周連玉，喬 楓

（青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海西寧 810008）

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，城市居民對(duì)生活環(huán)境的質(zhì)量要求越來越高，水體的環(huán)境質(zhì)量也已受到關(guān)注。對(duì)水體的監(jiān)測大多集中于有機(jī)污染物、重金屬等，對(duì)微生物指標(biāo)的監(jiān)測較少。細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測中發(fā)揮著重要的指示作用[1]。同時(shí)，相關(guān)研究方法也不斷地推廣轉(zhuǎn)化到本科生的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)之中。在這些研究和教學(xué)過程中，通過平板菌落計(jì)數(shù)法和多管發(fā)酵法對(duì)水環(huán)境的細(xì)菌總數(shù)和大腸群菌定量檢測是有效可行的實(shí)驗(yàn)方法。因此，生物學(xué)科的本科生學(xué)習(xí)和掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法，為自身的科學(xué)研究和實(shí)踐應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)大部分高校開設(shè)的面向本科生基礎(chǔ)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的課程中，水中大腸菌群的檢測實(shí)驗(yàn)基本是針對(duì)自來水或者校園水體的檢測。基于這種狀況，嘗試拓展實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，建成了一個(gè)應(yīng)用性水環(huán)境微生物檢測實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，以期提高教學(xué)效果，培養(yǎng)學(xué)生綜合能力。

1 教學(xué)內(nèi)容設(shè)計(jì)

根據(jù)生活、科研的需求，從教學(xué)內(nèi)容方面調(diào)整和優(yōu)化綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)[2]。在本科微生物實(shí)驗(yàn)課中開設(shè)的“水中大腸菌群的檢測”是作為基礎(chǔ)專題實(shí)驗(yàn)，主要是采用多管發(fā)酵法檢測自來水中大腸菌群[3]。對(duì)水體中微生物指標(biāo)的測定新建成“西寧城西景觀水體細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群污染狀況的調(diào)查”試驗(yàn)，以10人一大組，2人一小組，采集城市河流、公園景觀水體等樣品，按照GB/T 5750.12—2006細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)[1，3]，進(jìn)一步采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并評(píng)價(jià)水體污染情況。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目內(nèi)容貼近生活，不僅提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，更鍛煉其將所學(xué)知識(shí)運(yùn)用到實(shí)際生活中解決所遇到問題的能力。

2 西寧城西景觀水體細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群污染狀況的調(diào)查

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段

將相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容通過網(wǎng)絡(luò)提前發(fā)布給學(xué)生，讓他們了解實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)步驟。學(xué)生利用課余時(shí)間在教師的指導(dǎo)下配置實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基，按照水樣采集方法采集水樣[3]，同一個(gè)地方選取5個(gè)不同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域之間的距離超過20 m。

2.1.1 水樣的采集方法與調(diào)查

課前安排學(xué)生對(duì)4個(gè)采集點(diǎn)西寧市城西區(qū)湟水（HS）、麒麟灣（QLW）、人民公園東湖（RGD）、人民公園西湖（RGX）水體不同區(qū)域的水樣進(jìn)行采集，并讓他們從水體透明度、氣味、可見的污染物、生物類型等方面進(jìn)行調(diào)查。通過對(duì)采集地點(diǎn)的水面環(huán)境和周圍環(huán)境的調(diào)研結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同水體異味、表面懸浮物、清澈情況有差異。

景觀水體不同區(qū)域采樣點(diǎn)基本情況見表1。

表1 景觀水體不同區(qū)域采樣點(diǎn)基本情況

2.1.2 培養(yǎng)基

胰蛋白胨培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，乳糖5 g，氯化鈉5 g，16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，蒸餾水1 000 mL。3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨30 g，牛肉膏9 g，乳糖15 g，氯化鈉15 g，16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液3 mL，蒸餾水1 000 mL。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán)瓊脂42.5 g，蒸餾水1 000 mL[3]。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 細(xì)菌總數(shù)的測定

采用平板計(jì)數(shù)法測定水體中細(xì)菌總數(shù)[1]。取10 mL水樣加入90 mL蒸餾水，即水樣的10倍稀釋。取0.1 mL稀釋液于胰蛋白胨培養(yǎng)基的中間，用無菌涂布棒涂布均勻，每個(gè)稀釋液水樣做3個(gè)重復(fù)。涂平板后培養(yǎng)基倒置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌落總數(shù)。

2.2.2 大腸菌群的測定

采用多管發(fā)酵法測定水體中大腸菌群[4]。取5支裝有杜氏小管的3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣5 mL。另外，5支裝有杜氏小管的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣1 mL。再取5支裝有杜氏小管的乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣0.1 mL。各管搖勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

觀察發(fā)酵管中發(fā)酵液的顏色和產(chǎn)氣情況，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中發(fā)酵液劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。挑選帶有金屬光澤且顏色發(fā)紫的菌落，將其一部分進(jìn)行革蘭氏染色，另一部分接種于裝有杜氏小管的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的復(fù)發(fā)酵管中，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

安排2名學(xué)生負(fù)責(zé)將各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整合在一起，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各項(xiàng)指標(biāo)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD，p＜0.05），制作出相關(guān)圖與表。

2.3.1 景觀水體細(xì)菌總數(shù)

景觀水體中細(xì)菌總數(shù)見圖1。

圖1 景觀水體中細(xì)菌總數(shù)

由圖1可知，不同景觀水體之間存在顯著性差異（p＜0.05），4個(gè)景觀水體中細(xì)菌污染程度大小為湟水河＞人民公園東湖＞麒麟灣＞人民公園西湖，湟水河與其他3個(gè)景觀水體之間的細(xì)菌總數(shù)均存在顯著性差異（p＜0.05），人民公園東湖與麒麟灣無顯著性差異。每個(gè)景區(qū)水體中微生物數(shù)量變化較大，與之前的報(bào)道一致[4-5]。由此可見，不同景觀水體細(xì)菌污染的程度不一樣。

由圖1還可知，同一景觀水體不同區(qū)域細(xì)菌總數(shù)存在差異，HS中水體細(xì)菌污染程度大小為HS1＞HS5＞HS4＞HS2＞HS3，RGD中水體細(xì)菌污染程度大小為RGD5＞RGD2＞RGD4＞RGD3＞RGD1，RGX中水體細(xì)菌污染程度大小為RGX2＞RGX1=RGX3＞RGX5＞RGX4，QLW中的水體細(xì)菌污染程度大小QLW2＞QLW3＞QLW1=QLW5＞QLW4。實(shí)驗(yàn)表明，西寧市同一景觀水體不同區(qū)域細(xì)菌總數(shù)存在差異性，與郭愛蓮等人[5]對(duì)西安市典型的景觀水體中不同區(qū)域細(xì)菌總數(shù)的調(diào)查結(jié)果相似。

2.3.2 景觀水體大腸菌群

景觀水體中大腸菌群及評(píng)定等級(jí)見表2。

由表2可知，不同景觀之間存在顯著性差異（p＜0.05），4個(gè)景觀水體中大腸菌群污染程度大小為湟水河＞麒麟灣＞人民公園西湖＞人民公園東湖，湟水河與其他3個(gè)景觀水體之間的大腸菌群數(shù)均存在顯著性差異（p＜0.05），麒麟灣大腸菌群數(shù)顯著高于人民公園東湖和人民公園西湖（p＜0.05），人民公園西湖大腸菌群數(shù)顯著高于人民公園東湖（p＜0.05）。大腸菌群是衡量水體微生物污染指標(biāo)之一，西寧城西不同景觀水體大腸菌群存在差異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與潘少兵等人[4]研究結(jié)果一致。

表2 景觀水體中大腸菌群及評(píng)定等級(jí)

同一景觀水體不同區(qū)域大腸菌群數(shù)存在差異，HS中水體大腸菌群污染程度大小為HS4＞HS2＞HS1=HS5＞HS3，QLW中水體大腸菌群污染程度大小為QLW4＞QLW5＞QLW3＞QLW2=QLW1，RGD中水體大腸菌群污染程度大小為RGD2＞RGD1＞RGD3＞RGD4=RGD5，RGX中水體大腸菌群污染程度大小為RGX2＞RGX4＞RGX5=RGX1＞RGX3；同 一 景 觀 水 體不同區(qū)域大腸菌群顯著性差異的具體結(jié)果與郭愛蓮等人[5]調(diào)查結(jié)果一致。依據(jù)GB-3838-2002國家地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)景觀水體污染情況進(jìn)行了等級(jí)評(píng)價(jià)。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果的探究

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中學(xué)生發(fā)現(xiàn)了一些問題，如為什么同一景觀不同區(qū)域細(xì)菌總數(shù)或大腸菌群存在差異性、為什么細(xì)菌總數(shù)多的區(qū)域大腸菌群并不是最多的、對(duì)于水體污染還有哪些指示微生物等，帶著這些疑問，在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生分析了采樣點(diǎn)的水面、周邊環(huán)境，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)。從文獻(xiàn)資料中獲悉作為水體污染的指示菌有細(xì)菌總數(shù)、糞鏈球菌、腸球菌、脆弱擬桿菌、總大腸菌群、糞大腸菌群、擬桿菌等[1，7]。之前的研究證實(shí)某些指示菌之間存在顯著的相關(guān)性，而有些菌沒有相關(guān)性，由此可見不同水體環(huán)境中微生物之間的相關(guān)性不一定相同[8]。從這次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)水體的透明度和周圍環(huán)境可直接反映水體的污染程度。對(duì)于微生物污染較為嚴(yán)重的水體，需采取有效措施改善水質(zhì)，如提高游人環(huán)保意識(shí)、加強(qiáng)統(tǒng)一監(jiān)管、嚴(yán)禁生活污水排入景觀水體、禁止游人亂丟垃圾、嚴(yán)格控制水中魚餌的投放量、定期對(duì)水面雜物清理等，也可采取生物化學(xué)措施改善水質(zhì)[9-10]。

3 教學(xué)體會(huì)

通過將基礎(chǔ)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中“水中大腸菌群的檢測”的教學(xué)內(nèi)容，建成“西寧城西景觀水體細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群污染狀況的調(diào)查”實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，取得了較好的教學(xué)效果。對(duì)水環(huán)境的實(shí)地調(diào)查，學(xué)生了解到生物、人類活動(dòng)是造成景觀水體污染的主要因素，及時(shí)制止破壞水環(huán)境的不當(dāng)行為是保護(hù)水體環(huán)境的有效措施之一，增強(qiáng)了學(xué)生的環(huán)保意識(shí)。學(xué)生參與水體采集、培養(yǎng)基配置、細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群檢測、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解析等過程，掌握水體指示菌檢驗(yàn)的工作流程及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。在教師的指引下，學(xué)生從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)問題，通過參閱相關(guān)文獻(xiàn)，從中找出問題的答案，提高了發(fā)現(xiàn)和解決問題的能力。

4 結(jié)語

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的改革，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)操作能力，有利于培養(yǎng)具有嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)態(tài)度和實(shí)踐應(yīng)用能力的優(yōu)秀人才。在今后的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中需要不斷地優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容，改進(jìn)教學(xué)方法，爭取達(dá)到更好的教學(xué)效果。