顧 超 陶 峰 曹林峰 李 娜 應(yīng) 櫻 張 齊 馬肖龍

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球三大死因之一，其中90%的死亡發(fā)生在中低收入國家[1]。COPD 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、炎癥反應(yīng)、細(xì)支氣管周圍和間質(zhì)纖維化及細(xì)胞衰老等介導(dǎo)了COPD 的發(fā)生發(fā)展[2-6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫模型大鼠肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type Ⅱ alveolar epithelial cells，AECⅡ）凋亡明顯增加，進(jìn)而導(dǎo)致其肺功能下降[7]，但具體的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過收集臨床患者的肺組織，分析COPD 患者肺損傷的相關(guān)分子機(jī)制，為闡明COPD 發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月至2020 年12 月在浙江省嘉興市第一醫(yī)院手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者30 例，分為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者（A 組）、NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者（B 組）及NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者（C 組），每組10 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過（審批號：LS2020-139），所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 參考本課題組前期研究[8]，COPD 伴NSCLC 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合COPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)，且第1 s 用力呼氣容積/用力肺活量（FEV1/FVC）<70%，50%≤FEV1<80%的預(yù)計(jì)值；（2）符合NSCLC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，TNM 分期為ⅠA-ⅡB 期，擬行肺癌手術(shù)治療；（3）2 周內(nèi)無COPD 急性加重史，無支氣管哮喘病史。NSCLC 且不伴COPD 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合IASLC 2009 年NSCLC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，TNM 分期為ⅠA-ⅡB 期；（2）無COPD、支氣管哮喘等慢性氣道疾?。唬?）擬行肺癌手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在除NSCLC 以外其他惡性腫瘤史者；（2）存在心、肝、腦等的重要臟器功能不全的患者；（3）有血液系統(tǒng)相關(guān)疾病或者嚴(yán)重凝血功能障礙患者；（4）使用全身糖皮質(zhì)激素、化療藥物治療者。標(biāo)本選取距肺癌病灶切緣5 cm 外的肺組織，-80℃保存或4%甲醛固定。

1.3 主要試劑 PrimeScriptTMRT Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa，批號RR047A）、SP-9000 免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號SP02991）、兔抗人肺泡表面活性蛋白A（SPA）抗體（美國Santa Cruz，批號sc-166219）、兔抗人肺泡表面活性蛋白C（SPC）抗體（美國Santa Cruz，批號sc-518029）、兔抗人p53 抗體（江蘇碧云天公司，批號AF7671）、兔抗人p21 抗體（江蘇碧云天公司，批號AF5252）、兔抗人叉頭框蛋白O3a（FoxO3a）抗體（江蘇碧云天公司，批號AF609）、山羊抗兔IgG 二抗（杭州華安生物技術(shù)有限公司，批號HA1101）、TUNEL凋亡細(xì)胞檢測試劑盒（江蘇碧云天公司，批號C1090）、TRIzol（美國Invitrogen 公司，批號15596026）。

1.4 方 法

1.4.1 肺功能測定 患者手術(shù)前常規(guī)采用耶格MasterScreen 肺功能儀進(jìn)行肺功能測定，采集數(shù)據(jù)FVC、FEV1/FVC 和FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比（FEV1%），分析并打印報告。

1.4.2 肺組織病理學(xué)檢測 各組患者肺組織于4%甲醛中固定，參考本課題組前期研究方法[9]行HE 染色，并分析肺泡的平均內(nèi)襯間隔（MLI）、平均肺泡面積（MAA）和單位面積平均肺泡數(shù)（MAN）。

1.4.3 Real-time PCR 檢測SPA 和SPC mRNA 表達(dá)參考本課題組前期研究方法[9]檢測肺表面活性蛋白A（SPA）和肺蛋白活性蛋白C mRNA（SPC mRNA）表達(dá)水平。

1.4.4 免疫組化檢測SPA 和SPC 蛋白表達(dá) 各組肺組織石蠟包埋后切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)后予山羊血清封閉，加SPA 或者SPC 一抗孵育，洗滌后加山羊抗兔IgG 二抗孵育，最后DAB 顯色及蘇木素復(fù)染，封片后顯微鏡下觀察。

1.4.5 TUNEL/SPC 雙重免疫熒光染色 各組肺組織石蠟包埋后切片，脫蠟至水，蛋白酶K 消化后加SPC一抗孵育，漂洗后加FITC 標(biāo)記的IgG 二抗孵育，洗滌后加TUNEL 檢測液避光孵育，最后予DAPI 復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察，并參考本課題組前期研究方法[10]，計(jì)算TUNEL 及SPC 雙陽性細(xì)胞的百分比，即為凋亡的AECⅡ。

1.4.6 Western blot 檢測p53、p21 及FoxO3a 蛋白表達(dá) 取各組肺組織采用組織蛋白提取試劑盒提出總蛋白，總量為20 μg 的蛋白變性后上樣電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，加p53、p21 及FoxO3a 一抗孵育，漂洗后加山羊抗兔IgG 二抗孵育，成像系統(tǒng)掃描攝像后分析目的蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3 次及以上，采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NSCLC 患者肺功能結(jié)果比較 各組患者手術(shù)前均測定肺功能，F(xiàn)VC 結(jié)果相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與A 組比較，C 組FEV1/FVC 和FEV1%均明顯降低（P<0.05）；與B 組比較，C 組FEV1/FVC 和FEV1%均明顯降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組NSCLC 患者肺功能測定結(jié)果比較（）

表1 各組NSCLC 患者肺功能測定結(jié)果比較（）

注：A 組為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者；B 組為NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者；C 組為NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者；FVC 為用力肺活量；FEV1 為第1 s 用力呼氣容積；FEV1/FVC 為第1 s 用力呼氣容積與用力肺活量之比；NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；COPD為慢性阻塞性肺疾病；與A 組比較，aP<0.05；與B 組比較，bP<0.05

2.2 肺組織病理學(xué)改變 各組患者肺組織HE 染色后顯示，C 組肺組織呈現(xiàn)明顯的肺氣腫樣病理學(xué)改變（見圖1）。同時，肺組織病理學(xué)半定量分析表明，A組和B 組的MLI、MAA 及MAN 無明顯差異（P>0.05）。與A 組和B 組比較，C 組的MLI 和MAA 均明顯升高（P<0.05）、MAN 明顯降低（P<0.05）；C 組患者的肺組織病理學(xué)改變與肺功能下降相符合。見表2。

表2 各組NSCLC 患者肺組織MLI、MAA 和MAN 結(jié)果比較（）

表2 各組NSCLC 患者肺組織MLI、MAA 和MAN 結(jié)果比較（）

注：A 組為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者；B 組為NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者；C 組為NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者；NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；COPD 為慢性阻塞性肺疾??；MLI 為肺泡的平均內(nèi)襯間隔；MAA 為平均肺泡面積；MAN 為單位面積平均肺泡數(shù)；與A 組比較，aP<0.05；與B 組比較，bP<0.05

圖1 各組NSCLC 患者肺組織病理學(xué)改變（HE 染色×200）

2.3 各組NSCLC 患者肺組織SPA 和SPC mRNA 及蛋白表達(dá)水平比較 分別采用Real-time PCR 和免疫組化檢測各組患者肺組織SPA 和SPC mRNA 及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，A 組和B 組患者肺組織SPA 和SPC mRNA 及蛋白表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與A 組和B 組比較，C 組SPA mRNA 和SPC mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P 均<0.05）。C 組SPA 和SPC 蛋白表達(dá)明顯減少。見表3、圖2-3。

圖2 各組NSCLC 患者肺組織SPA 蛋白表達(dá)水平（免疫組化×400）

圖3 各組NSCLC 患者肺組織SPC 蛋白表達(dá)水平（免疫組化×400）

表3 各組NSCLC 患者肺組織SPA 和SPC mRNA 表達(dá)水平比較（）

表3 各組NSCLC 患者肺組織SPA 和SPC mRNA 表達(dá)水平比較（）

注：A 組為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者；B 組為NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者；C 組為NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者；NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；COPD 為慢性阻塞性肺疾病；SPA 為肺泡表面活性蛋白A；SPC 為肺泡表面活性蛋白C；與A 組比較，aP<0.05；與B 組比較，bP<0.05

2.4 各組AECⅡ凋亡水平比較 TUNEL/SPC 雙重免疫熒光染色檢測各組患者肺組織AECⅡ的凋亡，TUNEL（紅色熒光）和SPC（綠色熒光）雙陽性的細(xì)胞即為凋亡的AECⅡ。與A 組和B 組相比，C 組AECⅡ凋亡百分比顯著增加（P<0.05）。見圖4、表4。

圖4 各組NSCLC 患者肺組織AECⅡ凋亡比較（TUNEL/SPC 雙重免疫熒光×640）

表4 各組NSCLC 患者肺組織AECⅡ凋亡百分比比較（%，）

表4 各組NSCLC 患者肺組織AECⅡ凋亡百分比比較（%，）

注：A 組為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者；B 組為NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者；C 組為NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者；NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；COPD 為慢性阻塞性肺疾??；TUNEL為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶；AECⅡ?yàn)棰蛐头闻萆掀ぜ?xì)胞；與A 組比較，aP<0.05；與B 組比較，bP<0.05

2.5 各組p53、p21 及FoxO3a 蛋白表達(dá)變化 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p53、p21 及FoxO3a 蛋白在A組和B 組中的表達(dá)相近；與A 組和B 組比較，C 組患者肺組織p53 和p21 蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）、FoxO3a（F=288.318，P=0.000）蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），見圖5、表5。

圖5 各組NSCLC 患者肺組織p53、p21 及FoxO3a 蛋白表達(dá)變化

表5 各組NSCLC 患者肺組織p53、p21 及FoxO3a 蛋白相對表達(dá)量比較（%，）

表5 各組NSCLC 患者肺組織p53、p21 及FoxO3a 蛋白相對表達(dá)量比較（%，）

注：A 組為NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者；B 組為NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者；C 組為NSCLC 伴COPD 且有吸煙史的患者；NSCLC 為非小細(xì)胞肺癌；COPD 為慢性阻塞性肺疾病；FoxO3a為叉頭框蛋白O3a；與A 組比較，aP<0.05；與B 組比較，bP<0.05

3 討論

COPD 的特征是持續(xù)的呼吸道癥狀和不可逆氣流受限，通常是由于大量接觸有毒顆粒物或氣體引起的氣道和/或肺泡的異常，并受到包括肺發(fā)育異常在內(nèi)的宿主因素的影響[11]。吸煙是COPD 最常見的危險因素，與不吸煙者相比，吸煙者呼吸系統(tǒng)癥狀和肺功能異常的患病率更高，F(xiàn)EV1年下降率更高，COPD死亡率更高[12]。但即使是重度吸煙者，也只有不到50%的人患有COPD[13]。盡管遺傳學(xué)可能在改變吸煙者患COPD 的風(fēng)險方面發(fā)揮作用，但也可能涉及其他風(fēng)險因素。本研究中納入了NSCLC 不伴COPD 且無吸煙史的患者和NSCLC 不伴COPD 但有吸煙史的患者，兩組患者在肺功能、肺組織病理學(xué)、SPA 和SPC mRNA 及蛋白表達(dá)、AECⅡ凋亡方面均無明顯差異。

在哺乳動物中，肺泡上皮細(xì)胞由Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞（type Ⅰ alveolar epithelial cells，AECⅠ）和AECⅡ組成。AECⅡ可通過有絲分裂補(bǔ)充自身數(shù)量，合成并分泌肺表面活性蛋白（SPs），進(jìn)而維持肺泡穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)肺組織修復(fù)[14]。AECⅡ能特異性合成和分泌SPA 及SPC，并發(fā)揮相關(guān)功能[6]。因此，AECⅡ數(shù)量與功能的穩(wěn)定對肺泡結(jié)構(gòu)的完整性和維持肺功能具有重要作用。本研究中，COPD 患者（C 組）肺功能顯著下降，符合COPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)；肺組織呈現(xiàn)明顯的肺氣腫樣病理學(xué)改變，并與肺功能下降相符合；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，COPD 患者肺組織SPA 和SPC mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著低于A 組和B 組，并且TUNEL（紅色熒光）和SPC（綠色熒光）雙陽性細(xì)胞明顯增多。因此，我們認(rèn)為AECII 細(xì)胞凋亡介導(dǎo)了COPD 患者肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺功能下降，并進(jìn)一步導(dǎo)致肺損傷。

p53 是一種腫瘤抑制蛋白，可進(jìn)一步激活p21 靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、抑制細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Foxo3a 是Foxo 亞家族的一個重要成員，其被證實(shí)是參與細(xì)胞存活等重要生物學(xué)過程的基因調(diào)節(jié)因子[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)COPD 患者肺組織中p53 和p21 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)、FoxO3a 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。

因此，我們認(rèn)為AECⅡ凋亡在COPD 患者肺損傷中起到重要作用，其機(jī)制可能與FoxO3a 蛋白表達(dá)下調(diào)及p53、p21 蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)。如何抑制或者逆轉(zhuǎn)COPD 患者AECⅡ細(xì)胞凋亡及其機(jī)制將有待進(jìn)一步。[本研究由嘉興市第一醫(yī)院院級課題重點(diǎn)項(xiàng)目資助（No.2020YJZD017）。]