劉 丹，王嘉宇，馮章麗，馮 博，陳溫福

(1 遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 貴州遵義 563006；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北水稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 沈陽 110866；3遵義師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院, 貴州遵義 563006)

核心親本在品種的更替過程中起重要的推動作用，它們具有使用頻率高、綜合性狀好的特點，利用它們作為親本容易培育出性狀優(yōu)良的新品種。近年來，隨著種業(yè)保衛(wèi)戰(zhàn)和種子“卡脖子”問題的提出，研究核心親本的形成和利用過程，分析核心親本的遺傳背景已成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究熱點。目前，前人已經(jīng)對馬鈴薯[1]、大豆[2]、甘薯[3]、油菜[4]等農(nóng)作物核心親本的演化和利用開展了相關(guān)研究，但至今為止有關(guān)東北三省粳稻核心親本的系統(tǒng)研究報道相對較少。

東北三省是中國優(yōu)質(zhì)粳稻的主產(chǎn)區(qū)，水稻種植面積占中國粳稻總面積的50%以上[5]，培育出優(yōu)良粳稻新品種對保障國家糧食安全意義重大。盡管相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明[6]，近三年來，東北三省共審定水稻新品種628個，品種審定數(shù)量很大，但同質(zhì)現(xiàn)象嚴(yán)重，大部分品種的推廣應(yīng)用率低，缺乏具有突破性的主導(dǎo)新品種。核心親本的遺傳多樣性是影響能否育成突破性品種的關(guān)鍵。遺傳多樣性越豐富，物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)[7]，用于選育新品種的潛力就越大。已有的研究表明，東北三省水稻育成品種的血緣關(guān)系比較集中，遺傳基礎(chǔ)狹隘，大部分材料具有相同的遺傳背景[8-11]，但對相關(guān)的育種核心親本的遺傳多樣性水平還知之甚少。因此，深入分析東北三省水稻育種核心親本的遺傳關(guān)系，有效拓寬東北三省水稻雜交親本的遺傳基礎(chǔ)，對于育成突破性新品種已勢在必行。

開展亞種間雜交，引入秈稻血緣，為拓寬粳稻遺傳背景提供了新途徑。Sun等[12]和高虹等[13]研究認(rèn)為秈稻血緣為中國粳型超級稻增產(chǎn)做出了重要貢獻(xiàn)。劉丹等[14]研究結(jié)果表明，15份東北三省育成的粳型超級稻品種均含有一定的秈型血緣。然而，目前對秈稻血緣在東北育種核心親本基因組所占比重和利用固定區(qū)域都不明確。因此，量化東北粳稻核心親本的血緣組成，對于充分發(fā)揮秈粳亞種間雜種優(yōu)勢，精準(zhǔn)改良育種核心親本，豐富東北稻區(qū)粳稻遺傳基礎(chǔ)具有重要的參考價值。目前，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記從DNA水平上進(jìn)行遺傳基礎(chǔ)解析已成為一種重要技術(shù)手段。為了更深入地從分子層面剖析水稻的秈粳遺傳分化，研究者們根據(jù)秈粳稻亞種間的基因組序列差異，開發(fā)出了不同類型的分子標(biāo)記[15-19]，其中InDel分子標(biāo)記屬于共顯性標(biāo)記，具有簡單、高效、可重復(fù)性好的特點，已廣泛應(yīng)用于水稻的秈粳分化研究。

本研究通過對2021年東北三省審定水稻新品種的系譜進(jìn)行分析，確定20份育種材料為核心親本，并利用SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記對其遺傳多樣性和秈粳分化進(jìn)行研究，研究結(jié)果旨在為東北地區(qū)粳稻育種的核心親本保護(hù)、選擇和利用提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗以從東北三省2021年審定的256個水稻新品種的系譜分析中篩選出的20份育種核心親本為材料，其中遼寧省核心親本6份，吉林省核心親本5份，黑龍江省核心親本9份，詳細(xì)信息如表1。

1.2 水稻基因組DNA提取

在田間每份參試材料選取一個單株，于抽穗期取劍葉葉片裝于自封袋，置于冰盒中帶回實驗室備用。取出一片葉去掉葉脈后剪碎，裝于2 mL離心管，加入鋼珠，利用細(xì)胞震蕩破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后采用2% CTAB法提取DNA，操作步驟參照Doyle等[20]。

1.3 分子標(biāo)記選擇及檢測

試驗選取覆蓋水稻12條染色體上的78對引物進(jìn)行分析，包括來源沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所的44對SSR多態(tài)性引物和34對InDel秈粳特異性引物[16]，引物委托北京六合華大基因合成。PCR擴(kuò)增體系為15 μL，包含DNA(20 ng/L)2 μL，前后引物各2 μL，2×Mix混合體系7.5 μL，ddH2O 1.5 μL。SSR引物PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。InDel引物PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)，72 ℃ 8 min，4 ℃保存。采用6%聚丙稀酰胺變性凝膠電泳和3%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以“0、1、9”統(tǒng)計SSR擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣。利用PowerMarker V3.25軟件[21]計算主要等位位點頻率(Maf)、等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性指數(shù)(H)及多態(tài)性信息含量(PIC)，計算頻率自舉樹，并利用MEGA7.0.21[22]軟件進(jìn)行NJ聚類分析。利用Structure 2.3.4軟件[23-24]完成參試材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析，將MCMC開始時的不作數(shù)迭代設(shè)為10 000次，將不作數(shù)迭代后的MCMC迭代設(shè)為100 000次，K值設(shè)置為1～10，每個K值都獨立運(yùn)算了10次。根據(jù)Structure的運(yùn)算結(jié)果計算ΔK值，計算公式為ΔK= mean[|L''(K)|]/sd[L(K)]，根據(jù)ΔK值確定最可能的K值，數(shù)據(jù)處理和計算均在Excel2010上進(jìn)行。

以“XX、GG、XG”統(tǒng)計InDel擴(kuò)增帶型，擴(kuò)增產(chǎn)物帶型以典型秈稻9311和典型粳稻‘日本晴’的帶型為對照。同一位點上條帶與9311帶型一致的記為“XX”，與‘日本晴’帶型一致的記為“GG”，雜合帶型記為“XG”。參試材料的秈(粳)型基因頻率Fx(Fg)計算公式為：

其中Mxx為純合秈稻基因型(XX)數(shù)目；Mgg為純合粳稻基因型(GG)數(shù)目；Mxg為秈粳稻雜合基因型(XG)數(shù)目；N為所包括引物對(位點)的數(shù)目[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北三省2021年審定水稻品種的系譜分析

根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)中心[6](中國水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫，http://www.ricedata.cn/variety/)發(fā)布的結(jié)果，東北三省2021年審定水稻品種共256個，其中遼寧省審定水稻品種16個，吉林省審定水稻品種69個，黑龍江省審定水稻品種171個。對256份審定材料的系譜進(jìn)行追溯和分析，選擇出20份育種核心親本，由它們育成的品種數(shù)量172個，占育成品種數(shù)的67%(圖1，A)。選擇出的20份核心親本中，遼寧省核心親本6個，育成品種8個，水稻品種核心親本使用占比50.00%(圖1，B)；吉林省核心親本9個，育成品種44個，水稻品種核心親本使用占比63.77%(圖1，C)；黑龍江省核心親本14個，育成品種120個，水稻品種核心親本使用占比70.18%(圖1，D)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，核心親本‘遼星1’、‘吉粳88’、‘五優(yōu)稻1號’、‘五優(yōu)稻4號’、‘遼粳5’、‘龍稻5’和‘吉玉粳’這7個品種至少在兩省份都得到利用。

2.2 SSR擴(kuò)增多態(tài)性分析

選取的44對SSR多態(tài)性引物對20份育種核心親本進(jìn)行擴(kuò)增。共檢測到130個等位基因，每個引物位點擴(kuò)增等位基因(Na)變幅為2～5個，平均等位基因數(shù)為2.95個(表2)。主要等位位點頻率(Maf)變幅為0.30～0.95，平均主要等位位點頻率為0.68?；蚨鄻有灾笖?shù)(H)變幅為0.10～0.75，平均主要等位位點頻率為0.41。多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.09～0.70，平均主要等位位點頻率為0.36。由此可見，參試材料的遺傳多樣性水平較低，遺傳基礎(chǔ)不夠豐富。此外，引物RM259、RM246、PSM132、RM44以及RM536等位點檢測到的遺傳多樣性參數(shù)值較大，表明這些位點能夠較好地反映出參試核心親本材料的遺傳多樣性。

表2 SSR多態(tài)性標(biāo)記的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity information of polymorphic SSR markers

2.3 核心親本遺傳多樣性分析

東北三省水稻育種核心親本在44個SSR位點的遺傳多樣性分析(表3)顯示，3個省份核心親本的等位基因變幅為1.95～2.27，基因多樣性指數(shù)變幅為0.30～0.34，多態(tài)性信息含量變幅為0.25～0.30。其中黑龍江省核心親本的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量均表現(xiàn)最高，表明東北三省中，黑龍江省核心育種親本的遺傳多樣性最為豐富。

表3 東北三省核心親本遺傳多樣性Table 3 The genetic diversity of core parents in Northeast China

2.4 核心親本聚類分析

利用44對多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的結(jié)果，根據(jù)Nei’s遺傳距離，進(jìn)行NJ聚類分析。20份參試材料可分為3個類群，其中第Ⅰ類群材料包括4份材料，分別為‘吉玉粳’、‘吉粳88’、‘吉粳83’以及‘長白19’，均來自于吉林省。第Ⅱ類群材料包括10份材料，可以再細(xì)劃分為2個亞類群，其中第Ⅱ-1亞群包括5份材料，來自于吉林省和黑龍江省，分別為‘長白9’、‘五優(yōu)稻1號’、‘龍稻5’、‘五優(yōu)稻4號’、‘龍粳10’；第Ⅱ-2亞群包括5份材料，均來自于黑龍江省，分別為‘龍粳31’、‘龍粳21’、‘墾稻10’、‘合江19’以及‘綏粳4’。第Ⅲ類群材料包括6份材料，可以再細(xì)劃分為2個亞類群，其中第Ⅲ-1亞群包括5份材料，均來自于遼寧省，分別為‘鐵粳7’、‘遼粳5’、‘沈農(nóng)265’、‘遼粳454’、‘遼星1’；第Ⅲ-2亞群包括1份材料，為來自于遼寧省的‘鹽豐47’。由此可見，‘鹽豐47’與其他材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且東北三省20份核心親本基本形成了各自獨立的類群(圖2)。進(jìn)一步對這20份材料的系譜進(jìn)行分析(圖3)，參試20份材料的血緣均可追溯到最早期的日本水稻材料親本，如‘豐錦’、‘愛國’、‘黎明’、‘笹錦’、‘石狩白毛’、‘早生坊主’等?！辖?9’和‘墾稻10’的血緣都有一部分來自于‘合江12’，它們具有較近的親緣關(guān)系，這與NJ聚類圖結(jié)果相符。

2.5 核心親本遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于Structure2.3.4模型，將群體數(shù)目(K)設(shè)定為1～10，10次重復(fù)，對參試材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。由圖4可知，當(dāng)K=2時，ΔK值為652.17，此處出現(xiàn)最大拐點，由此可以判斷出20份核心親本可以劃分為兩個穩(wěn)定的類群。

當(dāng)K=2時，20份核心親本的遺傳結(jié)構(gòu)和群體組成分析(圖5)顯示，20份參試材料被劃分成A和B兩個類群，其中A類群包含11份材料，B類群包含9份材料。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，參試材料中，遼寧省育種核心親本均處于A類群，黑龍江省育種核心親本均處于B類群，而吉林省核心親本分布于A類群之中。

2.6 核心親本的秈粳分化

利用34 對 InDel 標(biāo)記計算參試20份材料的秈型基因頻率(Fx)。由表4可知，盡管20份核心親本遺傳背景均為粳稻類型，但均含有一定的秈型血緣位點。參試材料的秈型基因頻率Fx在0.01～0.19范圍內(nèi)，其中‘龍粳21’的Fx最大為0.19，而‘墾稻10’的Fx值最小為0.01。進(jìn)一步分析東北三省不同核心親本的秈型基因頻率可知，遼寧省、吉林省、黑龍江省核心親本秈型基因頻率Fx平均分別為0.07、0.08、0.05，黑龍江省核心親本的秈型血緣位點低于遼寧省和吉林省。

表4 20份東北水稻核心親本的秈型基因頻率Table 4 Fx of 20 rice core parents in Northeast China

3 討 論

3.1 東北水稻核心親本的更替

水稻品種更替對于提高產(chǎn)量，保證水稻生產(chǎn)持續(xù)增長十分必要。中國水稻育種取得了舉世矚目的成就，水稻發(fā)展先后經(jīng)歷了矮化育種和雜交稻育種兩次技術(shù)革命，育成的水稻品種出現(xiàn)了多次新品種的更新?lián)Q代[25]。程芳艷等[26]對黑龍江省2010～2014年審定水稻品種的骨干親本進(jìn)行追溯，發(fā)現(xiàn)不同積溫帶常以選育品種最多的親本作為該區(qū)最新的骨干親本，一些早期從日本引進(jìn)的重要親本如‘下北’、‘農(nóng)林11’和‘屜錦’等，已經(jīng)退出歷史舞臺，而像‘富士光’、‘上育397’和‘空育131’等日本品種，盡管建國初期在黑龍江省水稻生產(chǎn)和品種選育中具有重要地位，但近年來利用率不斷減小，取而代之的是自主育成的品種，如由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院五常水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)稻品種‘五優(yōu)稻1號’，已成為近幾年利用率較高的骨干親本。趙一洲等[25]對遼寧省水稻骨干親本進(jìn)行分析，研究表明隨著育種時間的推移，骨干親本不斷發(fā)生更替，新的骨干親本不斷產(chǎn)生，舊的骨干親本不斷淘汰，且親本利用愈加向少數(shù)骨干親本集中。本研究通過對東北三省2021年審定的256個水稻品種進(jìn)行系譜分析，獲得了20份育種核心親本。對這些育種核心親本的審定時間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)20份材料的審定時間范圍在1978～2011年，時間跨度大，核心親本利用和更替周期較長。20份核心親本中，2000年以來育成的品種13份，占比65%，表明2000年以來中國東北粳稻育種也取得了階段性成就，培育出了一些新的重要核心親本材料。同時，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，20份育種核心親本分布情況為遼寧省6個，吉林省5個，黑龍江省9個，且其中的核心親本‘遼星1’、‘吉粳88’、‘五優(yōu)稻1號’、‘五優(yōu)稻4號’、‘遼粳5’、‘龍稻5’、‘吉玉粳’這7個品種至少在兩省中都得到利用，表明優(yōu)良的品種易被多個育種單位引用作為核心育種親本，與前人研究結(jié)果相符。這可能是導(dǎo)致東北三省現(xiàn)有品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種同質(zhì)性嚴(yán)重的一個重要原因。此外，在核心親本的利用過程中，一個重要問題就是如何保護(hù)和鑒別品種的真?zhèn)?，更好地服?wù)于育種。曾曉珊等[27]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了27個水稻核心親本指紋圖譜，為核心親本的保護(hù)，品種真?zhèn)魏图兌鹊蔫b定提供了可靠依據(jù)，這也為我們下一步工作提供了思路。

3.2 東北水稻核心親本遺傳多樣性

遺傳多樣性是進(jìn)行品種資源評價的重要手段，也是水稻育種親本選育的前提和基礎(chǔ)。趙一洲等[28]對遼寧省水稻骨干親本遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)骨干親本間表型變化差異較小，親緣關(guān)系較近。李修平等[29]對寒地水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，認(rèn)為參試寒地水稻種質(zhì)遺傳多樣性較低。齊永文等[30]對中國水稻選育品種遺傳多樣性及其近50 年變化趨勢進(jìn)行研究，結(jié)果表明在表型、同工酶和SSR 水平上，東北稻區(qū)粳稻品種均表現(xiàn)出較低的多樣性。本研究結(jié)果表明，參試的東北三省2021年審定水稻品種的核心親本遺傳多樣性較低，親緣關(guān)系較近，這一點與前人研究結(jié)果一致。NJ聚類和品種系譜分析表明，東北地區(qū)水稻育種核心親本遺傳基礎(chǔ)狹窄以及這些核心親本的高頻率利用，可能是導(dǎo)致現(xiàn)有育成品種親緣關(guān)系較近的主要原因之一。因此，要擴(kuò)大現(xiàn)有品種的遺傳多樣性水平，根本在于豐富育種核心親本的多樣性水平，創(chuàng)新和挖掘新的優(yōu)良核心種質(zhì)資源。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)東北三省水稻育種核心親本中，以黑龍江省材料的遺傳多樣性略高于吉林和遼寧兩省，這與李紅宇等[8]的研究結(jié)果類似，但與王海澤[31]研究結(jié)果存在差異，分析原因可能與樣本材料的類型和數(shù)量有關(guān)。

3.3 東北水稻核心親本的秈粳分化

自20世紀(jì)50年代楊守仁在遼寧省開展秈粳雜交育種研究以來，中國東北稻區(qū)育種家利用秈粳雜交技術(shù)，在粳稻中引入秈稻血緣，拓寬東北粳稻遺傳基礎(chǔ)，培育出理想株型與優(yōu)勢利用相結(jié)合的超級稻品種取得了重大突破[32-36]。由于秈稻與粳稻對溫度、光照的響應(yīng)存在差異，明確秈稻血緣在東北水稻中的含量變化，對于東北粳稻中秈稻血緣的利用具有重要指導(dǎo)意義。劉丹等[14]研究表明，東北地區(qū)近年來育成的粳型超級稻品種均含有一定的秈型血緣，且隨著時間的推進(jìn)，近現(xiàn)代以來育成品種的秈型基因頻率逐漸增加。劉迪等[37]研究也指出，20世紀(jì)80年代后秈粳雜交育種實踐引入的秈稻基因不僅豐富了東北粳稻的遺傳構(gòu)成，而且“適量”秈稻血緣的應(yīng)用對今后北方粳稻育種有重要作用。本研究結(jié)果表明，東北三省水稻育種核心親本存在秈粳分化，20份參試核心親本均為粳稻類型，但都含有秈型血緣。對東北三省不同地區(qū)核心親本的秈型基因頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三省核心親本秈型基因頻率Fx大小趨勢為：吉林省>遼寧省>黑龍江省，這可能與吉林省的特殊地理位置和氣候條件有關(guān)。

綜上所述，核心親本在東北水稻育種工作中發(fā)揮著極其重要的作用。今后，如何更好地拓寬水稻育種核心親本的遺傳背景，挖掘新的核心親本資源，推進(jìn)品種的更替，是擺在我們面前的一項重要工作，也是解決東北水稻種子“卡脖子”技術(shù)難題的關(guān)鍵所在。