于文彥 吳攀峰 芮 君 張 弘

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，以排除消化道機(jī)械性梗阻情況下出現(xiàn)的胃排空延遲為主要特點(diǎn)，主要臨床癥狀包括早期飽腹、腹脹腹痛、惡心嘔吐、體質(zhì)量減輕等，嚴(yán)重影響食物、藥物的消化吸收，加重血糖調(diào)節(jié)受損和營(yíng)養(yǎng)不良，進(jìn)而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前DGP 尚缺乏安全有效的治療手段。促胃腸動(dòng)力藥物、胃電刺激、經(jīng)口內(nèi)鏡下幽門肌切開術(shù)（GPOEM）等治療手段，存在部分患者無(wú)法耐受的不良反應(yīng)和一定的治療失效率[2-3]。研究顯示，中醫(yī)藥可顯著減輕DGP 患者胃腸道癥狀，且不良反應(yīng)少，復(fù)發(fā)率低[4]。補(bǔ)中益氣湯是DGP 常用中藥方劑之一，由黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸等藥物組成。研究顯示，補(bǔ)中益氣湯治療DGP 臨床療效良好[5-6]。但目前相關(guān)研究仍相對(duì)較少，其作用機(jī)制尚未明確。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供研究方向和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)中益氣湯活性成分及靶點(diǎn)篩選 BATMANTCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）平臺(tái)是一個(gè)基于“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路，以“藥物-靶點(diǎn)相似性”模型篩選靶點(diǎn)，系統(tǒng)揭示中藥復(fù)方化學(xué)成分作用靶點(diǎn)及機(jī)制的在線分析工具[7]。本研究將補(bǔ)中益氣湯組方中的“黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸”完整拼音輸入BATMANTCM 平臺(tái)作為整體對(duì)象，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 為切點(diǎn)，對(duì)補(bǔ)中益氣湯的活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

1.2 DGP 相關(guān)基因的獲取 本研究應(yīng)用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.disgenet.org/）、GenCLiP 3 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、GeneCards 數(shù) 據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）及TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/），以“diabetic gastroparesis（糖尿病胃輕癱）”為關(guān)鍵詞，獲取DGP 相關(guān)基因。

1.3 補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的潛在靶點(diǎn)獲取 將1.1中篩選得到的補(bǔ)中益氣湯作用靶點(diǎn)與1.2 中獲取的DGP 相關(guān)基因取交集，得到補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的潛在作用靶點(diǎn)，并利用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯活性成分-DGP 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.3 中得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)定物種為“homo sapiens（人類）”，設(shè)定最低相互作用評(píng)分置信度為0.70，獲得交集靶點(diǎn)所編碼蛋白的相互作用結(jié)果。將該結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯和DGP 的交集蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)CytoNCA 插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖中各節(jié)點(diǎn)的度中心度、中介中心度和接近中心度，以進(jìn)一步衡量網(wǎng)絡(luò)中各蛋白的關(guān)聯(lián)性和重要性。

1.5 交集靶點(diǎn)基因功能分類及通路富集分析 利用Cytoscape3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對(duì)交集靶點(diǎn)基因的細(xì)胞功能、分子功能和生物功能進(jìn)行基因分類（gene ontology，GO）富集分析及可視化。使用Cytoscape3.7.1 軟件中的CluePedia 插件對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析及可視化。設(shè)定P 值＜0.05 為統(tǒng)計(jì)閾值，得到補(bǔ)中益氣湯治療GDP 的潛在作用通路。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯主要活性成分及靶點(diǎn) 在BATMANTCM 平臺(tái)收集補(bǔ)中益氣湯的活性成分，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 作為篩選切點(diǎn)，去除重復(fù)后，得到236 種補(bǔ)中益氣湯活性化學(xué)成分，及各活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，共計(jì)1674 個(gè)。

2.2 DGP 相關(guān)基因及藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 為全面充分地收集DGP 相關(guān)基因，本研究通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO、DisGeNET、GenCLiP 3、GeneCards、TTD）進(jìn)行收集，獲取DGP 相關(guān)基因582 個(gè)。將其與補(bǔ)中益氣湯活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)取交集后，得到130 個(gè)補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的潛在靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)185 個(gè)活性成分。利用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯活性成分-DGP 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見圖1）。該網(wǎng)絡(luò)中共有315 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物活性成分節(jié)點(diǎn)185 個(gè)，疾病靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)130 個(gè)，成分與靶點(diǎn)間存在1256 條相互作用連線。根據(jù)圖1，活性成分三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)最多，為26 個(gè)，其次為呋喃色酮（Visnagin），對(duì)應(yīng)25 個(gè)靶點(diǎn)，十七醇（1-heptadecanol），對(duì)應(yīng)21 個(gè)靶點(diǎn)，香芹酚（carvacrol），對(duì)應(yīng)19個(gè)靶點(diǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，79.23%的靶點(diǎn)與2 個(gè)以上活性成分相互作用，69.19%的活性成分調(diào)控2 個(gè)以上靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了中藥“多成分-多靶點(diǎn)”的整體調(diào)節(jié)作用。

2.3 補(bǔ)中益氣湯和DGP 交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將130 個(gè)藥物-疾病交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯和DGP 的交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，連線表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示度中心度值的大小。節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，度中心度值越大，表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。連線的粗細(xì)表示合并分值的高低，連線越粗，分值越高，表示節(jié)點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)。網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生相互作用的節(jié)點(diǎn)有128 個(gè)，共有1198 條連線，各節(jié)點(diǎn)的平均度中心度值為18.71，平均中介中心度值為0.010，平均接近中心度值為0.45。各連線的平均合并分值為0.67。度中心度值、中介中心度值、度接近中心度值均超過(guò)平均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)共有10 個(gè)（見表1）。

表1 補(bǔ)中益氣湯治療糖尿病胃輕癱的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

圖2 補(bǔ)中益氣湯和糖尿病胃輕癱交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 功能富集分析及可視化。設(shè)定P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共獲得32 個(gè)GO 功能富集。用餅狀圖描述參與不同生物學(xué)功能的靶點(diǎn)基因占總交集靶點(diǎn)基因的數(shù)量百分比（見圖3）。結(jié)果顯示，補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（24.44%）、G 蛋白偶聯(lián)受體活性（7.41%）、脂肪酶活性（6.67%）、細(xì)胞凋亡過(guò)程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性（6.30%）、氧化還原酶活性（5.93%）、電壓門控鉀通道活性（5.56%）、AMP 活化蛋白激酶活性（3.70%）、腎上腺素能受體活性（3.33%）、細(xì)胞因子活性（2.96%）等多途徑治療DGP。

圖3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因功能富集分析

使用Cytoscape3.7.1 軟件中的CluePedia 插件對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析及可視化。設(shè)定P 值＜0.05 為統(tǒng)計(jì)閾值，共得到24 條KEGG 通路。用餅狀圖描述參與不同信號(hào)通路的靶點(diǎn)基因占總交集靶點(diǎn)基因的數(shù)量百分比（見圖4）。結(jié)果顯示，補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)催產(chǎn)素信號(hào)通路（42.80%）、AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路（13.98%）、胰島素抵抗（5.08%）、磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號(hào)通路（5.08%）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路（4.66%）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Ras）信號(hào)通路（2.97%）、環(huán)磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信號(hào)通路（1.69%）、血管平滑肌收縮（1.69%）等多條信號(hào)通路治療DGP。

圖4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因通路富集分析

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，糖尿病已成為全球最大的公共衛(wèi)生問題之一[8]。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)2021 年全球糖尿病地圖顯示，全世界約有10.5%的成人患有糖尿病[9]。DGP 是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，研究顯示，50%以上血糖控制欠佳的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)DGP[2]。中醫(yī)認(rèn)為，DGP 可歸于中醫(yī)“消渴”“痞滿”“嘔吐”等范疇。其基本病機(jī)為消渴日久，脾胃受損，運(yùn)化無(wú)力，胃失和降，氣機(jī)不暢[10-11]。因此，DGP 多以脾胃虛弱兼氣滯、痰濁、血瘀等辨證論治，基本治則以健脾和胃、益氣消痞為主。補(bǔ)中益氣湯中黃芪升陽(yáng)固表，人參、甘草、白術(shù)補(bǔ)氣健脾，當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，陳皮理氣和胃，升麻、柴胡升陽(yáng)舉陷。全方具有升清降濁、補(bǔ)氣健脾之功效。既往研究顯示，補(bǔ)中益氣湯可通過(guò)提高糖尿病模型大鼠血漿P 物質(zhì)及胃竇干細(xì)胞因子（SCF）蛋白水平，增強(qiáng)SCF/kit 信號(hào)傳導(dǎo)，改善大鼠胃腸蠕動(dòng)功能，促進(jìn)胃腸排空，從而起到治療DGP的作用[12]。但目前補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的相關(guān)機(jī)制研究相對(duì)較少，其機(jī)制尚不明確。由于補(bǔ)中益氣湯中含多味中藥，化學(xué)成分眾多，且存在多種相互作用，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究方法難以全面深入地研究其有效成分、作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)理論，以生物和醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)研究為核心，對(duì)藥物進(jìn)行多成分、多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系分析，因而可以更加系統(tǒng)、深入地分析中藥方劑治療疾病的作用機(jī)制[13]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索補(bǔ)中益氣湯治療DGP 的機(jī)制，獲得補(bǔ)中益氣湯中與DGP 相關(guān)的活性成分共185 個(gè)，其中三磷酸腺苷、呋喃色酮、十七醇、香芹酚、異黃酮等可作用于較多DGP 靶點(diǎn)。研究顯示，高糖條件下，大鼠胃平滑肌細(xì)胞三磷酸腺苷含量下降，細(xì)胞能量代謝途徑改變，線粒體能量代謝受抑制，糖酵解增加，進(jìn)而可導(dǎo)致DGP 的發(fā)生[14]。呋喃色酮具有良好的抗氧化損傷、抗炎、抑制凋亡作用[15]。波譜分析顯示，新鮮食用仙人掌塊莖中的十七醇可有效降低小鼠血糖水平[16]。研究顯示，香芹酚可減輕化療藥物鹽酸伊立替康導(dǎo)致的腸黏膜炎，降低腸黏膜促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β），炎癥相關(guān)指標(biāo)核因子κB（NF-κB）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和氮氧化物（NOx）的表達(dá)水平[17]。香芹酚還可明顯降低糖尿病小鼠的隨機(jī)血糖以及凋亡相關(guān)因子丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（PDK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）水平，從而改善血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡失衡[18]。此外，研究顯示，富含異黃酮的大豆胚芽面食飲食可改善DGP 患者胃排空延遲，這可能與異黃酮的抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)[19]。DGP的發(fā)病與高血糖、氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)[20-22]。高血糖可導(dǎo)致胃腸肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元凋亡，影響胃收縮功能和胃電節(jié)律，從而導(dǎo)致胃排空速率減慢。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致胃腸道神經(jīng)細(xì)胞退化、凋亡，胃腸道Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（ICC）氧化損傷、數(shù)量減少、超微結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而加重胃排空延遲。胃固有肌層巨噬細(xì)胞極化，炎性因子增加、抗炎因子減少也與DGP 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。綜合上述關(guān)于補(bǔ)中益氣湯核心活性成分及DGP 發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究結(jié)果，我們推測(cè)，補(bǔ)中益氣湯治療DGP 胃排空延遲的主要機(jī)制可能與控制血糖、改善氧化應(yīng)激、凋亡及炎癥反應(yīng)等有關(guān)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)胰島素（INS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素-6（IL6）、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、腎上腺素能受體（AR）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF1）等與DGP 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，對(duì)于1 型糖尿病小鼠，INS 治療可通過(guò)保護(hù)肌間膽堿能神經(jīng)元和ICC，有效延緩糖尿病胃輕癱的發(fā)展[23]。AMP 依賴的蛋白激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AMPK/Akt）、PI3K/Akt 等通路可參與調(diào)節(jié)糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及ICC 損傷[24-26]。IL-6 作為一種促炎因子，在炎癥加重DGP 患者胃排空延遲的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[27]。NOS3 屬于一氧化氮合酶，研究表明，胃腸一氧化氮合酶神經(jīng)元損傷是導(dǎo)致DGP 的重要原因之一[28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)R 可促進(jìn)胃平滑肌細(xì)胞增殖，抑制胃平滑肌細(xì)胞凋亡，從而改善DGP 大鼠的胃排空延遲[29]。IGF-1 治療能夠下調(diào)高糖條件下體外培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬改善DGP 胃排空延遲[30]。綜上，我們推測(cè)補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)作用于上述多靶點(diǎn)，抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自噬，改善氧化應(yīng)激和神經(jīng)損傷，從而影響DGP 的發(fā)生發(fā)展。

GO 富集分析顯示，補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、細(xì)胞凋亡相關(guān)酶活性、氧化還原酶活性、AMP 活化蛋白激酶活性、AR 活性、細(xì)胞因子活性、IGF-1 結(jié)合等多途徑治療DGP，與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)功能研究結(jié)果具有一定一致性。KEGG 通路富集分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，24 條通路與DGP 密切相關(guān)。其中，AMPK 通路、PI3K/Akt 通路與凋亡有關(guān)，HIF-1 通路與缺氧損傷有關(guān)，cGMP/PKG 通路與胃腸道平滑肌細(xì)胞有關(guān)。研究顯示，高糖條件下，活化的AMPK可通過(guò)調(diào)節(jié)p53、Akt、蛋白激酶A（PKA）、磷脂酶C（PLC）等的表達(dá)和活性，直接或間接促進(jìn)大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致DGP 的發(fā)生[24]。去甲烏藥堿可通過(guò)激活β2-AR/PI3K/Akt 通路抑制DGP 大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡[25]。PI3K/Akt 通路激活還可促進(jìn)糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞增殖，補(bǔ)充胃竇ICC 缺失[26]。HIF-1 的表達(dá)與缺氧程度和組織缺血狀態(tài)密切相關(guān)。研究顯示，DGP 大鼠胃黏膜HIF-1 表達(dá)上調(diào)，提示胃黏膜細(xì)胞缺氧可能是胃排空延遲的始動(dòng)因素或關(guān)鍵步驟，在DGP 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[31]。磷脂酶C-肌醇三磷酸-鈣離子/一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G（PLC-IP3-Ca2+/NO-cGMP-PKG）通路可通過(guò)調(diào)節(jié)DGP 大鼠胃平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，影響DGP 發(fā)生發(fā)展[32]。此外，KEGG 通路富集分析還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素抵抗通路、腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)通路、cAMP 信號(hào)通路等治療DGP。上述分析結(jié)果與交集靶點(diǎn)的相關(guān)功能研究及GO 富集分析結(jié)果具有高度一致性。

綜合上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè)補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)作用于多靶點(diǎn)、多通路抑制凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)胰島素、血糖水平，從而改善胃腸道平滑肌細(xì)胞和ICC 損傷，以影響DGP 的發(fā)生發(fā)展。本研究為補(bǔ)中益氣湯治療DGP 提供一定理論依據(jù)，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考方向。但目前DGP 的相關(guān)研究仍相對(duì)較少，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中納入的疾病相關(guān)基因相對(duì)有限。此外，由于中藥復(fù)方的化學(xué)成分和作用方式較復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究仍存在一定局限性，尚不能完全反映藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，如實(shí)際發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的具體方式，上調(diào)還是下調(diào)等。因此，本研究結(jié)果仍有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。