高智俊，周國平，鄭 嵐，肇翊同，王 迅，何智純（上海市血液中心,上海 200051）

室內(nèi)質(zhì)量控制（internal quality control, IQC）由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，以監(jiān)控本實驗室常規(guī)工作的精密度，確定實驗結(jié)果是否可靠，可否發(fā)出報告的一項工作[1]。血液感染性疾病篩查的對象為健康獻血者，在缺乏病史和體征的情況下，更多依賴于實驗室檢測[2]，根據(jù)檢測結(jié)果從健康獻血者中挑出疑似感染者，因此血液篩查需要實驗室的檢測結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性和可靠性。血液篩查的質(zhì)量控制是保證檢測結(jié)果可靠的有效手段[3]。然而，病毒標記物檢測的血液篩查不同于一般的化學檢測，傳統(tǒng)的基于正態(tài)分布原理的質(zhì)控方法可能并不適合非正態(tài)分布的病毒標記物檢測[3]。特別是核酸檢測的IQC 具有更多的復雜性，其IQC 方法一直是業(yè)內(nèi)討論的熱點。本文對本實驗室的質(zhì)控數(shù)據(jù)進行了分析，以當前所使用的室內(nèi)質(zhì)控方法作為標準，在判斷在控的檢測批次中再用兩種不同的IQC 方法進行了分析，為探討合適的血液核酸檢測IQC 方法提供幫助。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控品 本文使用兩種室內(nèi)質(zhì)控品。一種為本實驗室在用質(zhì)控品產(chǎn)自北京康徹斯坦公司。用于羅氏核酸混樣檢測時，HBV DNA，HCV RNA，HIV RNA 濃度分別為 50 IU/ml，1 000 IU/ml，1 000 IU/ml；用于蓋立復核酸單人份檢測時，HBV DNA，HCV RNA，HIV RNA 濃度分別為 50 IU/ml，50 IU/ml，200 IU/ml。另一種為澳大利亞國立血清學參比實驗室（National serdogical Reference Laboratory,NRL）提供的QConnect 質(zhì)控品(評估的質(zhì)控品)，濃度分別為HBV DNA 50 IU/ml，HCV RNA 50 IU/ml，HIV RNA 250 IU/ml，羅氏核酸混樣檢測的質(zhì)控品為三種標記混合在一起的多標記樣品，本實驗室檢測時與5 支陰性血漿混合。蓋立復核酸單人份檢測的質(zhì)控品為單一標記樣品。

1.2 儀器與試劑 本實驗室主要采用Roche COBAS TaqScreen s201 MPX v2.0 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法（簡稱：羅氏）和Grifoles procleixTMTIGRIS Ultrio plus 轉(zhuǎn)錄介導的擴增(transcription-mediated amplification,TMA)方法（簡稱：蓋立復）對血液感染性病毒進行核酸檢測，本文數(shù)據(jù)均來自這兩種檢測系統(tǒng)。

1.3 方法 兩種質(zhì)控品與常規(guī)血液樣品一起進行檢測。收集2019年1月14日～5月31日兩種質(zhì)控品的檢測結(jié)果，將北京康徹斯坦質(zhì)控品的檢測結(jié)果錄入Excel 表格，將澳大利亞QConnect 質(zhì)控品的檢測數(shù)據(jù)錄入EDCNet 軟件。

1.3.1 本實驗室常規(guī)室內(nèi)質(zhì)控方法：羅氏檢測系統(tǒng)每天采用混樣模式檢測一套室內(nèi)質(zhì)控品（1 支HBV DNA，1 支HCV RNA，1 支HIV RNA 陽性室內(nèi)質(zhì)控品與3 支陰性室內(nèi)質(zhì)控品的混樣樣品），蓋立復檢測系統(tǒng)每個工作列表必須包含一套室內(nèi)質(zhì)控品，室內(nèi)質(zhì)控品檢測模式與檢測樣本一致。質(zhì)控品檢測結(jié)果在控的標準：陰性室內(nèi)質(zhì)控品檢測結(jié)果應為內(nèi)標有效的無反應性，陽性質(zhì)控品使用羅氏檢測系統(tǒng)檢測Ct 值（cycle threshold value）須在30 ≤Ct 值＜40 范圍內(nèi)，使用蓋立復檢測系統(tǒng)檢測S/CO 值(absorbance signal of sample/cutoff value)須在5 ＜S/CO 值≤25 范圍內(nèi)。

1.3.2 Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法：將日常血液核酸篩查IQC 結(jié)果作Levey-Jennings 圖，以在用批號的試劑和室內(nèi)質(zhì)控品前20 個點計算均數(shù)（x）和平均差（s），并在圖上劃出x，x±2s 和x±3s 質(zhì)控限，根據(jù)Westgard 多規(guī)則判斷當批檢測是否在控。

1.3.3 NRL 質(zhì)控限法：在使用NRL 同一濃度新批號QConnect 室內(nèi)質(zhì)控品監(jiān)控核酸試驗的有效性和穩(wěn)定性之前，采集來自全球30 個國家的約300 個實驗室使用該批號NRL QConnect 質(zhì)控品的檢測結(jié)果計算NRL 質(zhì)控限[4]，以此來監(jiān)控以后的核酸試驗的有效性和穩(wěn)定性。NRL 質(zhì)控限的計算方法參見文獻[4]，計算時考慮了不同實驗室間正常的檢測變異，也考慮了試劑批號之間的變異。鑒于NRL質(zhì)控限計算的數(shù)據(jù)來自國外核酸單人份檢測，因此，蓋立復核酸單人份檢測方法可直接使用根據(jù)國外數(shù)據(jù)計算得出的NRL 質(zhì)控限，而國內(nèi)羅氏核酸混樣檢測方法不能直接使用NRL 質(zhì)控限，本文羅氏核酸混樣檢測方法 NRL 質(zhì)控限是根據(jù)同一研究階段本實驗室、深圳市血液中心、大連市血液中心和山東省血液中心對QConnect 質(zhì)控品的檢測結(jié)果重新計算而得。如果QConnect 質(zhì)控品的檢測結(jié)果在NRL 質(zhì)控限范圍內(nèi)，則當批檢測在控，否則為失控。

2 結(jié)果

2.1 本實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制情況 2019年1月14

日～5月31日期間應用本實驗室核酸室內(nèi)質(zhì)量控制方法，羅氏核酸混樣檢測康徹斯坦質(zhì)控品在控批次為122 批，失控批次為2 批，失控率1.64%；蓋立復核酸單人份檢測康切斯坦質(zhì)控品，在控批次為275 批，失控批次為0 批，失控率0。在此期間，使用羅氏核酸混樣方法，檢測NRL QConnect 質(zhì)控品332 次，使用蓋立復核酸單人份檢測方法檢測QConnect 質(zhì)控品183 次。

2.2 Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法在控和失控情況 見圖1 和圖2。使用羅氏核酸混樣方法檢測康徹斯坦HCV RNA 質(zhì)控品和使用蓋立復核酸單人份檢測方法檢測康徹斯坦HIV RNA 質(zhì)控品的質(zhì)控圖?？梢娫诟鶕?jù)日常質(zhì)控規(guī)則判斷為在控的檢驗批次中，如果采用Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷HCV RNA 質(zhì)控情況，又出現(xiàn)2 個13s失控和1 個10x失控，其中2 次超出+13s，提示弱陽性質(zhì)控品的檢測值偏低；在蓋立復核酸單人份檢測HIV RNA 質(zhì)控品中，又出現(xiàn)6 個13s失控和1 個22s失控，其中有5 個失控點低于-13s，表明弱陽性質(zhì)控品的檢測值偏低。其他檢測項目的質(zhì)控圖基本與圖1 和圖2 類似。統(tǒng)計所有檢測項目的失控情況匯總見表1。

圖1 羅氏HCV RNA 檢測質(zhì)控圖

圖2 蓋立復HIV RNA 檢測質(zhì)控圖

表1 使用Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷失控情況匯總

2.3 NRL 質(zhì)控限法在控和失控情況 使用NRL QConnect 質(zhì)控品，蓋立復核酸單人份檢測，在本實驗室核酸質(zhì)控方法判斷在控的檢測批次中，使用NRL 質(zhì)控限進行室內(nèi)質(zhì)量IQC，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)失控情況；羅氏核酸混樣檢測，在本實驗室核酸質(zhì)控方法判斷在控的檢測批次中，使用NRL 質(zhì)控限的計算方法，計算本實驗室的質(zhì)控限，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBV DNA 核酸檢測和HIV RNA 核酸檢測中各有1 個失控結(jié)果（0.30%）見表2。圖3 和圖4 分別為羅氏核酸混樣檢測HIV RNA 質(zhì)控品和蓋立復核酸單人份檢測HCV RNA 質(zhì)控品的質(zhì)控結(jié)果，其他檢測項目與該結(jié)果相似。

3 討論

血液篩查感染性病毒核酸檢測作為一種定性檢測，其室內(nèi)質(zhì)量控制方法一直是業(yè)內(nèi)討論的熱點。目前各血站常用的室內(nèi)質(zhì)量控制技術(shù)有：①選擇2 ～5 倍檢測限濃度的質(zhì)控品作定性監(jiān)測；②以質(zhì)控品的Ct值作質(zhì)控圖，并以Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷是否在控；③在定性監(jiān)測基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列判定指標，綜合分析核酸檢測的室內(nèi)質(zhì)控。

表2 使用QConnect 質(zhì)控品，按NRL 質(zhì)控限方法進行室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果

圖3 使用QConnect 質(zhì)控品按NRL 質(zhì)控限法進行羅氏HIV RNA 室內(nèi)質(zhì)量控制

圖4 使用QConnect 質(zhì)控品按NRL 質(zhì)控限法進行蓋立復HCV RNA 室內(nèi)質(zhì)量控制

第一種方法單獨使用時存在一定的缺陷，因為核酸檢測是單管獨立反應，室內(nèi)質(zhì)控品的檢測情況并不能完全代表待檢樣品的真實反應情況，簡單的定性監(jiān)測不一定能發(fā)現(xiàn)實驗室的系統(tǒng)偏差和大部分的隨機偏差。

第二種是以室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果作Levey-Jennings 圖，加以Westgard 多規(guī)則質(zhì)控的方法在國內(nèi)一些血液篩查核酸實驗室用以判斷檢測是否在控[4-6]。該方法雖然比單純定性監(jiān)測能提供更多的穩(wěn)定性和重復性信息，但由于樣本間的Ct值是指數(shù)關(guān)系，而不是線性關(guān)系，不能使用t檢驗或方差分析等這些正態(tài)分布的方法對Ct值進行統(tǒng)計分析[7-8]，因此，按Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法以Ct值作為指標判斷PCR 檢測結(jié)果是否在控時，可能會造成許多“假失控”[9]。本研究結(jié)果表明，蓋立復核酸單人份檢測方法出現(xiàn)假失控的概率會高于羅氏方法，這主要是因為蓋立復的轉(zhuǎn)錄介導的擴增（transcription-mediated amplification, TMA）技術(shù)是一種終點檢測方法，其S/CO 值與樣品中的核酸濃度沒有相關(guān)性，因此Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法不適宜對TMA 的結(jié)果進行分析。如果日常檢測中經(jīng)常出現(xiàn)“假失控”，實驗室可能會投入更多的精力去調(diào)查失控原因、復檢該批樣品、延遲報告發(fā)出時間，不僅會造成人、財、物和時間上的浪費，時間久了還可能會讓實驗室的員工對質(zhì)量控制工作失去信心。因此本文研究結(jié)果表明，Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法不適合用于目前國內(nèi)血篩核酸檢測的室內(nèi)質(zhì)控。

第三種為在定性監(jiān)測基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列判定指標，綜合分析核酸檢測的室內(nèi)質(zhì)控。本實驗室自2011年起即開始采用該方法對血篩核酸檢測進行室內(nèi)質(zhì)量控制。除了試劑盒自帶質(zhì)控符合系統(tǒng)設(shè)定的要求、第三方弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品的定性結(jié)果與預期相符以外，還對室內(nèi)質(zhì)控品的檢測值建立了在控范圍，同時還對日常檢測指標進行監(jiān)測。這樣的綜合判斷指標來源于核酸擴增的基本原理和本實驗室核酸檢測方法性能驗證數(shù)據(jù)。實驗室日常監(jiān)測核酸混樣陽性拆分反應率、單人份反應率、鑒別陽性率、無效批次率及無效結(jié)果率等數(shù)據(jù)也為檢測結(jié)果的有效性提供必要的支持，也與最近發(fā)布的《血站血液檢測實驗室質(zhì)量監(jiān)測指標》（T/CSBT 004-2019）和《可經(jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)要求》（T/CSBT 008-2019）相符。因此本文以本實驗室核酸檢測所用質(zhì)控限的室內(nèi)質(zhì)量控制方法是可行的。在符合實驗室實際運行狀況下，既避免其他質(zhì)控方法帶來的假失控風險，又能及時發(fā)現(xiàn)檢測中的問題，保證血液篩查質(zhì)量。

為了探討目前澳大利亞核酸室內(nèi)質(zhì)控技術(shù)在我國應用的可行性，本文采用NRL 的QConnect 質(zhì)控品，并使用互聯(lián)網(wǎng)EDCNet 軟件分析其日常質(zhì)控的結(jié)果。在本實驗室羅氏核酸常規(guī)質(zhì)控方法判斷在控的批次中，利用QConnect 質(zhì)控品及NRL 質(zhì)控限的方法進行判斷，在HIV RNA 項目中發(fā)現(xiàn)1 個“失控”結(jié)果。這個“失控”結(jié)果也可能是“假失控”，主要是因為QConnect 用于羅氏檢測方法的質(zhì)控品HIV RNA 濃度只有250 IU/ml，這一濃度在國外均用于單人份檢測，結(jié)果變異范圍較小，而在國內(nèi)開展的混樣檢測中，該濃度相對偏低，結(jié)果變異范圍較大。因此，在研究中所使用QConnect 質(zhì)控品的濃度并不適合用于羅氏核酸混樣檢測。但根據(jù)本實驗室獲得的穩(wěn)定結(jié)果推測，如果提高該質(zhì)控品濃度，可以達到對其進行室內(nèi)質(zhì)控的目的。在蓋立復核酸常規(guī)質(zhì)控方法判斷在控的批次中使用NRL 質(zhì)控限進行判斷，未發(fā)現(xiàn)失控情況。表明當前QConnect質(zhì)控品濃度配合NRL 質(zhì)控限方法，與本實驗室現(xiàn)行質(zhì)控限的方法均適合用于蓋立復核酸單人份檢測的室內(nèi)質(zhì)控。

綜上所述，在選擇適宜濃度的質(zhì)控品情況下本實驗室在用質(zhì)控限的方法與NRL 質(zhì)控限的方法均可用于羅氏核酸混樣檢測和蓋立復核酸單人份檢測的室內(nèi)質(zhì)控。