羅 文，羅 鋼，周玉玲，胡佩宏，張青林，王莎莎，明 媚

（鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院·湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院眼科,湖北黃石435000）

Graves ?。℅raves disease，GD）是與甲狀腺上皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞免疫與體液免疫紊亂導(dǎo)致的自身免疫疾病，表現(xiàn)為甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，自身抗體的大量產(chǎn)生[1-2]。GD 發(fā)病較為復(fù)雜，尚未闡明GD 的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，大量研究表明T淋巴細(xì)胞在此過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，多種細(xì)胞因子參與GD 的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程[3]。研究表明，輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)作為一種新的CD4+T 細(xì)胞亞群，其與GD 的發(fā)生與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，而白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17 是其產(chǎn)生的一類重要細(xì)胞因子[4-5]，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-23 能夠促進(jìn)Th17 細(xì)胞的增殖，穩(wěn)定Th17 細(xì)胞，預(yù)測(cè)其與GD 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[6]。Klotho 蛋白是一種能夠調(diào)節(jié)磷代謝與維生素D 的重要調(diào)控因子，其能夠參與GD 的發(fā)生、發(fā)展[7]。關(guān)于IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白變化與GD 發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性文獻(xiàn)報(bào)道較少，故本研究主要探究GD患者血清中IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白水平的變化，為患者臨床治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年3月～2018年3月于鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院就診的GD 患者50例作為觀察組，其中男性27 例，女性23 例，年齡17 ～72（36.98±9.23）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GD病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②臨床資料完整；③近一個(gè)月未使用激素及免疫制劑者；④患者及其家屬同意參與本研究，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫疾病者；②患有其他類型甲狀腺疾病者或患有甲狀腺疾病家族史者；③嚴(yán)重心腎功能不全者；④不配合治療者。同時(shí)選擇同期于我院進(jìn)行健康體檢的健康人群50 例作為對(duì)照組，其中男性24 例，女性26 例，年齡18 ～73（37.08±8.96）歲。兩組性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），ELISA 試劑盒（上海浩本生物科技有限公司），免疫電化學(xué)發(fā)光法（羅氏公司）；

1.3 方法 兩組均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血5 ml，平均分為兩份，一份血液4 500 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，離心后取上清，利用ELISA 試劑盒檢測(cè)兩組血清中IL-23(批號(hào)：20170113)，IL-17(批號(hào)：20170304)含量及Klotho蛋白(批號(hào)：20170211)的變化，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另一份血液采用免疫電化學(xué)發(fā)光法（批號(hào)：1801023）檢測(cè)患者體內(nèi)促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和TSH受體抗體（TSH-receptor antibody，TRAb）的含量，并對(duì)患者進(jìn)行24 個(gè)月的隨訪，分析患者IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白變化情況以及體內(nèi)各激素變化情況?；颊叨ㄆ趯?duì)體內(nèi)各激素進(jìn)行檢查，隨訪過(guò)程中，一經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)患者體內(nèi)激素超過(guò)正常值即停止隨訪，即患者出現(xiàn)不良預(yù)后。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有研究數(shù)據(jù)均在SPSS19.0 軟件上運(yùn)行處理，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)及診斷臨界值的確定采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC），并計(jì)算曲線下面積。Kaplan-Meier 生存分析不同IL-23，IL-17 和Klotho蛋白水平下GD 患者不良臨床轉(zhuǎn)歸（出現(xiàn)細(xì)菌感染、自身免疫紊亂、誘發(fā)關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫疾病）發(fā)生率，Log-Rank 檢驗(yàn)差異性，采用檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為P＜0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中TSH，F(xiàn)T4，F(xiàn)T3，TRAb 水平及IL-17，IL-23，Klotho 蛋白含量變化 見(jiàn)表1。觀察組患者體內(nèi)FT4，F(xiàn)T3，TRAb 水平及血清中IL-17，IL-23，Klotho 蛋白含量均高于對(duì)照組，TSH含量明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 兩組一般資料比較及甲功三項(xiàng)、相關(guān)抗體比較（n=50，±s）

表1 兩組一般資料比較及甲功三項(xiàng)、相關(guān)抗體比較（n=50，±s）

項(xiàng)目觀察組對(duì)照組tP TSH(mU/L)0.04±0.011.62±0.31-36.0210.000 FT4(pmol/L)68.73±1.87 16.33±2.01134.9640.000 FT3(pmol/L)31.98±1.737.83±0.8688.3900.000 TRAb(U/L)P19.89±1.270.28±0.09108.9110.000 IL-17(pmol/L) 47.83±1.62 26.83±1.0177.7830.000 IL-23(pg/ml)52.98±6.31 10.92±2.0144.9100.000 Klotho(ng/L)8.97±0.126.13±0.1796.5070.000

2.2 GD 組患者IL-17，IL-23 及Klotho 與TSH，F(xiàn)T4，F(xiàn)T3 及TRAb 的相關(guān)性 見(jiàn)表2。GD 組患者血清中IL-17，IL-23，Klotho與TSH呈顯著負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與FT3，F(xiàn)T4，TRAb 呈顯著正相關(guān)（均P＜0.05）。

表2 GD 組患者IL-17，IL-23 及Klotho 與甲狀腺功能指標(biāo)相關(guān)性

2.3 ROC 曲線分析 見(jiàn)表3，圖1。將GD 組與對(duì)照組患者血清IL-23，IL-17 及Klotho 作ROC 曲線，ROC 曲線顯示IL-23，IL-17 及Klotho 具有較高的靈敏度與特異度，這些指標(biāo)對(duì)GD 具有一定的診斷

3 討論

Graves 病（GD）作為一種人體特異性的自身免疫疾病，是甲狀腺功能亢進(jìn)癥中常見(jiàn)病癥，其發(fā)病與細(xì)胞免疫、體液免疫紊亂密切相關(guān)[9]。長(zhǎng)期以來(lái)的研究表明，自身免疫疾病的發(fā)生與Th1，Th2細(xì)胞介導(dǎo)相關(guān)，Th17 細(xì)胞屬于CD4+T 細(xì)胞亞群，價(jià)值。

表3 IL-23，IL-17，Klotho 蛋白曲線下面積、特異度、靈敏度及cut-off值

圖1 IL-23，IL-17，Klotho 水平預(yù)測(cè)ROC 曲線圖

2.4 Kaplan-Meier 生存分析 見(jiàn)表4，圖2。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示高IL-23 水平、高IL-27水平、高Klotho 水平患者不良預(yù)后發(fā)生率高于低IL-23 水平、低IL-27 水平、低Klotho 水平。該細(xì)胞亞群具有獨(dú)立效應(yīng)，與Th1 和Th2 細(xì)胞在免疫學(xué)功能上有較大區(qū)別[10]。Th17 細(xì)胞主要分泌IL-17，能夠參與多種自身免疫疾病發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，釋放大量的炎癥因子，影響機(jī)體免疫性抗體的產(chǎn)生[11]。IL-23 只有與受體復(fù)合物如IL-23R 結(jié)合后才能夠發(fā)揮促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化與Th17 細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，在促進(jìn)自身免疫性疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12]。Klotho 蛋白能夠參與人體體內(nèi)多種生理、生化過(guò)程，能夠通過(guò)抑制Treg，Th17 細(xì)胞相關(guān)免疫細(xì)胞因子水平，降低體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。

表4 各指標(biāo)Log-Rank 值

圖2 IL-23，IL-17，Klotho 對(duì)GD 患者預(yù)后影響分析

本研究結(jié)果表明，觀察組患者血清中IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白含量明顯高于對(duì)照組，且IL-17，IL-23，Klotho 與TSH 呈顯著負(fù)相關(guān)， 與FT3，F(xiàn)T4，TRAb 呈顯著正相關(guān)。提示IL-17，IL-23 及Klotho 蛋白可能在GD 發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用。白細(xì)胞介素是機(jī)體中一類重要的細(xì)胞因子，能夠參與機(jī)體中炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、促進(jìn)免疫細(xì)胞活化等過(guò)程[14-15]。IL-17 蛋白分子量約為3 500 Mr，基因位于人染色體6p12 上，能夠表達(dá)翻譯15 個(gè)氨基酸。大量研究表明，一方面IL-17能夠通過(guò)NF-JB 及P13K/AKT 等途徑的調(diào)控來(lái)增強(qiáng)自身蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)多種細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與多種自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展等進(jìn)程。另一方面，IL-17 還可以作為促炎癥因子能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞，通過(guò)增強(qiáng)其他炎癥因子如TNF-α，IL-4 等的釋放產(chǎn)生趨化因子，加劇趨化白細(xì)胞聚集，加劇炎癥反應(yīng)[16]。IL-17 細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力患者體內(nèi)表達(dá)量呈現(xiàn)高表達(dá)[17-19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)敏性哮喘小鼠體內(nèi)IL-17 表達(dá)量顯著增高，并證實(shí)IL-17 可能是在急性氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程中引發(fā)炎癥的主要因素[20-21]。IL-23 是由p40 與p19 兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，IL-23 需要與IL-12B1，IL-23R 等受體復(fù)合物結(jié)合后才能發(fā)揮作用，IL-23能夠增強(qiáng)Th17 細(xì)胞及IL-17 細(xì)胞因子的表達(dá)，在機(jī)體抗感染中及促進(jìn)自身免疫疾病發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。有學(xué)者[22]通過(guò)敲除Th17 細(xì)胞上游IL-23p19 基因，發(fā)現(xiàn)IL-23 可能通過(guò)調(diào)控Th17 細(xì)胞釋放IL-17 調(diào)控GD 病情的發(fā)展。王雯等[23]研究結(jié)果表明，Klotho 蛋白在GD 患者血清中的含量顯著升高，是由于GD 患者體內(nèi)異常免疫狀態(tài)引起的反應(yīng)性升高，起到抗炎等保護(hù)性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Klotho 蛋白能夠通過(guò)抑制體內(nèi)與Treg 和Th17 細(xì)胞相關(guān)的免疫細(xì)胞因子，Klotho 蛋白還能夠抑制宮頸癌荷瘤小鼠體內(nèi)TGF-β/Foxp3/RORγt 信號(hào)通路對(duì)Treg 與Th17 細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，起到控制疾病進(jìn)程的作用[24]，我們預(yù)測(cè)Klotho 蛋白在GD 患者體內(nèi)也能夠起到保護(hù)性作用。TSH，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4 和TRAb是甲狀腺功能指標(biāo)，是GD 患者確診的一大依據(jù)[25]，TRAb 能夠促使甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子IL-17，IL-23，IL-6 等，促進(jìn)甲狀腺自身抗體的生成，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致疾病不斷變化[20]。通過(guò)分析IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白與甲狀腺功能指標(biāo)之間的相關(guān)性，能夠進(jìn)一步說(shuō)明炎性細(xì)胞因子IL-23，IL-17 和Klotho 蛋白與GD 的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性，其不僅能夠參與甲狀腺功能的調(diào)控，對(duì)于維持甲狀腺功能穩(wěn)定具有重要作用。本研究結(jié)果表明IL-23，IL-17 與Klotho 具有較高的靈敏度與特異度，提示其可以作為GD 發(fā)病的輔助診斷指標(biāo)。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示高IL-23 水平、高IL-27 水平、高Klotho 水平組患者不良預(yù)后（出現(xiàn)細(xì)菌感染、自身免疫紊亂、誘發(fā)關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫疾?。┌l(fā)生率高于低IL-23 水平、低IL-27 水平、低Klotho 水平，提示IL-23，IL-17 及Klotho 蛋白對(duì)于GD 患者預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。綜上所述，IL-17，IL-23，Klotho 蛋白在GD患者體內(nèi)表達(dá)量含量升高，預(yù)測(cè)三者可能參與GD的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程，可以作為GD 的診斷、治療的重要指標(biāo)，為臨床GD 的治療提供新的方向。