說明HSA類藥物與天然HSA在體內(nèi)的運(yùn)輸方式不完全相同。因此，深入研究HSA與藥物結(jié)合后HSA的結(jié)構(gòu)變化、分布和運(yùn)輸，將對加快HSA類藥物的研發(fā)起到關(guān)鍵作用。此外，結(jié)構(gòu)改變的HSA也具有靶向遞送藥物的能力[27]。筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)，不同于天然HSA，經(jīng)誘導(dǎo)后結(jié)構(gòu)變化的HSA具有靶向血小板的能力[28]。因此，通過調(diào)節(jié)HSA的結(jié)構(gòu)來靶向不同位點可能是一個新的研究方向?；贖SA制劑的研究仍在繼續(xù)，我們期待在不久的將來，更多新的基于HSA的治療和診斷產(chǎn)品將被批準(zhǔn)用于臨床，造福患者。