陳虹 潘琦文 李建湘 藍燕 潘彩萍

(河池市人民醫(yī)院，廣西 河池 547000)

卵巢癌是女性最常見和最致命的惡性腫瘤之一[1]，在婦科惡性腫瘤中其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，死亡率最高，通常確診時已為晚期并伴隨轉(zhuǎn)移[2-3]。據(jù)報道，卵巢癌患者的五年總體生存率約為30%[4]。卵巢癌的治療方式主要以手術(shù)為主，輔以化療的手段，而目前尚無卵巢癌的有效療法，其發(fā)生和發(fā)展的分子機制尚未完全闡明。因此，從分子水平闡明影響卵巢癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵機制，將為確定卵巢癌治療的新靶標以及對改善卵巢癌患者預(yù)后至關(guān)重要。

鈣粘蛋白家族是一類細胞間粘附分子，主要分布在各種上皮組織中并介導(dǎo)異型細胞間的粘附[5]。N-cadherin是典型的鈣粘著蛋白之一，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，而在其他正常細胞中則以低水平表達[6]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，N-cadherin在各種人類惡性腫瘤中異常表達，例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等，其在癌細胞中的表達與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-9]。另外，已有研究指出N-cadherin在多種卵巢癌細胞系如COLO316、ES2、SKOV3 和 WME-099 EBV中均異常高表達，通過靶向抑制N-cadherin使其功能喪失能夠改善循環(huán)腫瘤細胞進而阻礙癌細胞的轉(zhuǎn)移過程[10]，推測N-cadherin對于判斷卵巢癌的生物學(xué)行為具有重要的參考價值。然而，目前關(guān)于N-cadherin對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的影響及其與病理機制的關(guān)系尚未完全明確。因此，本研究主要探討沉默N-cadherin 對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響，初步探究其作用機制，以期為卵巢癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 卵巢癌細胞系SKOV3購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，病毒包裝細胞株P(guān)T67購自上海索研生物科技有限公司。3%牛血清白蛋白、0.25%胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素及RPMI1640 培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，Lipofectamine 3000試劑購自美國Invitrogen公司，Trizol試劑、Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本Takara公司，CCK-8試劑盒、Transwell小室及免疫組織/細胞染色試劑購自上海碧云天生物研究所，RIPA 細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及增強型化學(xué)發(fā)光液ECL購自北京索萊寶科技有限公司，Matrigel 膠購自美國 BD 公司，兔抗N-cadherin、E-cadherin、MMP2、MMP9、MEK、ERK及鼠抗β-Actin購自美國 SantaCruz Biotech 公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG或山羊抗鼠 IgG抗體購自美國 Abcam公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生物試劑。pEGFP-MSCVneo 質(zhì)粒和 pMSCVneo/N-cadherin 質(zhì)粒由上海生工生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測N-cadherin在卵巢癌組織中的表達 收集2021年3月～2021年12月在我院進行手術(shù)切除的卵巢癌患者的卵巢癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤組織≥1 cm，病例術(shù)前均有明確的病理診斷，且無化療、放療及免疫治療史)，所有組織均在手術(shù)切取后立即置于10%福爾馬林溶液中固定。固定好后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片成5 μm，經(jīng)脫蠟處理后，采用0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，3% 過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%牛血清白蛋白(BSA)封閉 30 min，加入抗N-cadherin(1∶100)4℃孵育過夜，次日PBS 沖洗，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶1000)室溫孵育30 min，PBS 沖洗，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水與透明后，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡采集圖像并分析。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 卵巢癌細胞系SKOV3復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素與0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，并傳代1次。

1.2.3 RNAi 沉默 N-cadherin 基因的表達 將病毒包裝細胞株P(guān)T67 接種至 6 孔培養(yǎng)板中，待其融合達 90%～95%時，參照Lipofectamine 3000 說明書用脂質(zhì)體法將 pEGFP-MSCVneo 質(zhì)粒和pMSCVneo/N-cadherin 質(zhì)粒分別進行轉(zhuǎn)染，收集病毒上清液。轉(zhuǎn)染分為空白對照組、空載體組、siRNA-N-cadherin組。將對數(shù)生長期的SKOV3細胞以2×105個每孔接種至6孔板，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜孵育，將收集的 pEGFP-MSCVneo 病毒和 pMSCVneo/N-cadherin 病毒的上清分別感染空載體組和siRNA-N-cadherin組的細胞，然后用G418培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)?？瞻讓φ战M不作任何處理，以RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的SKOV3細胞使用0.25%胰蛋白酶進行消化，并按照2×103個/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h時每孔加入10 μL CCK-8試劑，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔吸光度值。

1.2.5 細胞克隆形成實驗檢測各組細胞的克隆形成能力 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的SKOV3細胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打呈單細胞懸浮狀態(tài)，以5×103個接種到培養(yǎng)皿中，輕輕晃動使細胞分散均勻，隨后置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)細胞集落并用PBS 洗滌，加4%多聚甲醛固定菌落，用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，流水沖洗，自然條件下干燥，在光鏡下觀察并計數(shù)細胞集落數(shù)目(將≥50個細胞聚集作為1個細胞集落)。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期分布 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的SKOV3細胞用PBS洗滌，預(yù)冷的75%乙醇重懸細胞，并在-20℃下固定24 h，PBS再次洗滌并重懸細胞，每組取 450 μL細胞懸液，加2 μL RNase后，37℃下孵育 10 min，接著加500 μL 碘化丙啶(PI)，置于37℃下避光孵育30 min，過300目篩網(wǎng)，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力 在Transwell 小室的上室加50 μL 稀釋的Matrigel膠，在37℃培養(yǎng)箱放置 40 min，將轉(zhuǎn)染后的各組SKOV3細胞調(diào)整為 2×105個/mL，Transwell 小室的上室每孔加入 100 μL 細胞懸液，下室加入 600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞貼壁，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，取出小室，棄培養(yǎng)液并輕輕擦去上室的細胞，4% 多聚甲醛固定 10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌后封片，光學(xué)顯微鏡觀察拍照，統(tǒng)計侵襲細胞數(shù)目。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 在6孔培養(yǎng)板背后均勻畫出橫線，位置為每隔0.5 cm一道，每孔中加入轉(zhuǎn)染24 h后的各組SKOV3細胞(每孔5×105個)，第2天用移液槍槍頭沿直尺垂直于細胞培養(yǎng)孔背后的橫線劃痕，PBS清洗細胞3次，洗去劃痕下的細胞，然后加無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24 h觀察劃痕愈合情況并拍照。

1.2.9 實時熒光定量PCR檢測各組細胞N-cadherin、E-cadherin mRNA表達 使用Trizol法提取各組SKOV3細胞總RNA，NanoDrop2000分光光度計測定提取的RNA濃度與純度。根據(jù)Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明進行操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ檢測N-cadherin 、E-cadherin mRNA表達水平，以GAPDH 為內(nèi)參。反應(yīng)程序設(shè)置：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性20 s，60℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 45 s， 40 個循環(huán)。實驗重復(fù) 3 次。qRT-PCR引物均由廣州銳博生物公司合成，具體序列：N-cadherin 上游引物5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAAT-3′，下游引物5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAG-3′；E-cadherin上游引物5′-GCTGGACCGAGAGAGTTTCC-3′，下游引物5′- CTGCATCTTGCCAGGTCCTT-3′； GAPDH上游引物5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt法分析N-cadherin、E-cadherin mRNA的相對表達量。

1.2.10 免疫細胞化學(xué)染色檢測各組細胞中N-cadherin、E-cadherin、MMP2、MMP9蛋白表達 用0.25%的胰蛋白酶消化各組SKOV3細胞，將其制備為單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為4×105/mL，取0.5 mL接種在1 cm×1 cm 蓋玻片上，貼壁后用PBS洗滌3次，在4%多聚甲醛固定20 min，3% 過氧化氫孵育后，加入3%BSA封閉 30 min，然后加入抗N-cadherin(1∶100)、E-cadherin(1∶100)、MMP2(1∶200)和MMP9(1∶200)4℃孵育過夜，次日PBS 沖洗，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶1000)室溫孵育30 min，PBS 沖洗后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡采集圖像并分析。

1.2.11 Western blot檢測各組細胞中MEK、ERK蛋白表達 分別收集各組SKOV3細胞，加入預(yù)冷的RIPA 細胞裂解液充分裂解細胞，4℃條件下12000×g離心10 min取上清液，采用BCA法對蛋白質(zhì)進行定量。分別取20 μg 每組蛋白樣品，采用10%SDS-PAGE 電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入兔抗MEK(1∶2000)、兔抗ERK(1∶3000)及內(nèi)參鼠抗β-Actin(1∶3000)，4℃下孵育過夜，次日TBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG或山羊抗鼠 IgG(1∶5000)，室溫下孵育2 h， TBST洗滌3次，滴加增強型化學(xué)發(fā)光液ECL，在Image Quant LAS 4000 mini下拍照并進行蛋白質(zhì)條帶灰度值的分析。

2 結(jié)果

2.1 N-cadherin 在卵巢癌組織中的表達 N-cadherin 陽性定位于細胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒，其在癌組織中的陽性率較癌旁正常組織中明顯升高(71.85%vs12.46%，P<0.01)，見圖1。

圖1 卵巢癌組織和癌旁正常組織中N-cadherin表達免疫組織化學(xué)染色(100×)

2.2 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞增殖的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，siRNA-N-cadherin組的SKOV3細胞活力分別為(0.32±0.02)、(0.46±0.05)和(0.57±0.05)，與空白對照組(0.53±0.05、0.73±0.13和0.85±0.24)和空載體組(0.51±0.07、0.74±0.11和0.85±0.30)比較顯著下降(均P<0.05)(圖2A)。提示沉默N-cadherin表達可降低SKOV3細胞增殖活力。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，siRNA-N-cadherin組的SKOV3細胞克隆數(shù)目為(60.55±8.29)個，與空白對照組和空載體組[分別為(146.67±14.57)個、(139.27±16.45)個]比較顯著下降(P<0.01)(圖2B)。提示沉默N-cadherin表達可降低SKOV3細胞克隆形成能力。流式細胞術(shù)檢測細胞分布情況，結(jié)果顯示，空白對照組SKOV3細胞處于G1期、S期、G2期的細胞比例分別為(47.68±6.09)%、(35.29±5.76)%與(17.03±3.45)%，空載體組SKOV3細胞處于G1期、S期、G2期的細胞比例分別為(45.11±8.18)%、(38.29±4.01)與(16.60±2.23)%，siRNA-N-cadherin組G1期、S期、G2期的細胞比例分別為(34.01±3.89)%、(50.73±7.64)%與(15.26±2.03)%，siRNA-N-cadherin組較空白對照組和空載體組G1期細胞比例顯著下降而S期顯著增加(均P<0.01)(圖2C)。提示沉默N-cadherin表達能夠使SKOV3細胞發(fā)生S期阻滯。

圖2 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞增殖的影響

2.3 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞侵襲與遷移的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，siRNA-N-cadherin組SKOV3細胞侵襲數(shù)目為(201.56±23.60)個，較空白對照組和空載體組[分別為(522.78±52.58)個、(514.49±48.26)個]顯著下降(均P<0.01)(圖3A)。提示沉默N-cadherin表達可抑制SKOV3細胞的侵襲。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，24 h后siRNA-N-cadherin組SKOV3細胞遷移數(shù)目為(320.77±28.79)個，較空白對照組和空載體組[分別為(605.81±57.71)個、(611.50±59.43)個]顯著下降(均P<0.01)(圖3B)。提示沉默N-cadherin表達可抑制SKOV3細胞的遷移。

圖3 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞侵襲與遷移的影響

2.4 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA-N-cadherin組N-cadherin mRNA與E-cadherin mRNA的相對表達量較空白對照組和空載體組N-cadherin mRNA相對表達量顯著下降而E-cadherin mRNA相對表達量顯著升高(均P<0.05)，見表1。免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，空白對照組和空載體組細胞中可見到N-cadherin、MMP-2和MMP-9 蛋白陽性染色較強，陽性信號定位于細胞質(zhì)，而siRNA-N-cadherin組中N-cadherin 、MMP2和MMP9蛋白的陽性染色較弱，與空白對照組和空載體組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而siRNA-N-cadherin組中E-cadherin蛋白的陽性染色較空白對照組和空載體組顯著增強(均P<0.05)，見圖4。提示沉默N-cadherin表達可抑制SKOV3細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 免疫細胞化學(xué)染色檢測各組SKOV3細胞中N-cadherin、E-cadherin、MMP2和MMP9蛋白表達(100×)

表1 各組N-cadherin、E-cadherin mRNA相對表達量

2.5 沉默N-cadherin對卵巢癌細胞MEK、ERK蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，siRNA-N-cadherin組MEK、ERK的蛋白表達量較空白對照組和空載體組顯著下降(均P<0.05)，見圖5、表2。

圖5 Western blot檢測各組SKOV3細胞中MEK與ERK的蛋白表達

表2 各組MEK、ERK的蛋白表達量

3 討論

卵巢癌是全世界最常見的婦科惡性腫瘤，由于早期缺乏明顯的臨床癥狀和特定的腫瘤標志物，大多數(shù)患者被診斷時已處于晚期[3,11]。目前，腫瘤標志物CA125的水平用于臨床監(jiān)測卵巢癌患者的預(yù)后，但其敏感性和特異性并不理想[12-13]。因此，探究卵巢癌的發(fā)生原因并確定精準的標志物以進行早期診斷，對于患者的預(yù)后評估和靶向治療至關(guān)重要。

卵巢癌的增殖與轉(zhuǎn)移過程涉及到多個過程包括癌基因的激活和抑癌基因的失活[14-15]。腫瘤的基因治療較常規(guī)藥物治療具有特異性，目前，靶向基因治療在卵巢癌的診治中也備受矚目。越來越多的證據(jù)表明，N-cadherin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的間充質(zhì)標志物，其在許多腫瘤中呈陽性表達，其表達升高與腫瘤的侵襲與遷移密切相關(guān)[16-18]。Abufaraj等[19]評估了N-cadherin作為433例根治性膀胱切除術(shù)和雙側(cè)淋巴結(jié)清掃術(shù)的浸潤性膀胱癌患者的預(yù)后生物標志物的作用，研究發(fā)現(xiàn)，浸潤性膀胱癌患者中N-cadherin的陽性表達率約為40%。Kamikihara等[20]通過免疫組織化學(xué)抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法評估了146例術(shù)后胃癌患者腫瘤組織中N-cadherin的表達，發(fā)現(xiàn)N-cadherin的陽性表達與腫瘤的臨床分期和惡性程度密切相關(guān)，實體瘤中N-cadherin表達明顯上調(diào)。而關(guān)于N-cadherin在卵巢癌中的研究也已有報道，Po等[10]經(jīng)檢測卵巢癌細胞系中N-cadherin表達發(fā)現(xiàn)，其在多種癌細胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達，并影響循環(huán)腫瘤細胞捕獲；于舒鴻等[21]研究指出在進展期卵巢癌、高級別漿液性癌及高級別卵巢癌中N-cadherin高表達，這與患者FIGO分期、組織學(xué)類型、腫瘤分級均顯著相關(guān)。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)N-cadherin在卵巢癌組織中陽性表達明顯升高。

為了進一步研究N-cadherin在卵巢癌中的作用，我們通過RNAi 沉默卵巢癌SKOV3細胞中 N-cadherin 表達，觀察卵巢癌細胞生物學(xué)行為變化。qRT-PCR檢測和免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果均表明該干擾質(zhì)粒能夠有效抑制N-cadherin表達。在SKOV3細胞中沉默N-cadherin 表達后，細胞增殖活力明顯下降，細胞集落形成數(shù)目減少，并使細胞發(fā)生S期阻滯，抑制細胞的遷移和侵襲能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認為是腫瘤細胞從非活動性上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)檫w移性間充質(zhì)表型的過程，其共同特征是E-cadherin表達的喪失，同時伴有N-cadherin表達的上調(diào)[22]。MMP2和MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員，可通過降解細胞外基質(zhì)，血管基底膜和N-cadherin-catenin復(fù)合物來促進腫瘤細胞的侵襲、粘附以及轉(zhuǎn)移。有研究表明，N-cadherin通過增加一些MMPs的表達來促進腫瘤轉(zhuǎn)移[23-24]。本研究聯(lián)合運用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法比較了 3 組細胞中 E-cadherin的表達情況，結(jié)果顯示，沉默N-cadherin表達后E-cadherin的表達增加，MMP2和MMP9蛋白表達明顯下降，說明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受到抑制。

絲裂原激活蛋白激酶(MEK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路是多種細胞因子調(diào)控細胞生物學(xué)行為的主要途徑，ERK被上游分子 MEK 的磷酸化激活后，可將信號從細胞膜傳遞至細胞核中，從而調(diào)節(jié)細胞的生命周期[25]。目前，研究表明MEK/ERK信號通路異常與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及惡化密切相關(guān)，該信號級聯(lián)對腫瘤細胞間和腫瘤細胞內(nèi)通訊至關(guān)重要，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞功能，如生長、存活和分化等，因此，該途徑可作為干預(yù)和治療包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的潛在靶點[26]。本研究檢測結(jié)果顯示，在沉默N-cadherin表達的卵巢癌細胞中MEK與ERK的蛋白表達水平均明顯下降，推測沉默N-cadherin可能抑制了MEK/ERK信號通路異常激活從而發(fā)揮了抑制卵巢癌生長與轉(zhuǎn)移的作用。本研究進一步明確了N-cadherin在卵巢癌細胞惡性生物學(xué)行為的作用，為靶向N-cadherin治療卵巢癌提供了新的科學(xué)資料。但本研究僅通過體外細胞實驗研究了相關(guān)作用，而關(guān)于在體內(nèi)沉默N-cadherin是否同樣發(fā)揮積極作用及具體機制有待后續(xù)進行實驗探究。

4 結(jié)論

本研究表明N-cadherin在卵巢癌組織中高表達，沉默卵巢癌細胞中N-cadherin表達可抑制細胞增殖、侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機制可能與抑制MEK/ERK信號通路的異常激活有關(guān)。