陳薪安 林永 葉菊秀

11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1,11β-HSD1）是一種低親和力NADP+依賴的脫氫酶/11-氧化還原酶，成年人或動物體內分布廣泛，以肝臟、脂肪組織和中樞神經系統(tǒng)中含量最高。11β-HSD1在人體細胞內負責氫化可的松與可的松之間（在動物中則負責皮質酮與皮質醇之間的轉化）的轉化，使無活性的可的松轉變?yōu)橛谢钚缘臍浠傻乃?，從而調節(jié)局部器官糖皮質激素（Glucocorticoid,GC）水平，進而改變局部組織或器官的糖、蛋白質和脂肪等合成和代謝水平。在妊娠后期，11β-HSD1表達增加，以提高GC濃度促進胎兒組織發(fā)育成熟，但過量的GC則會導致胎兒宮內發(fā)育遲緩，而且增加胎兒成年后患高血壓、心腦血管疾病和糖尿病等疾病的幾率。作為GC在局部組織的受體前調節(jié)器，11β-HSD1成為研究肥胖、代謝綜合征、糖尿病等GC相關疾病的發(fā)生機制和治療方法的重要靶點。

目前，研究多集中在11β-HSD1在GC相關疾病方面的作用；但是對于11β-HSD1 在不同年齡段大鼠眼部的分布、表達變化和眼發(fā)育的相關性研究較少。本研究通過檢測11β-HSD1在不同日齡SD大鼠眼球和視網膜組織中表達情況，觀察其在眼組織分布及隨SD大鼠發(fā)育成熟的變化情況，分析11β-HSD1在眼部正常發(fā)育過程中的作用，為今后研究11β-HSD1與眼部疾病相關性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

Sprague-Dawley（SD）大鼠由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雄性，SPF（Specific Pathogen Free）級。實驗方案經溫州醫(yī)科大學動物倫理委員批準，符合實驗動物倫理規(guī)范。分別選取1～2日齡新生SD大鼠（Postnatal day 1，PND1）、5～6日齡SD大鼠（PND5）、10～11日齡SD大鼠（PND10）、14～15日齡剛開眼SD大鼠（PND15）、20～21日齡SD大鼠（PND20）和8～9周齡健康成年SD大鼠（Mature adult rat，M），共6個年齡組，每組6只。取SD大鼠眼球和視網膜作為實驗材料，分別檢測PND1、PND15和M組11β-HSD1 蛋白與PND1、PND5、PND10、PND15、PND20和M組11β-HSD1 mRNA。

1.2 儀器和試劑

11β-HSD1多克隆抗體由葛仁山教授（原美國洛克菲洛大學）惠贈；Trizol、RNAse-free Dnase I購自美國Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase Kit購自美國Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix 購自美國ABI公司；廣譜即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒均購自美國Pierce公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；醫(yī)用X射線膠片購自美國Kodak公司；SDS-PAGE試劑購自美國Amresco公司；其他常用化學試劑均為國產分析純。

1.3 免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）檢測

SD大鼠經過安樂死后，解剖獲得眼球，并迅速置于預冷的含4%多聚甲醛的0.1 mol磷酸緩沖液（Phosphate buffer solution,PBS）（pH=7.2）中固定，按常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，使用涂有多聚賴氨酸包被載波片撈片，于60 ℃烤片2 h，經脫蠟、水平衡后，按SABC試劑盒說明書進行操作：切片經3%HO滅活內源性酶、復合消化液中修復抗原后，用山羊血清封閉；然后一抗結合（兔抗11β-HSD1多克隆抗體）；再與生物素化標記二抗結合；滴加SABC試劑后；DAB顯色，顯微鏡觀察，蒸餾水充分沖洗；蘇木素輕度復染細胞核；梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。用已知陽性片（睪丸組織）作陽性對照，用PBS取代一抗作陰性對照。DAB顯色后細胞出現(xiàn)棕黃色顆粒表示陽性。

1.4 RT-PCR檢測11β-HSD1 mRNA表達

1.4.1 引物的設計與合成 從Genebank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取11β-HSD1和RPS16序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，獲得最佳PCR引物（由上海鼎安生物技術公司合成），見表1。

1.4.2 RNA提取和逆轉錄 按Trizol法操作步驟提取角膜和視網膜勻漿組織總RNA，Agarose凝膠電泳和紫外分光光度計定量。取1 μg角膜或視網膜總RNA經25 U RNase-free DNase I處理以去除基因組DNA污染，RT反應體系25 μl按RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄。

1.4.3 實時定量PCR分析 在96 Real-time孔板內依次加入：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10 μmol/L的上下游引物各1 l，cDNA模板1 l，Rnase-free water 7 l。反應通過ABI公司的Gene Amp 7500 PCR儀進行，反應條件：95 ℃ 10 min啟動HotStarTag酶活性，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 15 s，共40個循環(huán)。反應結束后，以相應融解曲線來判斷擴增產物的特異性。所有樣品均重復3孔并計算CT平均值，并獲得2值，以用來定量分析不同基因mRNA水平的表達差異。2表示不同分組間表達量的倍數(shù)。以RPS16作為內參。

1.5 Western blot分析

SD大鼠安樂死后立即摘取眼球，置冰上，解剖顯微鏡下剝離視網膜，置于100 μl組織細胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5，150 mmol/L NaCl;10 ml/L Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，250 mmol/L NaPO，1 mmol/L NaF;1 mmol/L NaVO）中，玻璃勻漿器勻漿，1 000 r/min離心5 min取上清，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。參照文獻[13]的步驟：蛋白經SDS-PAGE電泳分離，轉移到PVDF膜上。該膜經脫脂奶粉封閉后，加入兔抗11β-HSD1抗體，4℃孵化過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫育1 h，再洗后用ECL顯色，X射線片暗盒曝光。抗GAPDH抗體作為蛋白質上樣量對照。顯色帶行計算機掃描，采用Floorchem V 2.0軟件進行分析，以目的蛋白帶的吸光密度面積與GAPDH蛋白條帶吸光密度面積的比值作為目的蛋白的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗研究。采用GraphPad Prism 6.0.1或SPSS26.0數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)，以表示，采用單因素方差分析或者獨立樣本的

t

檢驗進行組間比較。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1.和 PCR引物序列
Table 1.PCR primers sequnces of and

2 結果

2.1 11β-HSD1在SD大鼠眼組織的分布

IHC結果顯示，PND1 組的視網膜整個細胞層均明顯陽性染色（見圖1A—C）；PND15 組和M組視網膜神經節(jié)細胞層和色素上皮層細胞呈陽性染色，鞏膜和脈絡膜中的陽性染色均不明顯（見圖2）。PND1組角膜上皮呈陽性染色（見圖1D—E），角膜中部分細胞呈陽性染色；PND1組角膜內皮細胞陽性染色明顯（見圖1D），PND15 組和M組角膜內皮細胞無陽性染色（見圖2）。PND1 組的整個睫狀體細胞明顯陽性（見圖1E），PND15 組和M組睫狀體色素上皮細胞呈陽性（見圖2）。PND1 組晶狀體囊膜上皮細胞和前囊纖維細胞明顯陽性（見圖1F），而PND15組陽性染色較弱，M組由于晶狀體較硬，切片效果不佳而未檢測。

2.2 RT-PCR檢測結果

從PND1 組、PND5 組到PND10 組，角膜中的

11β-HSD1

mRNA相對表達量高且呈升高的趨勢，PND10 組的

11β-HSD1

mRNA相對表達量最高，PND15 組、PND20 組和M組角膜中的

11β-HSD1

mRNA相對表達量出現(xiàn)下降，差異有統(tǒng)計學意義（

F

=8.40，

P

＜0.001），見圖3。視網膜中

11β-HSD1

mRNA相對表達量與角膜中的略有差異，PND1組、PND5組和PND10組

11β-HSD1

mRNA相對表達量處于相對較高水平，其中PND5組視網膜

11β-HSD1

mRNA相對表達量最高，PND15 組、PND20 組和M組視網膜中的

11β-HSD1

mRNA相對表達量均出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（

F

=83.50，

P

＜0.001），見圖4。

2.3 Western bolt檢測結果

大鼠視網膜內11β-HSD1 蛋白在不同年齡組的表達情況與其mRNA結果基本一致，PND1組的視網膜中的11β-HSD1蛋白高表達，PND15組和M組視網膜內的11β-HSD1 蛋白表達則出現(xiàn)顯著下調，與PND1 組比差異均有統(tǒng)計學意義（PND15：

t

=4.76，

P

=0.009；M：

t

=4.24，

P

=0.013）。

3 討論

11β-HSD1 具有組織特異性，參與調節(jié)組織器官的細胞內GC水平，從而影響局部組織或器官的糖、蛋白質和脂肪等合成和代謝水平以及調控體內炎癥反應。本研究對11β-HSD1 在SD大鼠的眼組織的分布進行分析發(fā)現(xiàn)，角膜、虹膜、視網膜、鞏膜、晶狀體上皮、睫狀體等組織均有11β-HSD1 表達，尤其是角膜上皮（包括新生鼠角膜內皮）、虹膜、視網膜神經節(jié)（包括新生鼠神經母細胞層）中11β-HSD1 陽性細胞更為豐富。這表明11β-HSD1 廣泛存在于SD大鼠的眼組織內。進一步對比分析11β-HSD1 在SD大鼠發(fā)育過程中的時空變化發(fā)現(xiàn)，新生SD大鼠視網膜只有2 層，外核層和內核層都沒有分化出來，幾乎整個細胞層均有11β-HSD1表達；而開眼后和成年大鼠視網膜分化成10 層，11β-HSD1 主要表達于視網膜神經節(jié)細胞層和色素上皮層細胞；另外，11β-HSD1 的表達隨角膜的發(fā)育也出現(xiàn)差異，新生SD大鼠角膜上皮只有一層，均高度表達11β-HSD1，而開眼后和成年的大鼠角膜上皮已經分化成4～5 層，僅部分細胞表達11β-HSD1；新生鼠角膜內皮細胞也明顯地表達11β-HSD1，開眼后和成年大鼠角膜內皮不表達；新生鼠的睫狀體的突起和分枝還未分化形成，11β-HSD1 表達明顯，開眼后和成年大鼠睫狀體突起形成并分枝，睫狀體色素上皮細胞表達11β-HSD1。新生鼠的晶狀體囊膜上皮細胞和前囊纖維細胞也高表達11β-HSD1，而開眼后大鼠表達不明顯。隨后實驗結果也證實了開眼前SD大鼠眼組織中的

11β-HSD1

mRNA和蛋白水平高于開眼后和成年SD大鼠。這提示了11β-HSD1可能參與SD大鼠眼部的分化成熟過程。我們推測開眼前SD大鼠眼組織高表達11β-HSD1，可促使局部組織的GC處在相對較高水平，提高了新生SD大鼠眼組織細胞內物質合成和代謝水平，為大鼠眼組織能夠在接下來的2周內快速分化提供了保障，當分化完成以后，11β-HSD1表達量則開始降低并維持在一定水平。

圖1.11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-HSD1）在新生SD大鼠（PND1）眼組織中的表達分布A：視網膜層、角膜及睫狀體（×100）；B—C：視網膜（×400）；D：角膜（×400）；E：角膜及睫狀體（×400）；F：晶狀體（×400）Figure 1. Distribution of 11β-HSD1 in eyes of neonatal SD rats (PND1) by IHC.A:Retina,cornea and ciliary body (×100);B-C:Retina (×400);D:Cornea (×400);E:Cornea and ciliary body (×400);F:Lens (×400).11β-HSD1,11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1;SD,Sprague-Dawley;IHC,immunohistochemistry

圖2.11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-HSD1）在不同年齡段大鼠眼組織內的表達對比（×400）PND1組眼組織中11β-HSD1陽性細胞數(shù)多于PND15組和M組Figure 2. Comparison of 11β-HSD1 in the different age’s rat eyes by IHC (×400)The number of 11β-HSD1 positive cells in eyes of PND group SD rats was higher than that of PND 15 group and M group.

圖3.SD大鼠不同時期角膜內11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-HSD1）mRNA表達分析Figure 3. Comparative analysis of 11β-HSD1 mRNA in the cornea of different age's SD rats.

圖4.SD大鼠不同時期視網膜內11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-HSD1）mRNA表達分析Figure 4. Comparative analysis of 11β-HSD1 mRNA in the retina of different age's SD rats.

圖5.SD大鼠不同時期視網膜內11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型（11β-HSD1）蛋白表達分析（每組6只）A：11β-HSD1蛋白印跡雜交圖譜；B：11β-HSD1蛋白的相對表達量分析。a，與PND1組比較，P＜0.05Figure 5. Comparative analysis of 11β-HSD1 protein in the retina of different age’s SD rats (6 in every group).A:Western blot hybridization map of 11β-HSD1 protein;B:Relative expression of 11β-HSD1 protein.The expression of 11β-HSD1 protein in eyes of the neonatal SD rats was significantly higher than that of eyelid opening and mature adult SD rats.

已有研究表明，在一定條件下，組織內11β-HSD1表達增加會導致局部內源性激素水平長期升高，是導致GC相關疾病發(fā)生的重要原因。在激素誘發(fā)股骨頭壞死的研究中，治療性外源性激素可提高松質骨區(qū)微血管內皮細胞內11β-HSD1表達量，增加局部GC的含量，抑制骨髓間質干細胞成骨細胞能力，揭示了11β-HSD1與股骨頭壞死發(fā)生之間可能存在相關性。在認知和記憶的研究中發(fā)現(xiàn)，腦區(qū)海馬內11β-HSD1活性增強導致的GC濃度長期升高是導致海馬萎縮和記憶缺陷的重要原因，通過11β-HSD1抑制劑或11β-HSD1基因敲除等方法，可以改善認知和修復記憶。此外，11β-HSD1在肥胖和糖尿病等代謝性疾病中的作用也得到了證實。由于11β-HSD1在很多疾病的發(fā)生過程中起到關鍵調控作用，人們對11β-HSD1組織選擇性抑制劑在阿爾茲海默癥、糖尿病、肥胖、代謝綜合征、干眼病、青光眼等疾病的治療作用進行了研究，取得了一定進展。本研究發(fā)現(xiàn)開眼后和成年SD大鼠眼組織內11β-HSD1 mRNA及蛋白表達水平相對較低，這可能對于維持眼部低水平GC含量，保證局部器官組織生理平衡和健康具有重要意義，這也從另一個角度印證了上述11β-HSD1相關疾病的研究結果。

綜上所述，本研究對比分析了11β-HSD1在新生、剛開眼和成年階段的SD大鼠眼組織內的分布和表達的時空變化，發(fā)現(xiàn)11β-HSD1在各年齡段眼組織內廣泛存在但具有表達差異，其在新生期眼組織內表達水平高于剛開眼和成年后，初步揭示了11β-HSD1可能在新生SD大鼠眼分化發(fā)育中起重要作用，并推測11β-HSD1在發(fā)育成熟的眼組織內低水平表達是維持眼健康的重要原因。本研究僅在11β-HSD1水平上探索了其在出生后SD大鼠眼組織的分化發(fā)育過程中的變化，但未進行11β-HSD1活性和GC水平的研究，其在眼發(fā)育過程中具體機制還需進一步的研究驗證。本研究為眼發(fā)育奠定了基礎，并為下一步研究眼相關疾病的發(fā)病機制和尋找有效的治療方案提供了數(shù)據(jù)支持。

利益沖突申明

本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明

陳薪安：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。林永：參與選題、設計和修改論文的結果、結論。葉菊秀：參與選題、設計、資料的分析和解釋；修改論文中關鍵性結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行核修