王燕燕，徐建峰，高 博，董 和，石福岳，容維中*，張艷麗，李振明

(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心，甘肅 平?jīng)?744000；3.寧縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 寧縣 745200)

早勝牛，又稱“早勝東牛”，主要生活在地處隴東黃土高原的慶陽(yáng)市早勝塬上，是經(jīng)當(dāng)?shù)厝罕婇L(zhǎng)期選育而成的地方品種，也是甘肅省僅有的大型黃牛品種，屬于我國(guó)五大黃牛品種之一。早勝牛體格大，體力強(qiáng)，役用肉用性能好，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要役畜，深受當(dāng)?shù)厝罕娤矏?ài)。近年來(lái)，隨著人們生活水平的逐漸提高，對(duì)牛肉的需求與日俱增，2019年我國(guó)牛肉消費(fèi)量約為833×10t，人均牛肉消費(fèi)量達(dá)5.95 kg，因此如何提高早勝牛的肉用性能是當(dāng)前人們最關(guān)注的問(wèn)題。

脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)是一糖基化程度較高的單鏈糖蛋白，也是一種多配體B類清道夫受體，主要介導(dǎo)細(xì)胞長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFAS)的攝取。36具有多種功能，其主要功能是參與脂類代謝，主要與代謝綜合征、糖尿病、阿爾茲海默癥等多種脂類代謝疾病相關(guān)，與動(dòng)物的脂肪沉積也有關(guān)系。束剛等指出，性別和部位的不同會(huì)影響36對(duì)雞脂肪的調(diào)控。張松研究指出，36基因與秦川牛肌內(nèi)脂肪沉積(IMF)等肉用性狀顯著相關(guān)。本研究以早勝牛為對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)36基因在不同組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，分析肌肉組織與肌內(nèi)脂肪沉積(IMF)的關(guān)系；并利用PCR-SSCP法對(duì)早勝牛36基因第9外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，分析其與肉用性狀的相關(guān)性，為早勝牛的肉質(zhì)選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

于寧縣某牧業(yè)有限責(zé)任公司和寧縣某早勝肉牛調(diào)運(yùn)中心選取300頭健康的12月齡早勝牛，靜脈采血7 mL，加抗凝劑搖勻后-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)多態(tài)性分析結(jié)果，選擇與基因型對(duì)應(yīng)的1.5歲早勝牛進(jìn)行屠宰，每種基因型屠宰3頭，測(cè)定其宰前活重、胴體重、眼肌面積、背膘厚度、肌內(nèi)脂肪含量等肉用性能指標(biāo)，并采集腿肌、背最長(zhǎng)肌、心臟、肝臟四個(gè)部位的組織樣品，將組織表面用DEPC水配制的生理鹽水沖洗并剪成小塊放入無(wú)RNA酶的2 mL凍存管，迅速投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取、總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

基因組DNA用D3392-01型全血DNA提取試劑盒提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。

按照試劑盒操作說(shuō)明，提取早勝牛上述不同組織總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA質(zhì)量，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛的36基因(GenBank ID：NC_037331、NM_174010.3)和基因(登錄號(hào)：NM_001034034)，采用Primer 5.0及Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司和大連TaKaRa公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 PCR擴(kuò)增

以基因組DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：總體積25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 pmol/μL)、DNA模版1 μL(100 ng/μL)，ddHO 9.5 μL；PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

表2 PCR反應(yīng)程序Table 2 The protocol of PCR reaction

1.5 PCR產(chǎn)物SSCP分型及測(cè)序

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 μL與上樣緩沖液6.0 μL(V(6×buffer)：V(98%甲酰胺)=1:3)混合，98 ℃變性10 min，迅速置于冰上冷卻10 min，然后于4 ℃下在100 g/L的聚丙烯酰胺凝膠(V(丙烯酰胺)∶V(亞甲雙丙烯酰胺)=29:1)上160 V 電泳15 h，參照徐建峰等的銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，根據(jù)銀染后條帶的位置和數(shù)量判定基因型，將不同基因型產(chǎn)物送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序。

1.6 qPCR檢測(cè)

RNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增體系(20 μL)：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer1 (10 μM) 0.4 μL，Primer2 (10 μM)0.4 μL，Template cDNA 1 ul，ddHO加至20 μL。

qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃反應(yīng)10 s，51 ℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃反應(yīng)60 s，60 ℃反應(yīng)60 s，95 ℃反應(yīng)15 s。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

用DNAStar 8.0軟件對(duì)DNA測(cè)序獲得的序列進(jìn)行分析，使用PopGene 32軟件計(jì)算基因型頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)，采用SPSS 19.0軟件分析不同SNPs位點(diǎn)基因型與肉用性能的相關(guān)性。

qPCR得到的目的基因36和的Ct值，采用2法計(jì)算檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量,使用SPSS 19.0軟件，采用單因素方差分析和相關(guān)分析，統(tǒng)計(jì)分析mRNA表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 DNA與RNA質(zhì)量檢測(cè)

經(jīng)分析，DNA的OD/OD在1.8～2.0之間，且純度較好。用核酸蛋白測(cè)定儀結(jié)果顯示，RNA的OD/OD在1.8～2.0之間，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量較好。

2.2 早勝牛CD36基因PCR擴(kuò)增

以血液基因組DNA為模板，對(duì)36基因第9外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析。結(jié)果顯示(圖1)，存在2種基因型，分別命名為T(mén)T、TC。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)36第9外顯子在83125 bp處發(fā)生T/C突變(圖2)。

圖1 CD36基因PCR-SSCP分析圖Fig.1 PCR-SSCP detection of CD36

圖2 CD36基因9外顯子PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing peak of exon 9 in CD36 gene

2.3 CD36基因遺傳特性分析

本研究表明，T83125C位點(diǎn)，優(yōu)勢(shì)等位基因和優(yōu)勢(shì)基因型分別為T(mén)(0.96)和TT(0.92)。由表3可知，36基因T83125C位點(diǎn)的純合度大于0.9，且高于雜合度。PIC<0.25，屬低度多態(tài)。經(jīng)哈迪-溫伯格平衡(χ)檢驗(yàn)，并對(duì)照卡方臨界值，該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(>0.05)。

表3 CD36基因第9外顯子突變區(qū)域遺傳學(xué)參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of the mutational region in CD36 gene

2.4 早勝牛CD36基因第9外顯子多態(tài)性與肉用性能關(guān)聯(lián)分析

將36基因第9外顯子多態(tài)性與早勝牛的肉用性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，由表4可知，T83125C位點(diǎn)，TC型的宰前活重、胴體重、肌內(nèi)脂肪都顯著高于TT型(<0.05)，而兩種基因型的屠宰率、背膘厚度、眼肌面積無(wú)顯著差異(>0.05)。

表4 早勝牛CD36基因第9外顯子不同基因型與肉用性能的關(guān)聯(lián)性分析Table 4 Correlation analysis between different genotypes of CD36 gene exon 9 and meat quality for Zaosheng cattle

2.5 CD36基因不同組織mRNA表達(dá)分析

由圖3可知，36基因在早勝牛的4個(gè)組織中均有表達(dá)，以肝臟為對(duì)照，表達(dá)水平由高到低依次為心臟、腿肌和背最長(zhǎng)肌和肝臟，心臟、腿肌和背最長(zhǎng)肌中的mRNA表達(dá)量間無(wú)顯著性差異(>0.05)，但心臟的mRNA表達(dá)量顯著高于肝臟(<0.05)。

圖3 CD36基因在早勝牛不同組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative mRNA expression of CD36 gene in different tissues of Zaosheng cattle

2.6 CD36基因在肌肉組織中的mRNA表達(dá)量與IMF含量相關(guān)分析

由表5可知，早勝牛背最長(zhǎng)肌中的36基因mRNA 表達(dá)量與IMF含量呈顯著相關(guān)(<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.855；腿肌中36基因mRNA 表達(dá)量與IMF含量無(wú)顯著相關(guān)(>0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.635。

表5 CD36基因mRNA表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)分析Table 5 Correlation analysis of CD36 gene mRNA expression and IMF content

3 討 論

3.1 CD36基因多態(tài)性分析

CD36作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，在肝臟、肌肉及脂肪組織中介導(dǎo)LCFA的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，并介導(dǎo)氧化ox-LDL在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞的攝取。近年來(lái)，對(duì)36的研究多集中于人類的疾病上，36基因多態(tài)性與體內(nèi)脂代謝相關(guān)，是胰島素抵抗、代謝綜合征、脂代謝紊亂、左心室肥大等疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。丁法明等研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈硬化心臟病與36基因多態(tài)性存在相關(guān)性，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化心臟病發(fā)病的遺傳因素。以上研究表明這些疾病的發(fā)生均與36相關(guān)，是由于36調(diào)控的脂質(zhì)代謝發(fā)生了紊亂，從而導(dǎo)致了代謝疾病的發(fā)生。因而很多學(xué)者考慮36基因可能是這些代謝疾病的潛在治療靶點(diǎn)。李萬(wàn)貴等研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃谷鴨36基因第九外顯子中存在1個(gè)SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)對(duì)優(yōu)質(zhì)低脂肪鴨品種的選育具有重要意義；張松研究發(fā)現(xiàn)，36基因存在4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，并且這些位點(diǎn)和肉用性能具有很大的關(guān)聯(lián)性，尤其是對(duì)肌內(nèi)脂肪含量影響顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，36基因第9外顯子在83 125 bp處發(fā)生T/C突變，具有和2種基因型，其中優(yōu)勢(shì)等位基因和優(yōu)勢(shì)基因型分別為T(mén)(0.96)和TT(0.92)。通過(guò)2種基因型與早勝牛肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，基因型在宰前活重、胴體重、肌內(nèi)脂肪都顯著高于TT的基因型，說(shuō)明在早勝牛36基因中，由突變產(chǎn)生的C等位基因是提高早勝牛宰前活重、胴體重、肌內(nèi)脂肪的優(yōu)勢(shì)基因，而基因型的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于TT型，說(shuō)明基因型有可能在早勝牛脂肪酸代謝調(diào)控中起關(guān)鍵作用。本次試驗(yàn)只發(fā)現(xiàn)了和2種基因型，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因型，可能與試驗(yàn)樣本量有關(guān)，下次試驗(yàn)應(yīng)加大樣本量；基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，但是為雜合子，在實(shí)踐選育時(shí)應(yīng)輔于后裔測(cè)定，綜合評(píng)價(jià)基因型早勝牛的生產(chǎn)性能是否存在穩(wěn)定性。肌內(nèi)脂肪是影響牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，與肉的嫩度、系水力存在相關(guān)性，是影響肉品質(zhì)風(fēng)味的主要物質(zhì)。因此，36基因的多態(tài)性對(duì)早勝牛的肉品性狀存在顯著影響，T83125C位點(diǎn)可作為早勝牛肉用性狀分子標(biāo)記位點(diǎn)，36基因可作為早勝牛肌內(nèi)脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因。

3.2 CD36基因組織表達(dá)規(guī)律

CD36作為一種膜蛋白，對(duì)細(xì)胞LCFAs的攝取有重要的作用，可以介導(dǎo)多種細(xì)胞類型(如單核細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞)從細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的循環(huán)和轉(zhuǎn)運(yùn)中攝取游離脂肪酸(FFA)。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏36的小鼠其骨骼肌和脂肪組織對(duì)脂肪酸的攝取和利用存在缺陷。36介導(dǎo)的脂肪酸過(guò)量攝取在脂肪肝變性中起重要作用。36在正常肝組織中表達(dá)量很低，但在高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠和人非酒精性脂肪肝(NAFLD)的肝組織中表達(dá)量顯著升高。陳欣等研究指出，脂肪和膽固醇含量高的飼料能夠引起貴州小型豬的脂質(zhì)代謝紊亂，并且可使肝組織、胸主動(dòng)脈和腎臟組織的36表達(dá)上調(diào)。36在存儲(chǔ)中性脂質(zhì)的脂肪組織以及以脂肪酸為能量生產(chǎn)底物的心臟和骨骼肌中高度表達(dá)，而在肝臟中不表達(dá)或表達(dá)極低。廖紅海報(bào)道，36基因在山羊心臟中mRNA的表達(dá)量最低，背最長(zhǎng)肌次之、肝臟較高；王單單對(duì)櫻桃谷鴨研究表明，36基因mRNA在脂代謝旺盛的組織皮脂、腹脂或肝臟中表達(dá)量較高,mRNA表達(dá)均對(duì)血清脂質(zhì)指標(biāo)有顯著效應(yīng),說(shuō)明36基因可能調(diào)控肉鴨脂質(zhì)的沉積。以上研究顯示36基因在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)會(huì)隨著脂肪水平的變化而不同，在脂肪含量高的組織其表達(dá)量會(huì)相對(duì)較高，說(shuō)明其可能對(duì)機(jī)體的脂肪代謝起調(diào)節(jié)作用。有研究指出，劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉的收縮會(huì)引起36、FABP 和FATP 從內(nèi)體快速轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，促進(jìn)脂肪酸的大量攝入以供能量代謝的需要，提高CD36的表達(dá)水平。Astorino等研究顯示，對(duì)機(jī)體進(jìn)行高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練或增加訓(xùn)練量會(huì)提高36的蛋白表達(dá)水平。Rocha-Rodrigues等研究顯示耐力訓(xùn)練可以增加高脂飲食大鼠的36、線粒體復(fù)合物IV和V亞基的含量。由此可知，運(yùn)動(dòng)、鍛煉、電刺激等因素可以促進(jìn)機(jī)體脂肪酸的代謝，從而提高36的表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示，36基因在早勝牛的4個(gè)組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平由高到低依次為心臟、腿肌、背最長(zhǎng)肌和肝臟，心臟、腿肌和背最長(zhǎng)肌中的mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異(>0.05)，但心臟的mRNA表達(dá)量顯著高于肝臟(<0.05)，這與上述文獻(xiàn)所呈現(xiàn)規(guī)律基本一致。心臟、腿肌mRNA表達(dá)量高于背最長(zhǎng)肌可能是由于在日常生活中，早勝牛腿部活動(dòng)較多，使心臟和腿部肌肉受到刺激較大，從而使得脂肪酸大量攝入以供能量代謝需要，提高了36的表達(dá)量。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)早勝牛背最長(zhǎng)肌中的36基因mRNA 表達(dá)量與IMF含量呈顯著相關(guān)(<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.855，說(shuō)明36基因可能參與早勝牛的脂肪代謝，在不同組織部位其表達(dá)量存在差異，可作為肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。

4 結(jié) 論

早勝牛36基因第9外顯子g.83125處發(fā)生T/C突變，表現(xiàn)為和2種基因型，該位點(diǎn)與早勝牛的宰前活重、胴體重、肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)。36基因在不同組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平由高到低依次為心臟、腿肌、背最長(zhǎng)肌和肝臟，背最長(zhǎng)肌中的36基因mRNA 表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)。認(rèn)為36基因T83125C位點(diǎn)可作為早勝牛肉用性能分子標(biāo)記位點(diǎn)，36基因可作為早勝牛肌內(nèi)脂肪沉積和肉用性能的候選基因。