范 蓓 張靜靜 邢體坤 劉 偉 王 斌 宋路萍 安文琪

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)部，河南新鄉(xiāng) 453000；2.河南晟明生物技術(shù)研究院有限公司重組細(xì)胞室，河南新鄉(xiāng)453500；3.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453500；4.華蘭基因工程有限公司研發(fā)部，河南新鄉(xiāng) 453500

白細(xì)胞分化抗原47（cluster of differentiation，CD47）是一種膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中普遍表達(dá)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)大量表達(dá)CD47，與巨噬細(xì)胞表面的抑制性免疫受體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α, SIRPα）結(jié)合，抑制其吞噬作用，從而產(chǎn)生免疫逃逸，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出至關(guān)重要的作用。Hu5F9 是一種抗CD47 抗體，通過(guò)與CD47 結(jié)合，有效增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的吞噬作用，同時(shí)研究人員通過(guò)將互補(bǔ)決定區(qū)移植到人IgG4 支架上使其獲得人源化改造，對(duì)人CD47 有較好的親和力，并在體內(nèi)多種腫瘤模型中表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有類似人源細(xì)胞的翻譯后修飾，例如蛋白的糖基化等，因此相較于細(xì)菌、酵母、植物和昆蟲(chóng)等宿主細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞更適合表達(dá)重組蛋白藥物。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是最常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，能夠在無(wú)血清、無(wú)蛋白的條件下進(jìn)行高密度懸浮培養(yǎng)，可以避免血清的復(fù)雜組分的影響，提升了生產(chǎn)的安全性、 穩(wěn)定性及法規(guī)方面的便利性，更加適合大批量工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。同時(shí)CHO 內(nèi)源性蛋白分泌較少，也更利于分離純化目的蛋白。目前，針對(duì)SIRPα-CD47 信號(hào)通路，已有多款藥物正在研究開(kāi)發(fā)中，其中以Hu5F9 進(jìn)度最快，研究最為全面，國(guó)內(nèi)也有多家企業(yè)布局CD47 項(xiàng)目。本研究選用CHO-S系統(tǒng)來(lái)表達(dá)Hu5F9 重組蛋白，旨在為CD47 抗體藥物的研究開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L 為生工 生物工程（上海）股份有限公司合成；pCGS3 空載質(zhì)粒為華蘭生物構(gòu)建保存；CHO-S 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 主要試劑

DH5α 大腸感受態(tài)（B528413）、瓊脂粉（A505255）、Protein A 蛋白純化試劑盒（C600048-0001）購(gòu)自生工生物工程公司；細(xì)胞所用培養(yǎng)基（A29100-01、12309-019-1L）、轉(zhuǎn)染試劑盒（A29129-1L、1962735）等購(gòu)自Gibco 公司；蛋白胨（LP0044T）購(gòu)自O(shè)XOID 公司；酵母粉（212750）購(gòu)自BD公司；內(nèi)切酶Hind Ⅲ（R0104V）、Pac I（R0547S）、BstB Ⅰ（R0519S）和Xho Ⅰ（R1064V）購(gòu)自NEB 公司；高保真預(yù)混酶GXL Premix（R051S）、DNA 連接試劑盒（6022Q）購(gòu)自Takara 公司；蛋白預(yù)制膠（M00653）、染色試劑盒（L00687R）、電泳液（M00138）、上樣緩沖液（M00676、MB01015）購(gòu)自金斯瑞公司；蛋白marker（26616）、Western blot 檢測(cè)試劑（34577）購(gòu)自賽默飛公司；Anti-Human IgG Fc specific（A0170-1ML）購(gòu)自SIGMA 公司。

1.3 儀器設(shè)備

搖床（HYG-A）購(gòu)自太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；臺(tái)式離心機(jī)（1-15PK）購(gòu)自德國(guó)賽多利斯；潔凈工作臺(tái)（SWCJ-2FD）購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀（S1000）購(gòu)自BIO-RAD 公司；紫外儀（WD-9403C）、電泳儀（DYY-10C）、電泳槽（DYCP-31DN）購(gòu)自北京六一生物科技有限公司； 蛋白染色儀（eStain L1）、快速濕轉(zhuǎn)儀（eBlot 1）購(gòu)自金斯瑞公司；凝膠成像系統(tǒng)（AlphaImager HP）、全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)購(gòu)自ProteinSimple 公司；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop ONE）Thermo Fisher 公司；垂直電泳槽（X Cell sure）購(gòu)自Invitrogen 公司；金屬?。═hermo mixer）、離心機(jī)（5804R）購(gòu)自Eppendorf 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar Altair）購(gòu)自上海睿鈺公司；CO疊加式恒溫振蕩器（IS-RDS6C）購(gòu)自CRYSTAL 公司。

1.4 基因合成

根據(jù)世衛(wèi)組織公布的Hu5F9 重鏈和輕鏈的氨基酸序列（CAS：2169232-81-7），設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)、Kozak序列（GCCACC）和信號(hào)肽（MGWSCIILFLVATATGVHS），交由生工生物公司針對(duì)CHO 細(xì)胞進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成堿基序列（pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L）。

1.5 載體構(gòu)建

表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)室保存的pCGS3 質(zhì)粒，合成質(zhì)粒與載體質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶處理后回收目的基因及載體片段，將目的基因依次連接至pCGS3 載體質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑選陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，并送生工生物公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)

轉(zhuǎn)染前1 天，對(duì)傳代擴(kuò)增CHO-S 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，待細(xì)胞達(dá)到合適的密度時(shí)進(jìn)行分種稀釋并培養(yǎng)過(guò)夜。次日使用新鮮的表達(dá)培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃后將細(xì)胞進(jìn)一步稀釋，使用預(yù)冷試劑配制ExpiFectamineTM CHO/質(zhì)粒DNA 復(fù)合物，室溫孵育復(fù)合物1～5 min，緩慢加入到細(xì)胞懸液中，混勻后培養(yǎng)18～22 h 后，加入增強(qiáng)劑和輔料，繼續(xù)培養(yǎng)5 d 后，第2 次添加輔料至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后8～10 d，在細(xì)胞活率≥75%時(shí)，收集細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 蛋白電泳及純化

取適量樣品加入上樣緩沖液（還原/非還原），充分混勻后95℃孵育10 min，取預(yù)制膠上樣進(jìn)行電泳，結(jié)束后用蛋白染色儀快速染色脫色，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

將需純化的蛋白樣品加入超濾管中，重復(fù)離心收集蛋白濃縮液，將蛋白濃縮液與Binding/Wash buffer等比例混勻，用針頭濾器過(guò)濾。將混勻的蛋白濃縮液加入純化柱，收集流穿液，用Binding/Wash buffer 清洗柱子同樣收集流穿液，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)量流穿液中蛋白濃度，待流穿液吸光度接近基線時(shí)，用Elution buffer 洗脫蛋白并收集，取樣測(cè)定濃度并進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.8 Western blot 鑒定

取適量樣品加入上樣緩沖液（還原/非還原），充分混勻后95℃孵育10 min，取預(yù)制膠上樣進(jìn)行電泳，結(jié)束后用蛋白染色儀快速染色脫色。取PVDF 膜放入甲醇中浸泡1 min，倒掉甲醇加入平衡液浸泡2 min，打開(kāi)轉(zhuǎn)膜夾，按照海綿墊-膜-凝膠-海綿墊的順序放好，合上轉(zhuǎn)膜夾，插入轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜浸泡在5%脫脂奶粉中，4℃浸泡過(guò)夜，棄掉脫脂奶粉，加入洗滌液重復(fù)洗滌3 次，將膜浸泡在抗人源Fc 抗體稀釋液中，搖床上緩慢搖晃孵育1 h，加入洗滌液，重復(fù)洗滌3 次，將配置好的顯色液（A 液∶B 液=1∶1）加至膜上，避光反應(yīng)5 min，晾至半干，使用全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)拍照保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 獲取目的基因及載體

目的基因Hu5F9-H 長(zhǎng)度為1392 bp，共編碼463個(gè)氨基酸，分子量為50.9 kD，Hu5F9-L 基因長(zhǎng)度為717 bp，共編碼238 個(gè)氨基酸，分子量為25.9 kD。

合成質(zhì)粒pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L雙酶切后回收的目的條帶大小與預(yù)期符合（圖1）。

圖1 目的基因回收結(jié)果

2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

將酶切得到的目的片段回收后，先將Hu5F9-H連接至pCGS3 載體，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及基因測(cè)序，驗(yàn)證結(jié)果正確后，再連接Hu5F9-L，同樣進(jìn)行酶切驗(yàn)證及基因測(cè)序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功見(jiàn)圖2、圖3（封三）。

圖2 雙酶切驗(yàn)證

圖3 測(cè)序峰圖

2.3 目的基因的真核表達(dá)

將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-S 細(xì)胞中表達(dá)，培養(yǎng)數(shù)天后，取細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)（圖4）。檢測(cè)結(jié)果顯示非還原條件下在180 kD附近出現(xiàn)特異性條帶，下方有一條雜帶，推測(cè)為輕鏈部分?jǐn)嗔?。還原條件下在50 kD 和30 kD 處出現(xiàn)兩條特異性條帶，與Hu5F9 抗體的重鏈和輕鏈大小相符。

圖4 SDS-PAGE 檢測(cè)目的蛋白

2.4 純化目的蛋白

利用Fc 標(biāo)簽純化目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，非還原條件下在180 kD 出現(xiàn)特異性條帶，為Hu5F9 全抗分子，其下方存在多條特異性條帶，分析抗體分子可能存在輕鏈不同程度的斷裂。還原條件下在50 kD 和30 kD 出現(xiàn)兩條特異性條帶，分別對(duì)應(yīng)抗體的重鏈和輕鏈，條帶大小符合預(yù)期（圖5）。

圖5 蛋白純化結(jié)果

2.5 重組蛋白Western blot 鑒定

利用重鏈上的人源Fc 標(biāo)簽進(jìn)行Western blot 鑒定，發(fā)現(xiàn)非還原條件下，重、輕鏈聚合，全抗分子理論大小為153.6 kD，鑒定結(jié)果顯示在80～180 kD 處有多條特異性條帶，表明可能出現(xiàn)輕鏈不同程度的斷裂。還原條件下，重、輕鏈解聚，重鏈單獨(dú)與Fc 抗體結(jié)合，在55 kD 附近有單一條帶，與重鏈大小相符（圖6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hu5F9 重組蛋白在CHO-S 細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖6 Western blot 鑒定結(jié)果

3 討論

巨噬細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的吞噬作用受激活信號(hào)（FcγR、CRT、LRP-1）和抑制信號(hào)（SIRPα-CD47）的平衡調(diào)節(jié)，但癌細(xì)胞通過(guò)上調(diào)CD47 的表達(dá)，使大量的CD47 與免疫細(xì)胞表面的SIRPα 受體結(jié)合，通過(guò)傳遞出一種“不要吃我”的信號(hào)來(lái)逃避免疫系統(tǒng)。抗CD47抗體能阻斷CD47-SIRPα 信號(hào)通路，激活巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，同時(shí)能夠增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的呈遞作用，激活免疫T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，這種機(jī)制為靶向CD47 的腫瘤免疫治療藥物開(kāi)發(fā)提供了充分的理論基礎(chǔ)。

此前研究報(bào)告了一種新的抗CD47 抗體分子Hu5F9-G4，能夠在體外有效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)原代人類急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞吞噬作用，并在體內(nèi)完全根除人AML 細(xì)胞，展現(xiàn)出極佳的抗癌治療潛力。有研究報(bào)道，Hu5F9-G4 與利妥昔單抗聯(lián)用，在治療彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤的臨床試驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。曲妥珠單抗是一種靶向抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）單克隆抗體，用于治療HER2 陽(yáng)性乳腺癌，能夠顯著提高早期HER2 陽(yáng)性乳腺癌患者生存率，但晚期患者容易產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致復(fù)發(fā)，而近期研究結(jié)果表明，Hu5F9-G4 與曲妥珠單抗聯(lián)用能克服耐藥性的限制，增強(qiáng)HER2 陽(yáng)性乳腺癌的抗腫瘤療效。

SIRPα-CD47 靶向藥物正在成為癌癥免疫治療方向的熱點(diǎn)，除了Hu5F9 外，還有多個(gè)抗體分子正在開(kāi)發(fā)中，例如抗SIRPα 抗體TTI-621、CD47 拮抗劑ALX-148以及另一個(gè)抗CD47 抗體B6H12等，其中最具臨床價(jià)值的還是Hu5F9，已有多個(gè)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。但是不斷有研究表明，因CD47 在紅細(xì)胞上的表達(dá)，使得Hu5F9 對(duì)紅細(xì)胞具有一定的毒害作用，可能會(huì)導(dǎo)致一系列血液系統(tǒng)方面的不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用面臨一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)無(wú)疑限制了Hu5F9 的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，目前臨床試驗(yàn)大都通過(guò)與其他靶點(diǎn)藥物聯(lián)用，改進(jìn)給藥方式或者開(kāi)發(fā)雙特異性抗體等方法來(lái)避免大劑量直接給藥，以減輕其不良反應(yīng)。因此，如何平衡CD47 靶向藥物的有效性和安全性仍需要進(jìn)一步的研究。

盡管Hu5F9 仍存在一些問(wèn)題，但其在抗CD47 抗體藥物研發(fā)中仍極具參考價(jià)值，目前未見(jiàn)有Hu5F9真核表達(dá)方法等相關(guān)報(bào)告，本研究根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的Hu5F9 氨基酸序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體，利用CHO-S 表達(dá)系統(tǒng)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件下成功地獲得了抗CD47 抗體Hu5F9 的重組蛋白，為后續(xù)CD47 藥物的開(kāi)發(fā)研究工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。