韓成龍 李蘇陽 韓雅萌

(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230000；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是治療胃腸道癌、乳腺癌、肺癌等多種癌癥最常用的抗腫瘤藥物[1]。臨床上5-FU的劑量通常為10～20 mg/kg，藥效可持續(xù)5～10 d[2]。然而，5-FU可引起一系列副作用，這其中就包括腸道功能損傷。據(jù)報道，大約80%接受化療的癌癥患者會發(fā)生腸黏膜炎[3]。丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的根皮中提取出來的活性成分。丹皮酚具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、抗氧化及保護(hù)心腦血管等廣泛的藥理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可增強(qiáng)化療藥物對肝癌和結(jié)腸癌的抑制作用[5-6]，然而丹皮酚對化療過程中腸黏膜的保護(hù)作用并不清楚。本實驗通過腹腔注射5-FU建立小鼠腸黏膜炎模型，研究丹皮酚對小鼠腸道黏膜損傷的保護(hù)作用及對其抗腫瘤活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SD成年雄性C57BL/6J小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)，室溫(23.00±1.00)℃，晝夜循環(huán)12 h。丹皮酚購自安徽宣城百草植物工貿(mào)有限公司，純度>98%(批號:N0980)。5-FU購自天津金耀氨基酸有限公司(批號:1803091)。本研究通過動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 分組 小鼠隨機(jī)分為對照組(Con組，12只)、5-FU注射組(5-FU組，12只)、丹皮酚25 mg/kg組(5-FU +Pae 25 mg/kg組，13只)、丹皮酚100 mg/kg組(5-FU+Pae 100 mg/kg組，13只)。小鼠均在在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)一周。5-FU以及5-FU+ Pae組小鼠每天腹腔注射 5-FU(50 mg/kg)一次，連續(xù)6 d，Con組注射等體積生理鹽水。Pae組小鼠每天灌胃給予對應(yīng)濃度丹皮酚，每天兩次，連續(xù)6 d，Con組和5-FU組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。7 d后小鼠經(jīng)過量麻醉處死進(jìn)行相應(yīng)組織或生化檢測。

1.3 成瘤實驗 所有小鼠在接受藥物注射前接受皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞株 LS174T 購于中國科學(xué)院生物研究所)。取對數(shù)生長期結(jié)腸癌細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，隨后接種在小鼠腹股溝處。小鼠在第二天接受5-FU注射或丹皮酚治療。實驗接受后過量麻醉處死小鼠，取腫瘤組織稱重。

1.4 HE染色觀察小鼠腸道形態(tài) 小鼠過量乙醚麻醉后快速打開腹腔，暴露出腸道。去小鼠腸道組織后，生理鹽水沖洗并快速固定于4%福爾馬林緩沖液中，24 h后進(jìn)行石蠟包埋處理。用切片機(jī)制作4 μm厚度小腸組織切片，HE染色觀察小腸絨毛形態(tài)學(xué)變化情況。

1.5 免疫組化染色觀察小鼠小腸腺細(xì)胞 小腸組織切片通過二甲苯中脫石蠟后浸泡乙醇水化，隨后100℃煮沸1 h。切片在H2O2處理45 min以分解內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌后，切片以10%山羊血清37℃下封閉1 h。隨后加入一抗(鼠抗anti-TUNEL 1∶500，鼠抗anti-Cleaved caspase-3 1∶500)(Sigma，美國，A0835)37℃孵育2 h后4℃過夜。第二天切片用二抗(1∶200)(Sigma，美國，A2268)37℃孵育1 h，DAB顯色。隨機(jī)選取3個視野，采用Image J軟件統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重的影響 實驗結(jié)果顯示，相比于Con組，在5-FU注射后第3天、第6天和第9天小鼠體重顯著降低(P<0.001)。而相比于僅接受5-FU注射的小鼠，丹皮酚可顯著增加小鼠5-FU注射后體重，在100 mg/kg(P<0.001)濃度下效果最為明顯。見圖1。

圖1 丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重的影響

2.2 丹皮酚對5-FU注射后小鼠腸道形態(tài)學(xué)變化及小腸絨毛高度的影響 HE染色結(jié)果顯示，Con組小鼠腸道無水腫或充血，5-FU注射后小鼠腸道被嚴(yán)重破壞，并伴有明顯的水腫和充血。而丹皮酚分別處理25、100 mg/kg可明顯改善腸道情況，在100 mg/kg時未觀察到明顯的水腫或出血(圖2A)；5-FU注射后小鼠小腸絨毛高度明顯降低(圖2B)，小腸腺數(shù)量明顯下降(圖2C)，而丹皮酚可顯著逆轉(zhuǎn)5-FU注射小鼠小腸絨毛的形態(tài)變化，使小腸絨毛升高并增加小腸腺數(shù)量。

圖2 丹皮酚對5-FU注射后小鼠腸道形態(tài)學(xué)變化影響

2.3 丹皮酚對5-FU注射后小鼠小腸腺細(xì)胞凋亡的影響 實驗結(jié)果顯示，5-FU注射后小鼠小腸腺中TUNEL和Cleaved caspase-3染色程度明顯加重，說明細(xì)胞凋亡程度上升。而丹皮酚在25 mg/kg(P<0.05)和100 mg/kg(P<0.01)處理后可顯著降低 TUNEL和Cleaved caspase-3在小腸腺的表達(dá)，見圖3。因此，丹皮酚可顯著降低5-FU引起的小腸腺細(xì)胞凋亡。

圖3 丹皮酚對5-FU注射后小鼠小腸腺細(xì)胞凋亡的影響

2.4 丹皮酚對5-FU抗腫瘤的影響 與Con、5-FU組相比，5-FU+100 mg/kg丹皮酚組腫瘤顯著縮小，見圖4。這提示5-FU可顯著抑制瘤體生長。

圖4 丹皮酚對5-FU抗腫瘤的影響

3 討論

5-FU是臨床常用的化療藥物，其口服吸收率較低，臨床主要采取靜脈注射。然而5-FU可導(dǎo)致腸道損傷，主要表現(xiàn)為腸屏障功能破壞，小腸腺細(xì)胞凋亡，腸細(xì)胞增殖減少[7]。因此尋找對抗5-FU對腸道功能破壞的藥物至關(guān)重要。丹皮酚是一種具有多種臨床療效的中藥成分，其在加強(qiáng)化療藥物抗腫瘤活性方面的作用受到越來越多的關(guān)注[5,8]。但關(guān)于丹皮酚對5-FU誘導(dǎo)的腸道黏膜損傷的保護(hù)作用尚未有報道，鑒于此，本實驗主要集中在丹皮酚對5-FU誘導(dǎo)腸黏膜損傷的保護(hù)作用。

小腸是哺乳動物消化吸收的主要器官，其功能受損后直接影響能量來源，導(dǎo)致體重下降[9]。因此我們首先研究了丹皮酚對5-FU注射后小鼠體重變化的影響。結(jié)果顯示，在注射5-FU 9天后，小鼠體重顯著降低，而丹皮酚處理后可恢復(fù)小鼠體重，說明丹皮酚對5-FU引起的小腸損傷可能具有一定的保護(hù)作用。既往研究報道顯示小腸管壁結(jié)構(gòu)特點是管壁有環(huán)形皺襞，黏膜有許多絨毛[10]，這些環(huán)狀皺襞和絨毛擴(kuò)大了黏膜的表面積，黏膜下層中有由表層上皮下陷形成的腸腺，開口于黏膜表面，分泌腸液，絨毛和小腸腺與小腸的消化和吸收功能關(guān)系密切[11-12]。由于5-FU對DNA損傷及細(xì)胞毒性作用，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時，也誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡，改變其生物學(xué)特性，并誘導(dǎo)正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子或氧化因子，進(jìn)而損傷包括腸上皮細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞損傷[13-14]。因此我們觀察了丹皮酚對小鼠腸道形態(tài)以及組織學(xué)變化的影響。結(jié)果顯示，丹皮酚可明顯降低小腸水腫程度或出血，并使小腸絨毛升高，增加小腸腺數(shù)量。小腸腺主要由柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞構(gòu)成，起著合成和釋放消化酶的作用[15]。研究表明5-FU引起的腸損傷通常伴有小腸腺細(xì)胞的凋亡[16]。因此隨后我們通過免疫組化實驗研究了丹皮酚對小腸腺細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，丹皮酚可顯著降低小腸腺細(xì)胞凋亡程度。說明丹皮酚對5-FU引起的小腸損傷具有保護(hù)作用。

丹皮酚具有廣泛的藥理特性[17]，其中包括抗腫瘤特性[18]，如抗卵巢癌[19]、乳腺癌[20]、肝癌[21]、膀胱癌[22]等，抗腫瘤機(jī)制主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)抑癌基因表達(dá)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、阻滯細(xì)胞周期等[23]。本研究通過成瘤實驗研究了丹皮酚對5-FU抗腫瘤活性的影響，發(fā)現(xiàn)丹皮酚對結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制作用，并且可增強(qiáng)5-FU抗腫瘤特性。

4 結(jié)論與啟示

本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚可通過抑制小腸腺細(xì)胞凋亡降低5-FU對小鼠黏膜損傷的影響，并可增強(qiáng)其抗腫瘤活性，為對抗5-FU損傷腸道的副作用提供了新的干預(yù)手段，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究加以驗證。