周建紅，令玉林，曾伯平，張 衡，鄧克勤

（1.遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州 遵義 563006；2.遵義師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，貴州 遵義 563006；3.湖南科技大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411201）

赭曲霉素A（OTA）是幾種菌株的有毒次生代謝物，其毒性大、分布范圍廣，易對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、食品造成污染［1-2］。由于人類與OTA 的過度接觸具有致畸、致癌等風(fēng)險(xiǎn)，世界不同的國家和組織均制定了嚴(yán)格的OTA限量標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟委員會(huì)（EU）對(duì)谷物產(chǎn)品中的OTA限量小于3μg/kg［3］，中國國家標(biāo)準(zhǔn)限定谷類、豆類中的OTA標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)低于5μg/kg［4］。

OTA 常見的檢測方法有色譜法［5-6］和免疫分析法［7-8］。適配體傳感器作為一種成本低廉、制備簡單、靈敏度高的分析技術(shù)［9-11］，也被用于OTA 的檢測，并顯示了對(duì)目標(biāo)分子的特異性生物識(shí)別能力。近年來，新涌現(xiàn)的光電化學(xué)傳感器（尤其是陰極光電化學(xué)傳感器）具有操作方便、背景低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，引起了廣泛關(guān)注［12-16］，進(jìn)一步開發(fā)特殊的陰極光電活性材料可提高陰極光電化學(xué)傳感器的性能。AgBr 具有光學(xué)不穩(wěn)定性，通過部分被還原為金屬Ag 顯示的局域表面等離子體共振效應(yīng)（LSPR）可提高光吸收效率。此外，金屬Ag 的LSPR 效應(yīng)還與周圍介質(zhì)密切相關(guān)，通過采用各種支撐材料（如g-C3N4、CNTs、BiOI等）優(yōu)化金屬Ag附近的電場，可增強(qiáng)光吸收，提高光活性材料的性能［15-16］。

目前，基于OTA 適配體的陰極光電化學(xué)傳感器研究不多。本文通過簡單的水熱法和光還原法制備了AgBr-Ag-CNTs，利用金屬Ag 的LSPR 效應(yīng)和CNTs優(yōu)異的電子傳輸性能，將AgBr 的光生電子快速傳輸給溶液中的光電子受體K3［Fe（CN）6］，有效地降低了光生電子——空穴復(fù)合，顯著提升了陰極光電流強(qiáng)度；進(jìn)一步采用AgBr-Ag-CNTs 作為陰極傳感界面固定OTA 核酸適配體，對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別，因形成的適配體/OTA 配合物具有剛性的三級(jí)結(jié)構(gòu)和弱導(dǎo)電性，能有效阻礙傳感界面對(duì)光的吸收及抑制光電子向電子受體傳遞［17］，顯著降低光電流信號(hào)（原理如圖1 所示），以此構(gòu)建了用于檢測OTA 的光電適配體傳感器。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)，可用于實(shí)際樣品中OTA的測定，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 檢測OTA的示意圖Fig.1 Schematic diagram for detection of OTA

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

采用X-射線光電子能譜（XPS，PHI5300）、掃描電子顯微鏡（SEM，Sigma 500，德國Zeiss公司）、能量色散光譜儀（EDS，XFlash 6130，布魯克科技有限公司）、X-射線衍射儀（XRD-6000，日本島津公司）表征材料。光電測試使用光電化學(xué)系統(tǒng)（PEAC 200A，天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）和CHI 760C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。實(shí)驗(yàn)采用LED白光光源（20 mW/cm2），三電極體系分別為ITO工作電極、Pt絲對(duì)電極和飽和甘汞輔助電極（SCE）。

碳納米管（CNTs，直徑20 ～30 nm，長度0.5 ～2.0 μm）、AgNO3、K3［Fe（CN）6］、K4［Fe（CN）6］、KBr、乙醇胺、殼聚糖（CS）、Tris-HCl、戊二醛（GLD）購于上海阿拉丁公司。玉米赤霉烯酮（ZEA）、赭曲霉素A（OTA）、赭曲霉素B（OTB）、黃曲霉素B1（AFB1）由英格蘭New England Biolabs，Inc. 提供。OTA 的核酸適配體5’-NH2-（CH2）6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′由上海生工公司合成。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 AgBr-Ag-CNTs的制備

先將多壁碳納米管（CNTs）在濃HNO3和H2SO4（3∶1，體積比）中酸化處理［18］，然后采用溶劑熱法制備AgBr-Ag-CNTs。具體方法如下：分別使用25 mL 乙二醇溶解240 mg KBr 和340 mg AgNO3，將20 mg CNTs 加入AgNO3溶液中，緩慢磁攪拌1 h 后，將KBr 溶液緩慢滴加到上述懸浮液中，攪拌30 min，置于紫外光下照射1 h 后，將混合液倒入高壓反應(yīng)釜中，160 ℃下加熱6 h，離心、洗滌并干燥，制得AgBr-Ag-CNTs。為了比較性能，采用相似方法，在不加入CNTs 的條件下制備AgBr-Ag。AgBr也在無CNTs和紫外光照下制得。

1.3 核酸適配體傳感器的制備與OTA的檢測

將AgBr-Ag-CNTs分散在0.1%殼聚糖（CS）溶液中，取8μL AgBr-Ag-CNTs分散液（5.0 mg/mL）滴于潔凈的ITO表面，干燥后，用戊二醛（2.5%）活化CS膜30 min，然后將8μL核酸適配體（1.0μmol/L）滴于ITO表面并在4 ℃下培育12 h，最后用乙醇胺封閉活性位點(diǎn)30 min。傳感器在制備過程的每一步都需仔細(xì)清洗。

OTA的檢測采用Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl和20 mmol/L MgCl2，pH 8.0）。取10μL不同濃度的OTA樣品溶液滴加至傳感器表面，室溫反應(yīng)30 min，洗凈。在0.1 V電壓下，以0.1 mol/L KCl為電解質(zhì)溶液，20μmol/L K3［Fe（CN）6］作為光電子受體，檢測傳感器與OTA反應(yīng)前/后的光電流強(qiáng)度（I0/I）。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

利用掃描電鏡（SEM）表征了AgBr-Ag-CNTs復(fù)合物的形貌和尺寸。從圖2A可觀察到，復(fù)合物呈類立方體形態(tài)，CNTs嵌入或覆蓋在立方體表面，其尺寸約0.4 ～2.0μm。AgBr-Ag-CNTs的EDS譜圖表明其特征峰分別對(duì)應(yīng)C、O、Br、Ag四種元素（圖2B），證實(shí)了復(fù)合材料中存在CNTs和AgBr。其中，Ag原子占32.86%，Br原子占26.41%。過量的Ag原子（6.46%）可能來自Ag+的還原。圖2C為AgBr-Ag-CNTs的XRD譜圖，其在31.0°、44.3°、55.0°、64.5°、73.2°的特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)AgBr立方晶相的（200）、（220）、（222）、（400）、（420）晶面（JCPDS No. 06-0438）［19］。未發(fā)現(xiàn)明顯的Ag特征峰，可能是由于AgBr-Ag-CNTs中金屬Ag含量較低或粒徑太小所致。進(jìn)一步利用XPS分析AgBr-Ag-CNTs的元素組成和化學(xué)狀態(tài)（圖2D-F）。C 1s和O 1s的特征峰來自CNTs（圖2D）。Ag的XPS峰可拆分為4個(gè)擬合峰。367.1 eV和373.2 eV處的兩個(gè)峰屬于AgBr中Ag 3d5/2和Ag 3d3/2，368.0 eV和374.2 eV處的兩峰屬于金屬Ag［20］，這表明Ag0的存在（圖2E）。Br 3d在68.0 eV和69.1 eV處有擬合峰，分別屬于Br 3d5/2和Br 3d3/2的結(jié)合能（圖2F），表明元素Br主要以Br-存在［20］。

圖2 AgBr-Ag-CNTs的SEM圖（A）、EDS譜圖（B）、XRD譜圖（C）和XPS譜圖（D-F）Fig.2 SEM image（A），EDS spectrum（B），XRD pattern（C）and XPS spectrum（D-F）of AgBr-Ag-CNTs

進(jìn)一步比較了幾種材料的陰極光電化學(xué)活性（見圖3）。在外加偏壓0.1 V條件下，AgBr顯示較低的陰極光電流，AgBr-Ag的陰極光電流強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與前二者相比，AgBr-Ag-CNTs的光電流強(qiáng)度大大提升，其強(qiáng)度分別為AgBr的2.7倍和AgBr-Ag的2.1倍，這表明AgBr-Ag-CNTs擁有更高的陰極光電化學(xué)活性。

圖3 不同材料修飾的ITO玻璃在0.1 V偏壓下的光電流Fig.3 Photocurrent of ITO glass modified by different materials at potential of 0.1 V

2.2 K3［Fe（CN）6］的影響

為提高AgBr-Ag-CNTs在光激發(fā)下的電子-空穴對(duì)（e-/h+）的分離效率，提高光電流信號(hào)，構(gòu)建高性能傳感器，本實(shí)驗(yàn)考察了K3［Fe（CN）6］作為光電子受體時(shí)的信號(hào)變化。由圖4A可見，無K3［Fe（CN）6］時(shí)，光照下的電流（曲線a’）比無光照時(shí)的電流（曲線a）明顯增強(qiáng)；加入K3［Fe（CN）6］后，開啟燈源時(shí)電流急劇增加（圖4B，b’），與曲線a’相比，對(duì)應(yīng)電位的電流大大增強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證K3［Fe（CN）6］的作用，本實(shí)驗(yàn)采用恒電位法比較了AgBr-Ag-CNTs/ITO電極在有/無K3［Fe（CN）6］時(shí)的光電流。結(jié)果顯示，在0.1 V電位下，當(dāng)存在K3［Fe（CN）6］作為光電子受體時(shí)，電極的光電流是無K3［Fe（CN）6］時(shí)的2.9倍，且光電流在瞬間達(dá)到最大。這表明光照條件下，AgBr導(dǎo)帶激發(fā)出的光電子可經(jīng)CNTs快速傳遞到溶液中的K3［Fe（CN）6］，促進(jìn)其還原為K4［Fe（CN）6］。由于CNTs具有優(yōu)良的電荷傳輸效率，可加速電荷分離并抑制電子-空穴對(duì)（e-/h+）復(fù)合，從而顯著增強(qiáng)光電流信號(hào)［16］。

2.3 傳感器的構(gòu)建

利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）研究了核酸適配體傳感器的制備過程。圖5A顯示AgBr-Ag-CNTs/ITO的電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）相對(duì)較低（曲線a）。修飾CS膜后，增強(qiáng)了Rct值（曲線b）；固定適配體和封閉乙醇胺后，Rct值顯著增加（曲線c）；與OTA反應(yīng)后進(jìn)一步降低了Rct（曲線d）。采用瞬態(tài)光電流對(duì)傳感器的制備進(jìn)行考察（見圖5B），可觀察到AgBr-Ag-CNTs/ITO產(chǎn)生極高的陰極光電流（曲線a）。隨著CS的修飾、核酸適配體的固定和乙醇胺的封閉，光電流逐步降低（曲線b、c）。與OTA反應(yīng)后，光電流密度進(jìn)一步減?。ㄇ€d），這表明傳感器已成功制備且實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)OTA的特異性識(shí)別。

圖5 不同電極在5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］溶液中的電化學(xué)阻抗譜（A），以及0.1 V偏壓下，不同電極在20μmol/L K3［Fe（CN）6］中的光電流（B）Fig.5 EIS curves of different electrodes in 5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］solution（A），and photocurrent response of different electrodes at 0.1 V in 0.1 mol/L KCl containing 20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）a：AgBr-Ag-CNTs/ITO；b：after CS modification；c：after aptamer and ethanolamine immobilization；d：after incubation with OTA（1.0 ng/mL）

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

外加電位是影響光電流信號(hào)的重要因素。如圖4B所示，陰極光電流強(qiáng)度隨掃描電位（0.6 ～0.05 V）的降低而升高，但掃描電位＜0 V時(shí)，AgBr-Ag-CNTs不穩(wěn)定，當(dāng)掃描電位低于0.05 V時(shí)，負(fù)向電流急劇升高，這可能是由于AgBr-Ag-CNTs復(fù)合物中的Ag+被快速還原所致。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 V作為偏置電位。

圖4 AgBr-Ag-CNTs/ITO在0.1 mol/L KCl（A）和20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）溶液中于黑暗（a，b）和光照（a’，b’）條件下的循環(huán)伏安圖Fig.4 CV curves of AgBr-Ag-CNTs/ITO in 0.1 mol/L KCl solution（A）and 20μmol/L K3［Fe（CN）6］（B）under darkness（a，b）and light irradiation（a’，b’）

核酸適配體在光電陰極界面的固定密度影響光電化學(xué)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在適配體濃度為0 ～1.0μmol/L范圍內(nèi)，光電流強(qiáng)度隨濃度的升高急劇下降。在1.0 ～5.0μmol/L范圍，光電流緩慢下降最后趨于穩(wěn)定?？紤]到高密度的適配體會(huì)阻礙光電子轉(zhuǎn)移，而低密度的適配體不能有效捕獲OTA并與之反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用1.0μmol/L的適配體濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 性能檢測

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測試了傳感器與不同濃度OTA 反應(yīng)后的陰極光電流響應(yīng)（圖6A）。在4.0 pg/mL ～2.5 ng/mL 范圍內(nèi)，光電流密度隨OTA 質(zhì)量濃度的升高而降低，且降低的光電流ΔI（I-I0）與OTA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（logC）呈線性關(guān)系，線性方程為：ΔI（μA）＝-0.179+0.917 logC（pg/mL）（圖6A，插圖），相關(guān)系數(shù)（r2）為0.994，檢出限（LOD）為1.5 pg/mL，遠(yuǎn)低于歐盟和中國規(guī)定的谷物和豆類原料中OTA的限定含量［3-4］。

圖6 光電流響應(yīng)與OTA濃度的關(guān)系（A），及方法對(duì)OTA檢測的特異性（B）Fig.6 Relationship between photocurrent response and concentration of OTA（A），and specificity of the method for OTA assay（B）concentration of OTA：1.0 ng/mL；concentration of aflatoxin B1（AFB1），zearalenone（ZEA），and ochratoxin B（OTB）：50.0 ng/mL；inset：the log-linear correlation between ΔI and content of OTA

利用AgBr-Ag-CNTs/ITO 對(duì)1.0 ng/mL OTA 進(jìn)行特異性測試。如圖6B所示，與空白溶液相比，傳感器對(duì)質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL 的黃曲霉素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、赭曲霉素B（OTB）的光電流響應(yīng)降低小于7.5%；當(dāng)三者與OTA 混合后，傳感器響應(yīng)的光電流與僅含OTA 反應(yīng)液的光電流相似。結(jié)果表明該方法對(duì)OTA具有良好的選擇性。

為驗(yàn)證該傳感器的可靠性，本課題組從當(dāng)?shù)爻匈徺I了紅酒、豆?jié){和花生牛奶3 種不同樣品，采用加標(biāo)的方式考察其回收率，每個(gè)樣品的加標(biāo)質(zhì)量濃度為100 pg/mL，平行測定3 次，測得回收率為92.0%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于9.3%，表明該傳感器可用于實(shí)際樣品中OTA的檢測。

3 結(jié)論

本文采用水熱法和光化學(xué)還原法制備了具有優(yōu)良陰極光電化學(xué)活性的AgBr-Ag-CNTs復(fù)合納米材料。采用該材料作為陰極光電傳感基底，以K3［Fe（CN）6］作為光電子受體，制備了OTA 適配體傳感器，于4.0 pg/mL ～2.5 ng/mL范圍實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)分子OTA 的選擇性檢測，檢出限為1.5 pg/mL。本傳感器制備簡單、成本低、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。