馬玉博，潘 博，趙若晗，任鳳云

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院影像科)

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥類型，是發(fā)生率和死亡率最多的惡性腫瘤[1-2]。依照組織學(xué)基本特征，肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中約85 %為非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌中的重要組織學(xué)類別是肺腺癌。由于其早期癥狀不明顯，一旦發(fā)現(xiàn)大多處于后期，死亡率很高[3]。因此，需要去尋找與肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)相關(guān)的潛在預(yù)后指標(biāo)和靶點(diǎn)。

細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin dependent kinase 1，CDK1)是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控因子，通過(guò)調(diào)節(jié)抗凋亡因子的生存促進(jìn)細(xì)胞活力[4-5]，CDK1蛋白的上調(diào)與腫瘤的診斷、預(yù)后密切相關(guān)[6]。有報(bào)道，CDK1異常表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)，但CDK1的表達(dá)模式和預(yù)后價(jià)值仍有待進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析CDK1表達(dá)及與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。登錄UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)分析 CDK1與肺腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)、WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.webgestalt.org/)挖掘CDK1的共表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)、Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)和可視化分析，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)分析hub基因與肺腺癌總生存率的關(guān)系。

1.2方法

1.2.1CDK1在不同癌癥組織和正常組織中的差異表達(dá) GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDK1在各種不同癌癥組織和正常組織中的表達(dá)狀況，進(jìn)而分析CDK1在肺腺癌和正常組織中的表達(dá)。

1.2.2CDK1與肺腺癌患者臨床特征之間關(guān)系的分析 UALCAN[7]是一個(gè)交互的網(wǎng)站平臺(tái)，對(duì)來(lái)自腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas, TCGA)的31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)和3級(jí)RNA序列進(jìn)行深入分析。以UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，按下述步驟分析CDK1的表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征的關(guān)系:(1)在數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)選擇TCGA analysis;(2)Enter gene symbol(s):CDK1;(3)TCGA dataset:LUNG ADENOCARCINOMA;(4) Links for analysis: Expression。對(duì)應(yīng)選擇各種不同的臨床特征進(jìn)行分析。

1.2.3CDK1與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系的分析 對(duì)肺腺癌和正常樣本CDK1表達(dá)與患者總生存率(Overall survival，OS)進(jìn)行分析。

1.2.4分析CDK1的共表達(dá)基因 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)[8]收集了715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，86 733個(gè)癌組織和正常組織樣本數(shù)據(jù),是最大的癌基因芯片全球數(shù)據(jù)庫(kù)和集成數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái),旨在挖掘癌癥基因信息。通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)系統(tǒng)庫(kù)分析CDK1在肺腺癌患者中的表達(dá)情況，按以下步驟進(jìn)行: 登錄 Oncomine 數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索界面中輸入篩選條件:(1) GENE: CDK1;(2)ANALYSIS TYPE: COEXPRESSION ANALYSIS; (3)CANCER TYPE: LUNG CANCER;(4)設(shè)置臨界條件為:P -VALUE: 0.01,FOLD CHANGE:2,GENE RANK: TOP 10%。在上述篩選條件下，選取全部肺腺癌數(shù)據(jù)集，并基于所選數(shù)據(jù)對(duì)CDK1的共表達(dá)基因進(jìn)行分析。

1.2.5GO和KEGG功能富集分析 在2019年的更新中，WebGestalt支持12個(gè)生物體、342個(gè)基因標(biāo)識(shí)符和155175個(gè)功能分類[9]。共表達(dá)基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析是借助此在線工具開(kāi)展的。

1.2.6共表達(dá)基因蛋白質(zhì)互建網(wǎng)絡(luò)分析 String是一個(gè)檢索基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的工具[10]，Cytoscape是網(wǎng)絡(luò)圖分析的開(kāi)放型互聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)，它能數(shù)據(jù)可視化分子相互之間功能網(wǎng)絡(luò)和資源整合模塊化網(wǎng)絡(luò)[11]。PPI網(wǎng)絡(luò)是從String獲得的，PPI網(wǎng)絡(luò)借助Cytoscape軟件開(kāi)展可視化分析，繼而借助cytoHubba插件選擇出排行靠前的hub基因繼續(xù)研究。

1.2.7分析hub基因與肺腺癌的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter是分析臨床預(yù)后和基因表達(dá)的網(wǎng)站平臺(tái)，覆蓋了乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等腫瘤的基因及臨床數(shù)據(jù)[12-13]。為了進(jìn)一步分析hub基因的潛在作用，我們通過(guò)GEPIA分析hub基因在肺腺癌中的表達(dá)情況，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)分析肺腺癌的總生存率與hub基因兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系，以此討論hub基因?qū)Ψ蜗侔┗颊叩淖饔谩?/p>

1.2.8統(tǒng)計(jì)方法 采用數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。單因素方差分析正常組織和肺腺癌中CDK1的表達(dá)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log - rank檢驗(yàn)比較CDK1高、低表達(dá)組的生存率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CDK1在不同癌癥組織和正常組織中的表達(dá)結(jié)果 通過(guò)GEPIA在線分析CDK1在不同癌癥組織和正常組織中的差異表達(dá)(圖1A)，進(jìn)而分析提取TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD患者483例，正常對(duì)照347例，顯示CDK1表達(dá)水平在LUAD中顯著升高(圖1B)。

圖1A CDK1在31種癌癥組織和正常組織中的表達(dá)比較

ACC：腎上腺皮質(zhì)癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤(rùn)癌；CESC：宮頸鱗癌和腺癌；CHOL：膽管癌；COAD：結(jié)腸癌；DLBC：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；HNSC：頭頸鱗狀細(xì)胞癌；KICH：腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC：腎透明細(xì)胞癌；KIRP：腎乳頭狀細(xì)胞癌；LAML：急性髓細(xì)胞樣白血?。籐GG：腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗癌；OV：卵巢漿液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直腸腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮膚黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睪丸癌；THCA：甲狀腺癌；THYM：胸腺癌；UCEC：子宮內(nèi)膜癌；UCS：子宮肉瘤。

圖1B CDK1在癌組織和正常組織中的

2.2CDK1與肺腺癌患者臨床特征之間關(guān)系分析的結(jié)果 CDK1與肺腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系 根據(jù)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索源自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肺腺癌臨床數(shù)據(jù)，分析患者臨床特征與CDK1在肺腺癌中的表達(dá)兩者之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在不同種族、性別、年齡的肺腺癌患者中，CDK1的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異，此外，肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、TP53、組織學(xué)亞型也未見(jiàn)到與CDK1的表達(dá)存在明顯相關(guān)性，而吸煙習(xí)慣也并沒(méi)有影響CDK1的表達(dá)(圖2)。

圖2 CDK1的表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系

2.3CDK1與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系分析的結(jié)果 借助GEPIA分析CDK1表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的內(nèi)在聯(lián)系，數(shù)據(jù)表明，和CDK1高表達(dá)的肺腺癌患者比較，CDK1低表達(dá)的患者總生存率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 肺腺癌患者CDK1基因表達(dá)與總生存率

2.4CDK1共表達(dá)基因的結(jié)果 通過(guò)篩選后，我們對(duì)Su等[14]的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選出18個(gè)基因，分別是MAD2L1、DLGAP5、CEP55、TOP2A、KIF2C、ZWINT、UBE2C、RRM2、MCM4、NUSAP1、KIAA0101、CCNB1、TPX2、CENPE、CDKN3、TYMS、MLF1IP、RFC4，整合CDK1共表達(dá)基因用于后續(xù)的分析。

2.5GO和KEGG功能富集分析結(jié)果 GO分析顯示，生物學(xué)過(guò)程方面，CDK1表達(dá)相關(guān)基因主要富集在染色體定位、染色體分離、細(xì)胞器裂變等(圖4A)。細(xì)胞組成方面主要富集在染色體凝集、染色體區(qū)域等(圖4B)，分子功能方面主要富集在ATP酶活性(圖4C)。KEGG分析顯示CDK1表達(dá)相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路等過(guò)程(圖4D)。

2.6共表達(dá)基因蛋白質(zhì)互建網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果 基于STRING構(gòu)建CDK1及其表達(dá)相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示hub基因與肺腺癌的關(guān)系，為了進(jìn)一步探討共表達(dá)基因之間的內(nèi)在聯(lián)系，將共表達(dá)基因添加到STRING在線工具，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，把獲得的最終數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，選擇主要模塊進(jìn)一步分析。利用插件 cytoHubba并按Degree計(jì)算方法得到最終的PPI網(wǎng)絡(luò)。按Degree高低排序，篩選出排名前5的hub基因進(jìn)一步分析，5個(gè)hub基因分別為CDC6、MAD2L1、TOP2A、KIAA0101、 MCM4(圖5)。

圖4 CDK1共表達(dá)基因GO功能和KEGG通路富集分析

圖5 hub基因網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.7hub基因與肺腺癌的關(guān)系 借助GEPIA網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)分析肺腺癌患者中hub基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示相對(duì)于正常組織，5個(gè)hub基因在肺腺癌中明顯高表達(dá)(P<0.01),符合我們前期的分析結(jié)果，即CDC6、MAD2L1、TOP2A、KIAA0101、MCM4基因在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)(圖6)。Kaplan-Meier plotter系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)分析肺腺癌患者總生存率和hub基因中的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)CDC6、MAD2L1、TOP2A、KIAA0101、MCM4均與肺腺癌患者的 OS 密切相關(guān)(P<0.05)，且CDC6、MAD2L1、TOP2A、KIAA0101、MCM4在肺腺癌中的表達(dá)越低，患者預(yù)后越好(圖7)。

圖6 hub基因的驗(yàn)證(P<0.01)

圖7 hub基因與肺腺癌總生存率的關(guān)系(P<0.05)

3 討論

肺癌是世界上最致命的癌癥之一[15]。肺腺癌是肺癌中最常見(jiàn)和最具侵襲性的亞型，具有最大的異質(zhì)性和侵襲性。肺腺癌的發(fā)展與吸煙等環(huán)境暴露密切相關(guān)[16]。當(dāng)腫瘤局限于肺部且只在局部淋巴結(jié)擴(kuò)散的時(shí)候，最有效的治療方法是手術(shù)。但是大多數(shù)肺腺癌患者在初次診斷時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或被診斷為晚期，并不符合手術(shù)切除的條件，這是肺腺癌總體預(yù)后不良的一個(gè)重要原因[17]。轉(zhuǎn)移也是肺腺癌患者存活率下降的主要潛在原因[18]，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的基本特征是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。因此，關(guān)于尋找新的肺腺癌治療靶標(biāo)或預(yù)后生物標(biāo)志物的研究，對(duì)于提高肺腺癌患者總體生存率和預(yù)后，將具有十分重要的意義。

Xu等[19]研究認(rèn)為，OPN3通過(guò)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，繼而促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移，OPN3很有可能成為肺腺癌臨床研究上有用的潛在靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)。有研究[20]認(rèn)為，SYT13在肺腺癌的形成進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，干擾SYT13能夠明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，這可能有助于肺腺癌的靶向治療。Zou等[21]關(guān)于肝細(xì)胞癌的相關(guān)研究認(rèn)為CDK1是潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，與肝細(xì)胞癌的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。CDK1的抑制劑結(jié)合免疫療法可以提高肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后。Xing等[22]研究表明，CDK1表達(dá)水平與乳腺癌患者的總體和進(jìn)展后生存率以及無(wú)復(fù)發(fā)概率相關(guān)。CDK1可能為乳腺癌患者提供潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物。故此CDK1在腫瘤形成進(jìn)展中的功能還有待科學(xué)研究。

本研究通過(guò)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，CDK1在肺腺癌中表達(dá)明顯高出正常組織。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明肺腺癌患者的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡及吸煙習(xí)慣等臨床特征與CDK1的表達(dá)沒(méi)有顯著相關(guān)性。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDK1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肺腺癌患者中低表達(dá)CDK1基因的總生存率高于高表達(dá)組(P<0.05)。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘篩選出CDK1的共表達(dá)基因有MAD2L1、TOP2A、MCM4等18個(gè)基因。GO分析顯示，CDK1共表達(dá)基因主要與染色體定位、染色體分離、細(xì)胞器裂變、染色體凝集、染色體區(qū)域、ATP酶活性相關(guān)。KEGG分析顯示，CDK1共表達(dá)基因參與p53信號(hào)通路等進(jìn)程。腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)不僅為疾病的診斷和治療提供了強(qiáng)有力的依據(jù)，而且為深入研究肺腺癌和CDK1基因的關(guān)系奠定了初步的基礎(chǔ)。但CDK1在肺腺癌中的具體作用及臨床意義需要更進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，CDK1基因在LUAD中可能是一個(gè)潛在的致癌基因。CDK1在LUAD中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為重要的生物標(biāo)志物。因此，有必要進(jìn)一步研究該基因在LUAD中的機(jī)制以及功能，為全面了解CDK1在腫瘤中的作用以及LUAD的診斷和預(yù)后提供更多依據(jù)。