楊雪佳，馬義麗，李玉杰，吳登強，周素芳

（1.國家生物靶向診治國際聯(lián)合研究中心，廣西生物靶向診治重點實驗室，廣西腫瘤靶向診治協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西生物靶向診治研究人才小高地，廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021）

關鍵字：肝細胞癌；數(shù)據(jù)挖掘；TTK

0 引言

肝癌是癌癥相關第四大死亡原因，也是最難治療的癌癥之一，每年導致近百萬人死亡。HCC占原發(fā)性肝癌的 80%-90%[1]，死亡率位居全球第三[2]。2022年在中國診斷出的前五種癌癥類型中肝癌排第四，癌癥死亡的前五位原因肝癌排第二[3]。肝癌具有發(fā)病隱匿、預后很差、惡性程度高等生物學特征[4]。因此進一步加深對HCC發(fā)病機制的研究十分重要。深入探討肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找新的治療靶點和預后的生物標志物對肝細胞癌的研究有著重要意義。紡錘體組裝檢查點激酶 TTK ( Mps1 ) 基因（NM_003318）位于染色體6q13-q21上，編碼雙絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶[5]。TTK是紡錘體組裝檢查點的核心組成部分，其作用是確保染色體正確分布到子細胞[6]。除了睪丸和胎盤，通過Northern 印跡在正常組織中幾乎無法檢測到TTK。然而，TTK的高表達水平可以在不同類型的癌癥中檢測到，包括膠質(zhì)母細胞瘤、食道癌和乳腺癌。TTK在肝癌中表達明顯增高。此外，TTK在肝癌具有促進細胞增殖和遷移的作用[7]。這些結果提示TTK可能作為診斷肝癌的潛在預測指標。

1 資料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載關于肝細胞癌的TCGA-LIHC轉錄組測序數(shù)據(jù)（FPKM格式）和樣本臨床信息，包含374個HCC和50個正常組織。將FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉換成了TPM格式并進行l(wèi)og2轉化后用于基因表達分析。基因表達分析采用wilcoxon秩和檢驗，臨床特征分析Kruskal-Wallis 檢驗，癌和癌旁配對樣本差異分析采用配對樣本T檢驗。生存分析Kaplan-Meier生存分析與log-rank檢驗，采用Survival R包完成，ROC分析采用PROC R包。使用ggplot R包進行可視化。

1.2 臨床樣本

從廣西醫(yī)科大學獲得10對匹配的HCC組織和鄰近癌旁組織。以上樣本采集時間為2020年1月至2021年8月。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準(批準文號:20200035)。所有人體組織標本的處理都嚴格遵守《赫爾辛基宣言》中的道德準則。所有患者均提供知情同意。上述臨床標本的RNA純化、鑒定及RNA序列均由中國Novelbio公司完成。采用R包“Limma”中的Wilcoxon檢驗驗證TTK的表達。癌和癌旁配對樣本差異分析采用配對樣本T檢驗。

2 結果

2.1 TTK在TCGA肝細胞癌組織和正常組織中表達情況

由圖1A可知，TTK在TCGA 數(shù)據(jù)庫HCC組織表達顯著高于正常組織（P＜0.001）。圖1B在50對配對樣本組中，除了一組癌組織TTK表達低于正常組織外，大部分組均高于正常組織（P＜0.001）。說明轉錄水平上TTK在HCC組織中高表達。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK轉錄水平表達情況

2.2 TTK表達與臨床病理特征關系

由圖2A-2B可知，TTK表達在HCC病理分期StageⅠ-Ⅲ和組織分級G1-G4中其表達逐漸升高，StageⅡ和StageⅢ與StageⅠ相比，TTK表達量顯著升高（P＜0.05）。然而StageⅣ與各分期無顯著差異，考慮StageⅣ僅有5個樣本，樣本數(shù)過少不具有代表性。G3和G4與G1相比，TTK表達量顯著升高（P＜0.05）。反映HCC疾病惡化程度越嚴重，TTK表達越高。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK表達與臨床病理特征關系

2.3 TTK表達與患者生存狀態(tài)關系

由圖3A-B可知，HCC患者在總體生存和無進展生存方面，TTK高表達組比低表達組隨著隨訪時間延長，病人生存率逐漸下降。說明TTK高表達與HCC的不良預后有關（P＜0.05）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中TTK表達與患者生存狀態(tài)關系

2.4 ROC分析TTK診斷效能

由圖4A可知，在預測正常和HCC結局上，TTK的預測能力有較高準確性（AUC=0.971，CI=0.955-0.987）；圖4B可知，在預測病理早期（StageⅠ-Ⅱ）和晚期（StageⅢ-Ⅳ）病理狀態(tài)上，TTK的預測能力有較低準確性（AUC=O.601,CI=0.530-0.672）; 圖4C可知，在預測組織分級早期（G1-G2）和晚期（G3-G4）方面，TTK預測效能有一定準確性（AUC=0.680,CI=0.625-0.735）?？赏茢啵琓TK用作為診斷HCC良好指標。

圖4 ROC分析TTK診斷效能

2.5 臨床樣本驗證TTK在HCC中表達

通過收集來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院的十對HCC和配對癌旁樣本，進行轉錄組測序挖掘TTK基因在癌和正常組織差異表達。有圖5A可知，TTK在HCC組織中高表達（P＜0.05）。圖5B可知，在十組配對樣本中，癌組織TTK表達量均高于正常組織（P＜0.05）。

圖5 臨床樣本驗證TTK轉錄水平表達情況

3 結論

肝細胞癌（HCC）是癌癥相關死亡的第四大原因，并且在全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷上升[8]。HCC的發(fā)病率、頻繁復發(fā)、高死亡率和目前治療方案的局限性，使HCC被公認為主要的公共衛(wèi)生問題。HCC是一種生物學復雜且高度異質(zhì)的疾病[9]。常規(guī)的臨床和病理學指標可用于判斷肝細胞癌分期和預后，但準確性有限。肝細胞癌變的分子機制仍不清楚[10]。TTK該基因編碼一種參與細胞有絲分裂和增殖的雙特異性蛋白激酶。目前有研究報道，TTK高表達與多種腫瘤預后不良相關，包括三陰性乳腺癌[11]、胃癌[12]、前列腺癌[13]和膀胱癌[14]，但其在肝細胞癌中的表達情況和預后相關性報道較少見。Miao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TTK在肝臟腫瘤組織中表達水平較肝臟組織高,間接表明TTK可作為肝細胞癌的一個潛在癌基因。因此進一步探討TTK在肝細胞癌中的表達情況和臨床特征相關性十分必要。TCGA數(shù)據(jù)庫是目前被廣泛使用的腫瘤學數(shù)據(jù)庫，并得到了廣泛科研工作者的認同。本實驗通過對TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)深入挖掘，發(fā)現(xiàn)TTK基因在肝細胞癌組織中的表達水平高于正常組織，臨床樣本驗證也證實TTK在HCC的高表達。TTK的高表達與患者HCC病程進展密切相關：TTK在病理晚期和組織分化差樣本中，表達量更高。生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達TTK與HCC患者不良預后相關。接著用ROC分析探索了TTK診斷HCC結局、預測病理和組織方面其檢驗準確性。發(fā)現(xiàn)TTK在預測患者HCC或正常疾病狀態(tài)方面，AUC=0.971，表明TTK評價患者HCC檢驗效能良好。本研究將數(shù)據(jù)挖掘和臨床驗證結合起來，證明了TTK在HCC組織中的高表達，與疾病惡化和預后密切相關，且可作為潛在HCC預后和診斷靶標，但未能對TTK影響HCC進展的機制進行基礎研究。本研究將為尋找肝細胞癌診斷和預測預后的靶標提供一定的理論依據(jù)和臨床指導。