徐 丹 ，陶永梅，宋 丹，周振興，周 悅，王瑞珩，劉樹(shù)民

動(dòng)脈粥樣硬化屬于循環(huán)系統(tǒng)疾病，是心血管內(nèi)科常見(jiàn)疾病，也是動(dòng)脈硬化最重要也最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，發(fā)病位置為血管處，按照動(dòng)脈粥樣硬化受累動(dòng)脈部位可以分為腸系膜動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、四肢動(dòng)脈硬化等，動(dòng)脈粥樣硬化臨床表現(xiàn)多為體力衰退、腦力衰退，并會(huì)隨著血管斑塊的形成，不同的病變部位也會(huì)出現(xiàn)不同程度的缺血癥狀，其中腦缺血會(huì)引起頭暈、眩暈以及暈厥等癥狀[1-3]。有研究證明，服用蓬子菜總黃酮可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化臨床癥狀，蓬子菜總黃酮可通過(guò)抑制Toll樣受體(TLR)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，進(jìn)而改善血管病變[4]。現(xiàn)有的藥物及手術(shù)治療方法只能短時(shí)間控制病情，見(jiàn)效快，但西藥副作用較大，且不能根治此病，但目前缺乏關(guān)于蓬子菜總黃酮用于動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔的相關(guān)資料。故本研究基于TLR/NF-κB通路研究蓬子菜總黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔的干預(yù)效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取75只家兔，由廣東金石醫(yī)療科技服務(wù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2020-0232]，兔齡3～5(3.80±0.95)個(gè)月，體質(zhì)量225～263(231.80±18.05)g，將家兔放置在室溫23～25 ℃、濕度40%～70%、自然光照、通風(fēng)的無(wú)病原菌的干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用水和食物均經(jīng)消毒。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑及藥物來(lái)源：酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司；TLR3抗體購(gòu)于上海群己生物科技有限公司；NF-κB p62抗體購(gòu)于上海梵態(tài)生物科技有限公司；蓬子菜全草的藥物均購(gòu)自同仁堂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模 在75只家兔中隨機(jī)選取15只作為正常組，不做任何處理，其余家兔隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只，參照李枚娟等[5]研究建立動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型，除正常組外，其余各組家兔均在早晨將尼古丁25 mg/kg溶于花生油對(duì)家兔進(jìn)行灌胃，18：00時(shí)使用與早晨相同劑量的尼古丁重復(fù)灌胃，同時(shí)給予高脂飼料誘發(fā)家兔動(dòng)脈粥樣硬化，每周2次，持續(xù)2周，正常組灌胃等體積生理鹽水。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：家兔出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化癥狀。

1.2.2 給藥 將蓬子菜全草粉碎，采用75%乙醇進(jìn)行提取，醇提液濃縮至一定密度，乙醇洗脫液濃縮后干燥，得總黃酮，檢測(cè)純度是否達(dá)到59%，保存?zhèn)溆?。低劑量組、中劑量組、高劑量組家兔分別給予蓬子菜總黃酮灌胃6周，劑量分別為0.05 mg/kg、1.00 mg/kg、1.50 mg/kg，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 家兔灌胃6周后，禁食不禁水12 h，麻醉處死，迅速摘取主動(dòng)脈后立即固定在染色液中，將所制備的家兔主動(dòng)脈組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后，行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備厚度為4 μm的組織切片，取主動(dòng)脈組織石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹(shù)膠封片后，顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.2.4 檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平 抽取各組家兔的空腹靜脈血2 mL，離心半徑5 cm，32 s平均轉(zhuǎn)速3 000 r進(jìn)行離心處理3 min，分離上層血清，在-42 ℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，實(shí)驗(yàn)步驟：設(shè)置10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔并準(zhǔn)備相應(yīng)水平標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置1個(gè)空白孔及若干待測(cè)樣品在10 μL待測(cè)樣品中加入40 μL樣本稀釋液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標(biāo)液50 μL，封膜溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液每孔50 μL以終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔吸光度，檢測(cè)IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.2.5 檢測(cè)6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)水平 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基制備1×105/mL細(xì)胞懸液，均勻接種于2個(gè)24孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞懸液1 mL。在細(xì)胞完全貼壁并將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱直到細(xì)胞近50%匯聚時(shí)，換用不同含血清的DMEM同步化處理24 h，棄上清，加入干預(yù)培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：正常組加入正常組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液；模型組加入模型組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液；低劑量組、中劑量組、高劑量組加入低劑量組、中劑量組、高劑量組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取上清液用放射免疫法檢測(cè)6-keto-PGF1α、TXB2含量。

1.2.6 測(cè)定TLR/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟：將主動(dòng)脈組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，并使用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，每次5 min，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜，每次5 min，共3次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔病理組織學(xué)觀察 正常組家兔血管平滑肌細(xì)胞排列整齊，不存在脂質(zhì)沉積，色澤較鮮艷，未見(jiàn)粥樣硬化斑塊；模型組家兔主動(dòng)脈壁增厚，內(nèi)膜下存在脂質(zhì)沉積，存在大量泡沫細(xì)胞以及明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；藥物干預(yù)后，低劑量組、中劑量組家兔血管平滑肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整；高劑量組家兔視血管平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，未見(jiàn)明顯脂質(zhì)沉積。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組家兔病理組織學(xué)觀察(HE，×400)

2.2 各組家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組IL-6、IL-1α、TNF-α水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比較(±s) 單位：ng/L

2.3 各組家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組6-keto-PGF1α水平均低于正常組，TXB2水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組6-keto-PGF1α水平高于模型組，TXB2水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組6-keto-PGF1α水平高于低劑量組，TXB2水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組6-keto-PGF1α水平高于中劑量組，TXB2水平低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比較(±s) 單位：mg/L

2.4 各組家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組TG、TC、LDL-C水平均高于正常組，HDL-C水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組TG、TC、LDL-C水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組TG、TC、LDL-C水平低于低劑量組，HDL-C水平高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組TG、TC、LDL-C水平低于中劑量組，HDL-C水平高于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較(±s) 單位：mmol/L

2.5 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組TLR3、NF-κB p62水平高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組TLR3、NF-κB p62水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組TLR3、NF-κB p62水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平比較(±s)

圖2 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化屬于心血管疾病，已逐漸成為我國(guó)居民最主要的死亡原因。心血管系統(tǒng)是人體重要的血管系統(tǒng)之一，該處的血管容易堵塞，動(dòng)脈粥樣硬化是血管病中最常見(jiàn)的一種，當(dāng)血管發(fā)生老化以及衰退時(shí)，血管內(nèi)脂肪以及類(lèi)脂等物質(zhì)聚集成斑塊，呈黃色粥樣，斑塊數(shù)量達(dá)到一定限度時(shí)會(huì)造成血管壁增厚、變硬，從而失去彈性，形成動(dòng)脈粥樣硬化[6-7]。動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)引起心律失常以及心絞痛，甚至?xí)斐蓢?yán)重的器官損傷，目前主要的治療方法只能短時(shí)間控制病情，且治療效果與病變的程度、部位以及血管狹窄程度、受累器官受損等因素有關(guān)[8]。如心血管系統(tǒng)受損則會(huì)嚴(yán)重地影響病人的日常生活，甚至危及生命。且目前有效治療動(dòng)脈粥樣硬化的方法較少，常采用西藥進(jìn)行病情控制，但西藥不能根治此病，且副作用較大，為更好地研究出有效的治療方案，本研究基于TLR/NF-κB通路探討蓬子菜總黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔的干預(yù)效果，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供參考。

動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)增加毛細(xì)血管的阻力，造成嚴(yán)重的器官損傷，蓬子菜具有行血、清熱解毒、利膽的功效，主要含有黃酮、環(huán)烯醚萜、蒽醌、有機(jī)酸等化學(xué)成分，是從中藥和天然植物中提取的黃酮類(lèi)化合物，具有明顯的抗氧化以及清除自由基的作用[9]。董均明等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮可以降低毛細(xì)血管的血管阻力以及血管滲透性，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有著較強(qiáng)的保護(hù)作用。朱玉良等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮有誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的作用。目前，關(guān)于蓬子菜總黃酮在動(dòng)脈粥樣硬化中應(yīng)用效果的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮可明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化家兔毛細(xì)血管阻力，其原因可能與蓬子菜黃酮類(lèi)成分具有明顯的抗氧化以及清除自由基的作用，且生物利用度高，最終發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化毛細(xì)血管阻力的作用有關(guān)。

IL-6、IL-1α、TNF-α屬于炎性細(xì)胞因子，IL-6具有較強(qiáng)的抗感染以及免疫防御功能，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[12]。而TNF-α是一種多功能的細(xì)胞因子，高水平的TNF-α?xí)T發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡刺激因子以及中性粒細(xì)胞黏附，同時(shí)還會(huì)活化中性粒細(xì)胞，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基或者蛋白酶[13]。易瓊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可作用于多種靶向細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)以及分化具有調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)作用，可參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞內(nèi)膜下遷移以及促凝性質(zhì)的改變，并可與其他炎性細(xì)胞因子起到協(xié)調(diào)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有多重生物學(xué)效應(yīng)，可導(dǎo)致炎癥，促進(jìn)內(nèi)皮素的產(chǎn)生，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮治療后，家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平明顯降低，此類(lèi)藥物還具有消腫、抗炎的作用，說(shuō)明IL-6、IL-1α、TNF-α可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)。

動(dòng)脈粥樣硬化家兔在發(fā)病期會(huì)出現(xiàn)血小板過(guò)度激活的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致TXB2釋放增加。楊雪等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TXB2具有強(qiáng)烈的血小板聚集以及收縮血管功能，會(huì)導(dǎo)致血管以及血管內(nèi)形成微血栓。本研究結(jié)果顯示，蓬子菜總黃酮治療可降低TXB2水平，升高6-keto-PGF1α含量，說(shuō)明蓬子菜總黃酮有抑制血小板TXB2合成及促進(jìn)6-keto-PGF1α生成的作用，可發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生與機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用密切相關(guān)[17]。鄭曲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝水平可提高家兔的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，預(yù)防心腦血管疾病，提高HDL-C水平，影響血清TC、TG、LDL-C水平，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮治療后家兔TG、TC、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高，說(shuō)明蓬子菜總黃酮可很好地治療動(dòng)脈粥樣硬化，調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝水平。

TLR/NF-κB通路是較為常見(jiàn)的信號(hào)通路之一，此信號(hào)通路被證實(shí)在多種疾病中存在表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，是一條重要的調(diào)節(jié)通路，其中TLR3、NF-κB p62是TLR/NF-κB通路中的蛋白因子[19-20]。此通路可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控TLR3、NF-κB p62表達(dá)，可阻止動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)程，減輕炎癥反應(yīng)以及免疫紊亂[21]。TLR3可以在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，耿瑞麗等[22]研究表明，激活TLR3不僅可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，還會(huì)促進(jìn)疾病的進(jìn)展，TLR3的激活還可以誘導(dǎo)具有抗炎效應(yīng)的炎性基因，此外，TLR3的激活還可以抑制動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜的形成及內(nèi)膜彈性薄層的斷裂。NF-κB信號(hào)機(jī)制可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的疾病進(jìn)展，引起抗微生物感染的免疫應(yīng)答，介導(dǎo)固有免疫向獲得性免疫轉(zhuǎn)換。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，加重動(dòng)脈粥樣硬化[23]。故本研究中高劑量蓬子菜總黃酮可能通過(guò)抑制TLR/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)TLR3、NF-κB p62表達(dá)，緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上所述，蓬子菜總黃酮可能通過(guò)調(diào)控TLR/NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)重要信號(hào)傳導(dǎo)分子的蛋白表達(dá)，降低動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔毛細(xì)血管的血管阻力以及血管的滲透性。